Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر لتقييم إصابات الأمعاء الصغيرة والتكيف باستخدام نموذج الماوس من الغشاء المخاطي الناجم عن العلاج الكيميائي

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

هنا، نقدم بروتوكول ًا لإنشاء نقاط نهاية هامة وعلامات انتشار للإصابات المعوية الصغيرة والانتشار المفرط التعويضي باستخدام نموذج من التهاب المخاطية الناجم عن العلاج الكيميائي. نقوم بإظهار الكشف عن الخلايا المنتشرة باستخدام علامة محددة دورة الخلية واستخدام الوزن المعوي الصغير، وعمق سرداب، وارتفاع الزغب كنقاط نهاية.

Abstract

التكيف المعوي هو الآلية التعويضية الطبيعية التي تحدث عندما يتم فقدان الأمعاء بسبب الصدمة. الاستجابات التكيفية، مثل انتشار خلايا سرداب وزيادة امتصاص المغذيات، هي حاسمة في الانتعاش، ولكن سوء الفهم. إن فهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء الاستجابات التكيفية أمر بالغ الأهمية لتيسير تحديد المغذيات أو الأدوية لتعزيز التكيف. وقد وُصفت نُهج ونماذج مختلفة في جميع الكتابات، ولكن هناك حاجة إلى طريقة وصفية مفصلة لتنفيذ الإجراءات أساساً للحصول على بيانات قابلة للاستنساخ. هنا، نقوم بوصف طريقة لتقدير نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر من الإصابات المعوية الصغيرة وفرط الانتشار التعويضي باستخدام نموذج من التهاب المخاطية الناجم عن العلاج الكيميائي في الفئران. نقوم بإظهار الكشف عن الخلايا المنتشرة باستخدام علامة محددة دورة الخلية، وكذلك استخدام الوزن المعوي الصغير، وعمق سرداب، وارتفاع الزغب كنقاط نهاية. بعض الخطوات الحرجة ضمن الطريقة الموصوفة هي إزالة ووزن الأمعاء الدقيقة ونظام البرمجيات المعقدة إلى حد ما المقترحة لقياس هذه التقنية. ولهذه الأساليب مزايا أنها لا تستغرق وقتا طويلا، وأنها فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ والقياس.

Introduction

التكيف المعوي هو الآلية التعويضية الطبيعية التي تحدث عندما يتم فقدان الأمعاء بسبب المرض أو الجراحة1،2. بعد الصدمة، تخضع القناة الهضمية لاستجابة متكيفة مورفومترية ووظيفية، تتميز بانتشار خلايا سرداب وزيادة امتصاص المغذيات3. وهذه الخطوة حاسمة في الانتعاش، ولكنها غير مفهومة فهما جيدا. ركزت الدراسات التجريبية للاستجابة التكيفية المعوية على التغيرات التي تحدث بعد استئصال الأمعاء الدقيقة في الفئران والجرذان والخنازير، ولكن فهم الآلية الجزيئية وراء الاستجابة التكيفية في أنواع أخرى من الإصابات (على سبيل المثال، الكيميائية أو البكتيرية) أمر بالغ الأهمية لتسهيل تحديد المواد الغذائية أو الأدوية لتعزيز التكيف. من الناحية التجريبية، تم استخدام نهج مختلفة لوصف المؤشر الجزيئي والخلوي المعقد للأمراض المعوية الصغيرة، بما في ذلك تسجيل الأنسجة المرضية وقياس نتيجة الإصابة. وعلى الرغم من ذلك، فإن ما هو غائب عن المؤلفات هو وصف مفصل لكيفية تنفيذ الإجراءات اللازمة للحصول على بيانات قابلة للاستنساخ. عند تحديد العوامل التي تنطوي على التكيف، مثل هرمونات الأمعاء، ونموذج حيواني سهل ومنخفض التكلفة، واستنساخه له ما يبرره وهنا نقترح استخدام نموذج من التهاب المخاطية المعوية الناجم عن العلاج الكيميائي (CIM).

واحدة من أبسط ونقاط النهاية بالمعلومات جدا من كل من الإصابة والتكيف هو قياس كتلة الأمعاء الدقيقة (SI). ونحن نعلم أن السمة المميزة لداء المخاطية هو المبرمج من الخلايا المعوية، ضمور الزغب تعتمد على الوقت وانخفاض ميتوسيس. لذلك، فحص مورفولوجيا الأمعاء ذات الصلة للغاية في نماذج ما قبل السريرية4،5. في البشر، وانخفاض في citrulline البلازما، علامة على الخلايا المعوية تعمل، ويرتبط مع درجات السمية وعلامات التهابية6 بالإضافة إلى القدرة الاستيعابية7،مما يشير إلى أن هذه الأحماض الأمينية هي علامة حيوية ممتازة من الغشاء المخاطي. يمكن قياس Citrulline في كل من الفئران والفئران، وأظهرتارتباطات ممتازة مع طول الزغب 8، والبقاء على قيد الحياة سرداب9،والغشاء المخاطي الناجم عن الإشعاع10.

ميزة رئيسية لقياس citrulline البلازما هو القدرة على جمع القياسات المتكررة من أحد الحيوانات. ومع ذلك، يقتصر أخذ عينات الدم متعددة في الفئران على حجم الدم الكلي من 6 μL/g/week ويتطلب التخدير العام. وهذا للأسف يحد أيضا من استخدام قياسات سيترولين في الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن قياس citrulline يتطلب عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة11،12،وهو مكلف وتستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن مستويات سيترولين في الفئران ترتبط بشكل كبير مع وزن SI (p < 0.001) (البيانات غير المنشورة)، مما يجعل citrulline قياس مباشر يعكس كتلة الخلايا المعوية. حدّد إلى القياس من [س] وزن الحاجة للفأرة أن يكون ضحّيت ولذلك ما من يكرّس قياسات ضمن ال نفسه فأرة يمكن. ومع ذلك فإن الطريقة توفر إمكانية إجراء مجموعة متنوعة من تحليلات الأنسجة الأخرى الموجهة إلى مسألة البحث، ويمكن تصور أن هذه الحقائق يمكن أن تُوعزعن الاستخدام الإضافي للالحيوانات. ولذلك، نقترح استخدام وزن SI كعلامة حيوية سهلة ومنخفضة التكلفة وسريعة للإصابة والتكيف في الفئران. لضمان استنساخ والاختلاف التحليلي المقبول، يجب إزالة الأمعاء بعناية من الحيوان، مسح مع المالحة، أفرغت وجفت قبل وزنها. في هذه المقالة، نعرض بالضبط كيفية تنفيذ هذا الإجراء.

السمة المميزة الأخرى لداء المخاطية هو فقدان الخلايا المنتشرة في سرداب وفرط الانتشار التعويضي خلال الفترة التجديدية3. وقد استخدمت علامة الخلوية Ki67 في كثير من الأحيان لتحديد الخلايا التكاثرية السريعة عن طريق الكيمياء المناعية13. على الرغم من أن Ki67 هو علامة بسيطة من الانتشار، لديها ميل لعدم الدقة كما Ki67 موجود خلال جميع المراحل النشطة من دورة الخلية (G1، S، G2، و M)14. وضع العلامات المحددة أمر ضروري للكشف عن الخلايا المستنسخة، وهذا هو السبب في أننا نقترح في الموقع إدراج 5-برومو-2'-ديوكسيريدين (BrdU)، وهو نظير اصطناعي من الثيميدين، كما يقتصر إلى حد كبير على الخلايا المستنسخة في المرحلةS-15. يتم حقن BrdU في الحيوانات 150 دقيقة قبل التضحية ويمكن الكشف عن الخلايا في وقت لاحق مع الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة BrdU محددة. في هذه المقالة طريقة، ونحن تبين بالضبط كيفية قياس منطقة الخلايا المناعية BrdU داخل سرداب باستخدام برنامج صورة مجانية.

غالباً ما يتم دراسة التغيرات المورفولوجية والوظيفية في نماذج التهاب المخاطية المستحثة 5-FU، حيث يتم تقييم التكيف المعوي من خلال ارتفاع الزغب وعمق سرداب. خلال هذه الدراسة، وجدنا أنه خلال المرحلة الحادة من التهاب المخاطية، وهو ما يعادل مرحلة الإصابة، لا يرتبط الانتشار الذي يقاس بدمج BrdU بعمق سرداب. وعلى النقيض من ذلك، يرتبط عمق سرداب بشكل كبير مع الانتشار الذي شوهد في مرحلة إصلاح الغشاء المخاطي، بعد 3 إلى 5 أيام من الحث. وهذا يشير إلى أن المرحلة الحادة من التهاب المخاطية لا يمكن قياسها عن طريق عمق سرداب وحدها. نقترح أنه عند استخدام الانتشار كنقطة نهاية في المرحلة الحادة من الفئران الغشاء المخاطي، ينبغي أن يفضل استخدام BrdU التأسيس ولكن عند تكميم الانتشار في مرحلة لاحقة خلال مرحلة التجديد، عمق سرداب هو معقول بديل لتأسيس BrdU. وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف هذا النموذج بطريقة يمكن استخدامها من قبل جميع الباحثين، سواء في مجال الأورام ولكن خصوصا الباحثين غير مألوفة مع نماذج الإصابات المعوية.

ويمكن استخدام النموذج الموصوف للنماذج المحورة وراثيا ً وفقاً للاستجابة التكيفية باستخدام وزن الجسم ووزن SI وعمق سرداب كنقاط نهاية. على سبيل المثال، نبين هنا كيف استخدمنا نموذج 5-fluorouracil (5-FU) التهاب المخاطية المستحث في نموذج ضرب الخلوية مع إفراز L-الخلية غير كافية16. الجلوكاجون مثل الببتيد-1 (GLP-1) والببتيد مثل الجلوكاجون-2 (GLP-2) هي الهرمونات المعوية التي تفرز هات من الخلايا L الغدد الصماء المعوية استجابة لكمية الطعام17،18. ومن المسلم به GLP-2 كعامل مهم للشفاء المعوي، وتنظيم المبرمج المخاطي وتحسين وظيفة الحاجز من SI19،20،21،22. استناداً إلى المؤلفات، افترضنا أن الهرمونات الذاتية ضرورية للانتشار المفرط التعويضي الذي يحدث في الاستجابة التكيفية بعد الإصابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع الأساليب الموصوفة وفقاً للمبادئ التوجيهية للتشريعات الدانمركية التي تنظم التجارب على الحيوانات (1987). وأجريت دراسات بإذن من مفتشية التجارب الحيوانية الدانمركية (2013-15-2934-00833) واللجنة الأخلاقية المحلية.

ملاحظة: تم الحصول على الفئران الإناث C57BL/6J (~ 20-25 غرام) وإيواء ثمانية لكل قفص في معيار 12 ساعة ضوء، 12 ساعة دورة مظلمة مع حرية الوصول إلى المياه وتشاو القياسية. وتركت الحيوانات للتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل بدء التجارب.

1. تحريض الغشاء المخاطي باستخدام 5-فلوروراسيل

  1. الحصول على 5-فلوروراسيل (5-فو) في محلول 50 ملغ / مل.
  2. وزن وتسجيل وزن الجسم من الفئران. من وزن الجسم، حساب كمية 5-FU للحقن (على سبيل المثال، 400 ملغ / كغ).
  3. إعداد حقنة 1 مل متصلة إبرة 27 G × 30 مم وملء المحاقن مع الكمية المحسوبة من 5-FU للحقن.
  4. تقييد الماوس من قبل طريقة scruff. للقيام بذلك، والاستيلاء على قاعدة الذيل بيد واحدة ووضعها على سطح اصبع القدم التي تجتاح، مثل غطاء شريط الأسلاك. في حين وضع الذيل بيد واحدة، وعقد سكروف من الرقبة مع اليد الأخرى.
  5. وضع بقوة الجسم من الماوس عبر يد واحدة عن طريق تمديد السبابة والإبهام مرة أخرى قدر الإمكان. وضع الذيل بين أصابع هذه اليد نفسها لتأمين الماوس.
  6. مع الحفاظ على الماوس في قبضة ثابتة ولكن لطيف، وفضح الجانب البطني من الماوس وإدراج الإبرة في تجويف داخل المجلس اقابي على الربع الأيمن أو الأيسر السفلي من البطن. يستنشق لضمان التنسيب السليم وحقن 400 ملغ / كغ 5-FU.

2. جمع الأنسجة

  1. التخدير الماوس مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين / xylazine (100/10 ملغ / كغ) المخففة في محلول ملحي (0.9٪ NaCl). رصد عمق التخدير من خلال مراقبة رد الفعل سحب قرصة.
    ملاحظة: التخدير هو التخدير غير الانتعاش.
  2. تسجيل وزن الماوس التخدير.
  3. ضع الماوس في وضع السبين وإجراء استئصال البطن لفضح تجويف البطن، تليها شق في تجويف الصدر لإدخال استرواح الصدر.
  4. باستخدام مقص، التضحية الحيوان عن طريق قطع فتح الحجاب الحاجز.
  5. إزالة الأمعاء الدقيقة. قطع متفوقة على pylorus، وسحب بعناية الأمعاء الدقيقة بعيدا عن الذبيحة حتى يتم التوصل إلى cecum وجعل قطع قبل cecum.
  6. باستخدام ملقط، بلطف المشبك التجويف القريبة اغلاق. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25 G المرفقة، اغسل الأمعاء الدقيقة مع المالحة لإزالة البراز.
  7. إزالة بلطف المالحة من التجويف المعوي مع الأدوات الجراحية.
  8. ضع الأمعاء الدقيقة على ورق ة نشاف ة نظيفة لإزالة محلول ملحي زائد بعناية.
  9. تسجيل وزن الأنسجة المغسولة.
  10. حساب الوزن المعوي ة الصغيرة مسح كنسبة مئوية من وزن الجسم.

3. علم الأنسجة الأمعاء الدقيقة

  1. إعداد الأنسجة
    1. في غطاء الدخان، استخدم مقص لقطع 3 سم أقسام من الأنسجة المعوية مسح من كل فأر من الاثني عشر، جيجونوم والإيليوم وأقسام تثبيت في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الإصلاح 5-10 مرات من حجم الأنسجة.
    2. نقل الأنسجة الثابتة إلى لوحة القطع.
    3. باستخدام مشرط، تقليم الأنسجة إلى ما يقرب من 1 سم ونقل هافين شريط تضمين.
      ملاحظة: يجب وضع علامة على الكاسيت مع تعريف العينة (ID) في قلم رصاص.
    4. غمر الكاسيت في الإيثانول 70٪ وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  2. دمج الأنسجة في البارافين
    1. تجفيف الأنسجة عن طريق وضع في الحلول الكحولية تصاعدي. ضع الكاسيت في 70٪ الإيثانول لمدة ساعة واحدة، تليها 80٪ الإيثانول لمدة ساعة واحدة، 95٪ الإيثانول لمدة ساعة و 100٪ الإيثانول لمدة 1.5 ساعة.
    2. اغمر الكاسيت بشمع البارافين المدفأ بين 58-60 درجة مئوية. استخدام ملقط لوضع الأنسجة في اتجاه عرضي وترك كتل لتبريد أكثر من 24 ساعة حتى الصلبة.
  3. قطع الأنسجة باستخدام ميكروتومي
    1. كتلة المكان، وجه الأنسجة لأسفل على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. قطع المقاطع العرضية من كتلة الأنسجة بين 3-5 ميكرومتر، مما يجعل المقاطع العرضية من الاثني عشر، وجيجونوم واللفائفي.
    3. ضع شريط البارافين في حمام مائي يتراوح بين 40 و45 درجة مئوية. استخدم الملقط لفصل المقاطع.
    4. استخدام الشرائح المجهر لالتقاط المقاطع من الماء.
    5. الهواء يجف الشرائح لمدة 30 دقيقة قبل تلطيخ.
      ملاحظة: للتخزين على مدى فترة أطول من الوقت تخزين الشرائح في الثلاجة.
  4. ملطخة الهيماتوكسيلين-يوسين من الأنسجة
    1. وضع الشرائح المجهر في مهد الأنسجة. إزالة البارافيينize الشرائح في مجلس الوزراء التدفئة تعيين في 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: يجب ترك الشرائح مباشرة من الثلاجة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في خزانة التدفئة.
    2. في غطاء الدخان، إعادة ترطيب الأنسجة في 3تغييرات من وكيل المقاصة (جدول المواد)، وجعل 20 الانخفاضات في جرة وكيل المقاصة الأولى ومن ثم السماح لهم الوقوف لمدة 7-8 دقيقة في كل من اثنين من الجرار وكيل المقاصة إضافية. نقل الشرائح إلى حلول الكحول تنازلي، تبدأ مع 3 تغييرات من الإيثانول 99٪، تليها 2 التغييرات من الإيثانول 96٪ و 70٪ الإيثانول. جعل ما لا يقل عن 20 الانخفاضات في كل جرة. نقل إلى المياه الجارية والسماح للشرائح الوقوف لمدة 5 دقائق.
    3. تزج الشرائح في هيماتوإكسلين ماير المصفاة لمدة دقيقة واحدة.
    4. غسل العينات في مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق.
    5. اغمر المقاطع في بقعة eosin لمدة دقيقة أو دقيقتين، ثم اشطفها في ماء الصنبور.
    6. تجفيف الأنسجة عن طريق وضع في الحلول الكحولية تصاعدي. تبدأ مع 70٪ الإيثانول، تليها 96٪ الإيثانول، 96٪ الإيثانول، و 4 مرات 99٪ الإيثانول. جعل ما لا يقل عن 20 الانخفاضات في كل جرة، والسماح للمهد الوقوف في 99٪ الإيثانول حتى يتم تركيبها.
    7. قم بتركيب الأغطية عن طريق تطبيق كمية صغيرة من وسط التركيب على سطح الشرائح. وضع غطاء على رأس المتوسطة تصاعد دون خلق فقاعات تحت غطاء. دعيه يجف لمدة 24 ساعة.
    8. فحص الأنسجة باستخدام مجهر خفيف متصل بكاميرا للحصول على صور النسيجية. استخدام هدف 10X لالتقاط لقطات حتى يتم التوصل إلى تغطية كاملة من الشريحة الأنسجة.

4. قياس عمق سرداب و / أو ارتفاع الزغب

  1. تحميل وتثبيت برنامج التحليل (أي، زن لايت، جدولالمواد).
  2. افتح الصورة في البرنامج وقم بالاتصال بالكاميرا. التقاط لقطات في وضع الكاميرا مع هدف 20X.
  3. في وضع المعالجة، افتح اللقطة.
  4. لقياس عمق سرداب: في طريقة العرضثنائية الأبعاد، حدد أداة الخط من علامة التبويب الرسومات. كرر هذا الإجراء ل20 سرداب موجهة بشكل جيد (الشكلالتكميلي1).
  5. لقياس ارتفاع الزغب: في طريقة العرضثنائية الأبعاد، حدد أداة الخط من علامة التبويب الرسومات. كرر هذا الإجراء ل20 الزغب الموجهة بشكل جيد (الشكلالتكميلي1).
  6. قم بالتبديل من طريقة العرض 2D إلى طريقة العرض قياس لعرض القياسات.
  7. تصدير القياسات وحساب متوسط عمق سرداب وارتفاع الزغب.

5. BrdU القياس الكمي (الانتشار) عن طريق الكيمياء المناعية

  1. حقن محلول BrdU
    1. وزن وتسجيل وزن الجسم من الفئران.
    2. في غطاء الدخان، وإعداد كمية تمثيلية من 0.5٪ ث / ف بروموديوكسيريدين (BrdU) الحل في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
    3. في غطاء الدخان، حقن 50 ملغ / كغ من BrdU عن طريق الحقن داخل اقابية.
      ملاحظة: للتأكد من أن كل فأر يتم قتلها في 150 دقيقة بالضبط بعد حقن BrdU، حقن كل ماوس الفردية على التوالي مع فاصل زمني 10-20 دقيقة في ما بين من أجل أداء مجموعة الأنسجة بشكل صحيح.
    4. تسجيل وقت الحقن.
    5. انتظر 150 دقيقة، ثم قم بالتخدير للفئران وجمع الأنسجة كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.7. إجراء الكيمياء المناعية BrdU كما هو موضح في القسم 5.2.
  2. الكيمياء المناعية BrdU
    1. إعداد الأنسجة كما هو موضح في الخطوات 3-1-1-3-3-4.
    2. لاسترجاع مستضد، وضع مهد الشريحة مع المقاطع في جرة الأنسجة الزجاج وملء مع العازلة EDTA (pH 9) في فرن ميكروويف لمدة دقيقة واحدة في 750 W تليها 9 دقيقة في 350 W. تكرار دورة.
      ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة لا تجف، والتي قد تتطلب إضافة المزيد من العازلة إلى الجرار بين التدفئة.
    3. اغسل المقاطع 2-3 مرات في المخزن المؤقت للملح والبوليسوربات 20 (TBS-T) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    4. تطبيق 5 قطرات منكتلة بيروكسيد (جدول المواد) لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع نشاط بيروكسيداز الذاتية. اغسل المقاطع 2-3 مرات في المخزن المؤقت TBS-T لمدة 3 دقائق لكل منها.
    5. تطبيق 5 قطرات منكتلة القوارض العازلة (جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، لمنع ملزمة غير محددة. اغسل المقاطع 2-3 مرات في المخزن المؤقت TBS-T لمدة 3 دقائق لكل منها.
    6. احتضان المقاطع مع أحادية النسيلة ماوس المضادة لBrdU الأجسام المضادة المخففة 1:500 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل المقاطع 2-3 مرات في المخزن المؤقت TBS-T لمدة 3 دقائق لكل منها.
    7. تصور الإيجابية المناعية باستخدام 3،3'-diaminobenzidine (DAB) عن طريق تطبيق 5 قطرات من peroxidase الفجل على كل شريحة وحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل الأقسام إلى غطاء الدخان، إضافة 150 درجة مئوية من DAB وحضانة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع DAB والتخلص من النفايات بشكل مناسب.
    8. شطف المقاطع في الماء منزوع الأيونات.
    9. تجفيف الأنسجة وجبل غطاء كما هو موضح في الخطوتين 3-4-6 و 3-4-7.
  3. تصور ردود الفعل المناعية
    1. تصور عينة الأنسجة مع مجهر خفيف متصل بالكاميرا.
    2. استخدم برنامج التحليل للحصول على صور المجهر باستخدام هدف 20x من جميع الأقسام وحفظ الملفات في . تنسيق JPG.
    3. خذ لقطة من ميكرومتر المرحلة باستخدام هدف 20X، والتي سيتم استخدامها كأداة معايرة في برنامج ImageJ.
  4. قياس مساحة الخلايا المناعية التفاعلية BrdU
    1. تثبيت برنامج ImageJ (جدولالمواد).
    2. تعيين مقياس لصورة في ImageJ: فتح صورة ميكرومتر المرحلة باستخدام ملف ImageJ | افتح أمر القائمة. حدد أداة تحديد الخط المستقيم.
    3. حدد الأداة المستقيمة ورسم خط مستقيم على صورة ميكرومتر لتحديد مسافة معروفة.
    4. حدد تعيين مقياس ضمن القائمة تحليل.
    5. أدخل قيمة في المربع المسافة المعروفة وحدد وحدة الطول في المربع وحدة الطول. حدد عمومي بحيث تنطبق هذه المعايرة على كافة الصور التي يتم فتحها في جلسة عمل ImageJ هذه.
    6. افتح صورة مثيرة للاهتمام باستخدام ImageJ File | فتح الأمر القائمة لقياس مساحة الخلايا المناعية BrdU في سرداب.
    7. تعيين رسومات الألوان إلى 8 بت ضمن القائمة صورة/نوع.
    8. قم بزيادة تباين الصورة ضمن تباين العملية/التحسين وتعيين البيكسلات المشبعة إلى 0.4%.
    9. تطبيق عتبة على الصورة لتقسيم الإيجابية المناعية. حدد صورة / ضبط تحت القائمة، ثم عتبة وحدد اللون الأحمر (منطقة داكنة تظهر باللون الأحمر). اختر عتبة تتكون من حوالي 10-20% عن طريق تحريك شريط العتبة.
      ملاحظة: اختر عتبة تتضمن كافة الخلايا الموجبة BrdU مع أقل قدر ممكن من الخلفية. يجب تطبيق النسبة المئوية المختارة على كافة الأقسام.
    10. اختر سرداب ًا جيد التوجيه، أي سرداب كامل من الأنسجة السليمة، وحدد أداة اختيار اليد المجانية لوضع علامة على المنطقة المحيطة به.
    11. لقياس منطقة العتبة، حدد علامة التبويب تحليل، متبوعاً بتحليل الجسيمات. في نافذة تحليل الجسيمات، قم بتعيين الحجم إلى 20 إلى ما لا نهاية، انقر فوق وحدات البكسلالمربعة ، قم بتعيين التعميم إلى 0.00−1.00، وقم بتعيين إظهار للحدود العريضة. انقر فوق مربعات عرض النتائجوتلخيص وتضمين الثقوب.
      ملاحظة: يتم إنشاء قيم الخلايا الموجبة BrdU تلقائياً في إطار نتيجة إظهار القياسات الفردية لكل خلية موجبة BrdU. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاء نافذة ملخصة تلقائيًا، تبين عدد عمليات العد والمساحة الإجمالية ومتوسط الحجم والنسبة المئوية للمساحة ذات الخلايا الإيجابية BrdU.
    12. كرر الخطوتين 5.4.10 و 5.4.11 لقياس سرداب جديد. سيتم عرض نتائج كافة الأقبية المقاسة في إطار الملخص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في التجربة الأولى، تسببنا في وجود الغشاء المخاطي في الفئران في اليوم 0 وضحين بمجموعة من الفئران كل يوم لمدة 5 أيام متتالية. عند قياس وزن SI، وجدنا أن هذه المعلمة انخفضت من اليوم 2 حتى اليوم 4 مما يشير إلى فقدان في كتلة الخلايا المعوية. وجدنا أيضا أنه في اليوم 5، لم يكن وزن SI مختلفا ًبشكل كبير عن اليوم 0 (الفئران غير المعالجة) (الشكل 1). وقد أُلغي تقريباً الانتشار الذي يقاس بإدماج BrdU في اليوم الأول واليوم الثاني، ولكن في اليوم الرابع واليومالخامس كانت هناك زيادات في الانتشار بمقدار أربعة أضعاف وخمسة أضعاف تقريباً (الشكل 2). وقد تم توضيح هذا الانتشار المفرط أيضاعند قياس عمق سرداب (الشكل 3). ما لا يتضح من قياس عمق سرداب هو فقدان الخلايا المنتشرة في اليوم 1 واليوم 2، حيث تم تخفيض عمق سرداب بنسبة 13٪ تقريبا ولكن لم يكن مختلفا كثيرا عن الفئران السليمة. يمكننا أن نظهر أنه في المرحلة التجديدية من التهاب المخاطية كان هناك ارتباط قوي بين دمج BrdU وعمق سرداب، ولكن هذا لم يحسب للمرحلة الحادة مما يدل على أن عمق سرداب كنقطة نهاية قد لا تكون مناسبة في المرحلة الحادة من الغشاء المخاطي(الشكل4).

في الدراسة الثانية، فحصنا mucostis في نموذج الماوس المعدلة وراثيا لدينا مع إفراز الخلية L غير كافية. وأظهرت الفئران التي تعاني من نقص GLP-1 وGLP-2 خسارة حادة في وزن الجسم (BW) وانخفاض في وزن SI في مرحلة الانتعاش، وهو أمر بالغ الأهمية مقارنة بالنوع البري (WT) 5-FU الفئران (p < 0.01) (الشكل5A,B). وعلاوة على ذلك، لم تظهر الفئران المحورة وراثيا ً الانتشار المفرط التعويضي؛ كانت الأقبية أقصر بكثير مما كانت عليه في كل من الفئران WT والضوابط الصحية. وعلى العكس من ذلك، أظهرت فئران WT زيادة في عمق سرداب كعلامة على الانتشار المفرط (الشكل5C).

Figure 1
الشكل 1: الوزن المعوي الصغير. تم التضحية الفئران 1-5 أيام بعد حقن 5-FU في اليوم 0 وتم قياس وزن الأمعاء كما هو موضح. يتم عرض النتائج على أنها متوسط ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). n = 13. تم تعديل هذا الرقم من Hytting-Andreasen وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: خلايا BrdU المناعية في سرداب الاثني عشر، جيجونوم، واللفائفي من SI. تم التضحية الفئران 1-5 أيام بعد حقن 5-FU في اليوم 0 وتم قياس إدراج BrdU من قبل الكيمياء المناعية كما هو موضح. وتظهر النتائج على أنها متوسط ± SEM. n = 13. *p < 0.05, ***p < 0.001 مقارنة باليوم 0 (تحليل التباين [ANOVA] متبوعاً باختبار المقارنة المتعددة من Dunnett). p < 0.001 مقارنة باليوم 0 (ANOVA تليها Dunnett اختبار مقارنة متعددة). تم تعديل هذا الرقم من Hytting-Andreasen وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس عمق السرداب. تم التضحية الفئران 1-5 أيام بعد حقن 5-FU في اليوم 0 وتم قياس عمق سرداب كما هو موضح. وتظهر النتائج على أنها متوسط ± SEM. n = 13. *p < 0.05, ***p < 0.001 مقارنة باليوم 0 (ANOVA متبوعاً باختبار المقارنة المتعددة من Dunnett). تم تعديل هذا الرقم من Hytting-Andreasen وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ارتباط عمق سرداب وBrdU. يرتبط عمق سرداب (في الاثني عشر، جيجونوم، والإيليوم) إلى دمج BrdU في كل يوم من التضحية باستخدام اختبار ارتباط بيرسون ذي الذيلين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تفشل الفئران الناقصة GLP-1 وGLP-2 في التجدد بعد التهاب المخاطية الحاد. (أ) التغير في وزن الجسم (٪)، (B) SI الوزن (ز)، و (C) عمق سرداب في اللفائفي (ميكرومتر). وتظهر النتائج على أنها تعني ± SEM. Tg = الفئران المعدلة وراثيا؛ WT = الفئران من النوع البري؛ 5-FU = 5-فلوروراسيل. n = 4−8. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; مقارنة بالتحكم الصحي (WT saline), a = p < 0.05, aa = p < 0.01, aaa = p < 0.001 مقارنة مع WT 5-FU (ANOVA ثنائي الاتجاه تليها بونفيروني اختبار مقارنة متعددة [BW] أو ANOVA تليها Dunnett على الاختبار). تم تعديل هذا الرقم من Hytting-Andreasen وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الأنسجة المعوية الصغيرة قبل تحريض الغشاء المخاطي ، خلال المرحلة الحادة ومرحلة التعافي من التهابالمخاطية . (أ) هايموتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ و (D) BrdU تلطيخ في الفئران غير المعالجة. الخط الأسود المنقط في اللوحة A يجسد سرداب ذو توجه جيد، في حين أن الخط الأخضر المنقط يدل على زغب موجه بشكل جيد. (B) H & E تلطيخ و (ه) BrdU تلطيخ خلال المرحلة الحادة من التهاب المخاطية. (C) H & E تلطيخ و (F) BrdU تلطيخ خلال مرحلة الانتعاش بعد تحريض الغشاء المخاطي. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نقوم بتوضيح طريقة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة إصابة SI وتجديدها في نموذج الماوس. توجد مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية قبل السريرية من الإصابة المعوية، ولكن من الحيوي أن نفهم أن كل نموذج فريد من نوعه وأن نقاط النهاية يجب أن تكون مناسبة للإجابة على سؤال البحث. هذا النموذج ممتاز لدراسة الاستجابة التكيفية للإصابة، ولكن يجب تعديل نقاط النهاية عند استخدام النموذج كنموذج ما قبل السريرية من الغشاء المخاطي. ومع ذلك، فإن الترجمة من النماذج الحيوانية إلى المرضى تشكل تحدياً 23. وينبغي أن تقتصر نقاط النهاية المقترحة لوزن SI وانتشارها على دراسة الاستجابة التكيفية فقط. دراسة العوامل الذاتية غالبا ما يتطلب استخدام الفئران المعدلة وراثيا، وحتى لو كان استئصال الأمعاء الدقيقة ممكن في الفئران1، وهذا النموذج يمكن أن يكون بديلا لتجنب الوفيات بعد الجراحة. عند تطبيق هذا النموذج على الفئران المعدلة وراثيا, من المهم لمشاهدة الفئران بعناية ورصد وزنها كل يوم. خلال هذه الدراسة، شهدت بعض الفئران فقدان الوزن تصل إلى 30٪، وهو أمر كبير جدا. لتجنب ارتفاع معدل الوفيات في الأنماط الظاهرية الحساسة، نقترح إجراء دراسات تجريبية في الفئران المعدلة وراثيا، حيث قد يكون من الضروري تعديل الجرعة.

خطوة حاسمة ضمن الأسلوب الموصوف هو إزالة ووزن SI. من المهم أن يتم الإزالة والمعالجة بنفس الطريقة ومن قبل نفس الباحث في كل مرة لتجنب الاختلافات الكبيرة بين التبذير.

من المهم اتساق اختيار سرداب وزغب لتجنب التباين والتحيز عند قياس عمق سرداب وارتفاع الزغب. عند تضمين الأنسجة في البارافين، يتم وضع الأمعاء في وضع مستقيم لإجراء تخفيضات عرضية، وبالتالي زيادة إمكانية الزغب السليم وسرداب. بعد قطع الأنسجة، يتم اختيار سرداب موجه ة و/أو زغب. ويستند الاختيار على التصور الكامل للسرداب كله والزغب في نفس الطائرة ووجود حدود واضحة من الخلايا داخل سرداب وvillus. ويتمثل أحد القيود المفروضة على هذه الطريقة في النهج الذاتي إلى حد ما عند اختيار سرداب ذي توجه جيد لأن اختيار سرداب و/أو زغب جيد المنحى يتم بعد قطع الأنسجة. وقد قدمت دراسة سابقة24 طريقة بديلة للتغلب على هذا القيد، حيث أنها تستخدم قسم الميكروديسة. في هذه الطريقة، يتم اختيار الزغب وسرداب أثناء مراقبة تحت المجهر، قبل قطع الأنسجة، مما يجعل من الممكن لضمان أن يتم تشريح سرداب سليمة والزغب من الأنسجة.

على النقيض من الأساليب السابقة المستخدمة لكمية BrdU الخلايا الإيجابية25،26، يصف هذا البروتوكول منطقة الخلايا الإيجابية BrdU لكل سرداب ، والذي يوفر طريقة سريعة لتكميم الخلايا التكاثرية داخل كل سرداب. غير أن هذه التقنية قد تكون تقييدية إلى حد ما لأنها تتطلب معرفة أعمق بالبرمجيات المقترحة لقياس هذه التقنية. ويمكن أن يكون التطبيق المستقبلي لهذا البروتوكول هو إنشاء طريقة أكثر تلقائية تم إنشاؤها لتحديد وقياس الخلايا الإيجابية BrdU.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة غير مقيدة من مركز نوفو نورديسك للبحوث الأيضية الأساسية ومؤسسة لوندبيك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 147، إصابة معوية صغيرة، علامات التكاثر، BrdU، عمق سرداب، ارتفاع الزغب، فرط الانتشار التعويضي
نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر لتقييم إصابات الأمعاء الصغيرة والتكيف باستخدام نموذج الماوس من الغشاء المخاطي الناجم عن العلاج الكيميائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter