Summary
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации как побудить кластерных устьиц в семядоли Arabidopsis thaliana саженцев погружения лечение с раствором сахара содержащих средних и как соблюдать внутриклеточных структур, таких как хлоропласты и микротрубочек в кластерных гвардии ячейки, используя Конфокальная лазерная микроскопия.
Abstract
Устьичного движение опосредует завод газового обмена, которая необходима для фотосинтеза и транспирации. Устьиц открытия и закрытия достигнуто значительное увеличение и уменьшение объема клетки гвардии, соответственно. Потому что трансфер транспорт ионов и воды происходит между гвардии клетки и крупных соседних клеток эпидермиса во время движения устьиц, расположенными распределение растений устьиц считается оптимальное распределение для устьичной движения. Экспериментальные системы нарушается расположенными шаблон устьиц полезно изучить шаблон интервалы значимости. Были определены несколько ключевых генов, связанных с расположенными устьичного распределением, и кластерный устьиц можно экспериментально вызванных изменения этих генов. В качестве альтернативы кластерных устьиц может быть также вызвана экзогенных лечения без генетических изменений. В этой статье мы описываем простой индукционной системы для кластерных устьиц в проростках Arabidopsis thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Наш метод легко и непосредственно применимо к трансгенных или мутантных линий. Хлоропластов больше представлены в качестве отличительной биологических клеток сахарозы индуцированной кластерных гвардии клеток. Кроме того представитель конфокальный микроскопических изображений корковых микротрубочек показано как пример внутриклеточных наблюдения кластерных гвардии клеток. В кластерных гвардии клетки как интервал гвардии клеток в условиях управления поддерживается радиальные ориентации корковых микротрубочек.
Introduction
Стома завод является важным органом для газового обмена для фотосинтеза и транспирации, и устьичного движение сопровождается значительные изменения в клетках гвардии через Ион driven поглощения и выпуска воды. Под микроскопом мы можем наблюдать расположенными распределение устьиц на поверхности листьев и стеблей. Считается, что этот интервал распределение устьиц помочь устьичного движение, которое регулируется обмен ионов и воды между гвардии клетки и соседних клеток эпидермиса1,2. Экспериментальный индукционной системы для кластерных устьиц полезны для расследования значение интервал распределения устьиц.
Сообщается, что пространственные кластеризации устьиц может быть вызвана генетической модификации ключевых генов для дифференциации клеток гвардии3,4 или лечение с химического соединения5. Мы также сообщали, что лечение погружения с раствором средних дополнена включая сахарозы, глюкозы, сахара и фруктоза устьичного кластеризации в семядоли Arabidopsis thaliana саженцы6. Снижение callose в новой стены клетки, разделение meristemoids и эпидермальных клеток наблюдалось в сахарозы лечение Семядоля эпидермиса, предполагая, что лечение погружения раствора сахарозы отрицательно сказывается на клеточной стенки, который предотвращает утечку и Внематочная действий ключевых генов продуктов для дифференцировки клеток гвардии (например , факторы транскрипции) направлении прилегающих эпидермальных клеток6. Аналогичный механизм было предложено от исследований по gsl8/Чор мутантов7,8. Наша экспериментальная система для воспроизводимых индукции кластерных устьиц, используя сахарозу содержащих средних решение довольно легко и дешево. Он может также использоваться для изучения внутриклеточных структур, таких как органеллы и Цитоскелет в кластерных гвардии клеток при применении к трансгенных линий, выражая флуоресцентные маркеры что лейбл внутриклеточных структур9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка решение средних 1/2 фотосинтетическую Скуг сахарозы содержащие 3%
- Добавьте 1.1 g фотосинтетическую Скуг средних солей и 15 г сахарозы в стакан.
- Добавить 490 мл дистиллированной воды и перемешать хорошо с помощью бар stir.
- Отрегулируйте пэ-аш до 5,8, используя Кох.
- Разбавляют до 500 мл дистиллированной водой и передача решения в средних бутылку.
- Стерилизация автоклавированием (121 ° C, 20 мин) решение. Если не используется сразу, это решение может храниться при температуре 4 ° C после стерилизации.
2. индукция кластерных устьиц, содержащих сахарозу решение средних погружения лечение
- Стерилизуйте семена.
- Приготовляют раствор стерилизации, добавив 500 мкл 5% активного хлора раствора NaClO и 1 мкл 10% Тритон X-100 до 500 мкл стерильной водой.
- Место ОК. 50 трансгенных семян A. thaliana ношение флуоресцентные маркер например CT-GFP11 или GFP-TUB612 в 1,5 мл.
- Добавьте 1 мл 70% этанола раствор и перемешать хорошо, инвертирование пять раз. Оставьте на 1 мин.
- Семена будут опускаться на дно трубки. На лавочке чистой аккуратно удалить 70% этанол, с использованием микропипеткой и добавить 1 мл раствора стерилизации. Смесь хорошо, инвертирование пять раз и оставить на 5 мин.
- Вымойте семена. Все еще работает в асептических условиях на лавочке чистой, аккуратно удалить решения с помощью микропипеткой и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг пять раз.
- Добавьте 1,5 мл раствора стерилизованные 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних в каждой скважине 24-ну плиты на лавочке чистой.
- Добавьте два стерилизованные семена в каждой скважине. Лентой крышку на 24-ну пластину, используя два слоя парафина.
- Передать набор рост палата на 23,5 ° C 24-ну пластины с 12/12-ч цикла свето тени, используя 100 мкмоль m−2 s−1 белый свет и инкубировать в течение 14 дней.
3. микроскопические наблюдения кластерных устьиц
- Место 30 мкл 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних раствора из скважины пластину 24-Ну на центр на стеклянное скольжение (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
- Удаление Семядоля из 14-дневных Рассада рассечения ножницами. Поплавок Семядоля наблюдения стороной вверх на падение решения.
- Подготовка образца Семядоля согласно нашего предыдущего метода13. По сути, место 30 мкл раствора в центре крышки стекла (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0,17 мм). Стекло покровное перевернуть вверх дном и поместите его на Семядоля осторожно. Вытрите избыток буфер с помощью безворсовой ткани.
- Установите образец на сцене конфокальный лазерный микроскоп и выберите кластерный гвардии клетки для наблюдения, используя яркие области освещения.
- Приобрести конфокальный изображения дневно помечены внутриклеточных структур согласно инструкциям производителя Микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь был представлен протокол для простой способ заставить устьичного кластеризации раствором сахарозы содержащих средних в A. thaliana. Кластерный гвардии клетки, выращенных в решение средних содержащих сахарозу (рис. 1Б) имеют большие хлоропластов чем охранник клетки, выращенных в условиях свободной сахарозы управления (рис. 1А). Расширение хлоропластов было подтверждено с КТ-GFP11, маркер строме хлоропластов и хлорофилл аутофлюоресценция (рис. 1C-F), предполагая, что сахароза лечения привели к крахмала зерна накопление в Хлоропласты через сахарозы решение поглощения. Кроме того конфокальная наблюдения GFP-TUB612 показали, что корковых микротрубочек радиально ориентированной даже в сахарозы лечение кластерных гвардии клетки, как те в интервал гвардии клеток в условиях свободной сахарозы управления (рис. 2). Эти наблюдения предполагают, что сахароза индуцированной кластерных гвардии клетки имеют нормальное ориентации для корковой микротрубочки и microfibrils целлюлозы для включения устьиц открытия в ответ на экологические сигналы9.
Рисунок 1 : Хлоропластов в кластерных гвардии клеток лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Яркие области (A, B), маркер строме хлоропластов CT-GFP (C, D)и хлорофилл аутофлюоресценция (E, F) изображения гвардии клеток, выращенные в условиях сахарозы условий (A, C, E) и 3% сахара управления (B, D, F). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Корковых микротрубочек в кластерных гвардии клеток лечение раствором сахарозы. Корковых микротрубочек, помечены GFP-TUB6 guard cells в сахара управления (A) и кластерных гвардии клеток в 3% сахарозы условия (B). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили протоколы для индукции кластерных устьиц в A. thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Как показано здесь, этот метод очень прост и не требует специальных навыков, но может эффективно стимулировать кластерных устьиц. Более 45% клеток гвардии, объединяются с 3% сахарозы содержащих решение средних (средние значения более чем 20 независимых наблюдений)6. Кроме того эта экспериментальная система может непосредственно применяться к трансгенных или мутантных линий как показано для трансгенных линий, выражая CT-GFP (рис. 1) или GFP-TUB6 (рис. 2). Хотя только снимок изображения показаны здесь, также представляется возможным выполнять время последовательного наблюдения во время устьичного развития.
Обратите внимание, что этот метод основан на искусственных периферийной лечения, поэтому мы не можем исключать возможность того, что явления, которые не связаны непосредственно с устьичного распределения вызванных лечение погружения раствора сахарозы. В самом деле гвардии клетки хлоропласты увеличены на лечение (рис. 1). Это может быть из-за накопления зерно крахмала в хлоропластах через сахарозы решение поглощения. Кроме того было отмечено меньше устьичное отверстие сахарозы индуцированной кластерных гвардии клетки9, предполагая, что сахароза опосредованной гиперосмотических стресс подавлены устьиц открытия. Тем не менее радиальные ориентации корковых микротрубочек сохранялся (рис. 2). Кроме того устьичного диафрагмы кластерного гвардии клеток значительно увеличивается в ответ на фузикокцину лечение, как и в случае интервал устьиц9. Таким образом хотя он будет необходимо тщательно судить ли эта экспериментальная модель система удобна в зависимости от ваших целей исследования, наша система предоставит глубокую информацию о взаимосвязи между распределением устьиц и ответ.
Как уже упоминалось во введении, лечение сахарного раствора может уменьшить клеточной стенки целостность, что приводит к утечки продуктов ключевых генов для устьичной дифференциации (например , факторы транскрипции) соседних клеток эпидермиса. Мы предполагаем, что сахароза индуцированной внематочная локализации продуктов этих генов вызывает кластерных устьиц. Однако эта Рабочая гипотеза не поддерживается достаточно молекулярные биологические доказательства. Скрининг сахара нечувствительным мутантов бы перспективным способом уточнить молекулярные механизмы лежащие в основе сахара решения индуцированной устьичного кластеризации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны профессор Сеичиро Hasezawa за его любезную поддержку нашей работы. Эта работа была поддержана грантов от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHgrant насчитывает 17K 19380 и 18 H 05492, от Sumitomo фонда на грант для основных исследовательских проектов науки номер 160146 и Canon фонд предоставить т.х. Эта экспериментальная система была разработана при финансовой поддержке от числа страниц JSP KAKENHgrant 26891006 к к. а. Мы благодарим Robbie Льюис, MSc, из группы Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования черновика рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
