Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att fastställa viktiga endpoints och proliferativa markörer för liten tarm skada och kompenserande hyperproliferation med hjälp av en modell av kemoterapi-inducerad mukosit. Vi visar upptäckten av prolifererande celler med hjälp av en cell cykel specifik markör och använda liten intestinal vikt, Crypt djup, och moderkaksprov höjd som endpoints.
Abstract
Intestinal anpassning är den naturliga kompenserande mekanism som uppstår när tarmen går förlorad på grund av trauma. Den adaptiva svar, såsom crypt cell proliferation och ökad näringsämne absorption, är avgörande för återhämtning, men dåligt förstått. Att förstå den molekylära mekanismen bakom de adaptiva svaren är avgörande för att underlätta identifieringen av näringsämnen eller läkemedel för att förbättra anpassningen. Olika tillvägagångssätt och modeller har beskrivits i hela litteraturen, men ett detaljerat beskrivande sätt att i huvudsak utföra de förfaranden som behövs för att få reproducerbara data. Här beskriver vi en metod för att uppskatta viktiga endpoints och proliferativa markörer för liten tarm skada och kompensatorisk hyperproliferation med hjälp av en modell av kemoterapiinducerad mukosit hos möss. Vi visar upptäckten av prolifererande celler med hjälp av en cell cykel specifik markör, samt att använda liten intestinal vikt, Crypt djup, och moderkaksprov höjd som endpoints. Några av de kritiska stegen inom den beskrivna metoden är avlägsnande och vägning av tunntarmen och den ganska komplexa mjukvarusystem föreslås för mätning av denna teknik. Dessa metoder har de fördelar som de inte är tidskrävande, och att de är kostnadseffektiva och lätta att utföra och mäta.
Introduction
Intestinal anpassning är den naturliga kompenserande mekanism som uppstår när tarmen går förlorad på grund av sjukdom eller kirurgi1,2. Efter trauma genomgår tarmen en morphometrisk och funktionell adaptiv respons, som kännetecknas av crypt cell proliferation och ökad näringsämne absorption3. Detta steg är avgörande för återhämtning, men ändå dåligt förstådd. Experimentella studier av intestinal adaptiv respons har fokuserat på de förändringar som sker efter tunntarm resektion hos möss, råttor och svin, men att förstå den molekylära mekanismen bakom det adaptiva svaret i andra typer av skador (t. ex. kemisk eller bakteriell) är avgörande för att underlätta identifieringen av näringsämnen eller läkemedel för att förbättra anpassningen. Experimentellt, olika metoder har använts för att beskriva det komplexa molekylära och cellulära indexet för små tarm patologi, inklusive histopatologisk scoring och mäta resultatet av skadan. Trots detta är vad som saknas i litteraturen en detaljerad beskrivning av hur man utför de procedurer som behövs för att få reproducerbara data. När identifiera faktorer som är involverade i anpassningen, såsom Gut hormoner, en enkel, låg kostnad, och reproducerbara djurmodell är motiverad och här föreslår vi att du använder en modell av kemoterapi-inducerad intestinal mukosit (CIM).
En av de enklaste och mycket informativa endpoints av både skada och anpassning är att mäta massan av tunntarmen (SI). Vi vet att ett kännetecken för mukosit är apoptos av enterocyter, tidsberoende moderkaksprov atrofi och minskad Mitos. Därför är det mycket relevant att undersöka tarmmorfologin i prekliniska modeller4,5. Hos människa, en nedgång i plasmacitrullin, en markör för fungerande enterocyter, korrelerar med toxicitet betyg och inflammatoriska markörer6 utöver absorptionsförmåga7, vilket tyder på denna aminosyra är en utmärkt biomarkör av mukosit. Citrullin kan mätas i både möss och råttor, och har visat utmärkta korrelationer med moderkaksprov längd8, Crypt Survival9, och strålningsinducerad mukosit10.
En stor fördel med att mäta plasma citrullin är förmågan att samla in upprepade mätningar från ett djur. Emellertid, flera blodprov i möss är begränsad till en total blodvolym på 6 μL/g/vecka och kräver allmän anestesi. Detta begränsar tyvärr också användningen av citrullin mätningar i möss. Dessutom kräver mätningen av citrullin högeffektiv vätskekromatografi11,12, vilket är kostsamt och tidskrävande. Nyligen visade vi att citrullin nivåer hos möss korrelerar signifikant med SI vikt (p < 0,001) (opublicerade data), vilket gör citrullin en direkt mätning reflekterande enterocyte massa. En begränsning till mätningen av SI väger är nödvändigheten för mössen som ska offras, och thus inga upprepade mätningar inom den samma musen är möjligheten. Fortfarande metoden ger möjlighet att utföra en mängd andra vävnads analyser riktade till forskningsfrågan, och dessa fakta kan tänkas kompensera för den ytterligare användningen av djur. Vi föreslår därför att använda SI vikt som en enkel, låg kostnad, och snabb biomarkör för skador och anpassning hos möss. För att säkerställa reproducerbarhet och godtagbar analytisk variation bör tarmarna noga avlägsnas från djuret, spolas med saltlösning, tömmas och torkas före vägning. I den här artikeln visar vi exakt hur den här proceduren utförs.
Ett annat kännetecken för mukosit är förlusten av de prolifererande cellerna i kryptor och en kompenserande hyperproliferation under regenerativ period3. Den cellulära markör Ki67 har ofta används för att bestämma snabba proliferativa celler med hjälp av immunohistokemi13. Även om Ki67 är en enkel markör för spridning, den har en tendens till inexaktheter som Ki67 är närvarande under alla aktiva faser av cellcykeln (G1, S, G2, och M)14. Särskild märkning är nödvändig för att detektera replikerande celler, varför vi föreslår in situ inkorporering av 5-Bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU), en syntetisk analog av tymidin, eftersom det är till stor del begränsad till att replikera celler i S-fas15. BrdU injiceras i djuren 150 minuter före avkall och celler kan därefter upptäckas med immunohistokemi med hjälp av BrdU-specifika antikroppar. I denna metod artikel, visar vi exakt hur man mäter området av BrdU immunpositiva celler inom en krypta med hjälp av en fri bildprogram vara.
Morfologiska och funktionella förändringar studeras ofta i 5-FU inducerad mukosit modeller, där intestinal anpassningen bedöms av moderkaksprov höjd och crypt djup. Under denna studie fann vi att under den akuta fasen av mukosit, vilket är lika med skade fasen, proliferation mätt med BrdU inkorporering är inte korrelerad med crypt djup. I motsats till detta, Crypt djup är signifikant korrelerad med proliferation ses i reparationsfasen av mukosit, 3 till 5 dagar efter induktion. Detta tyder på att den akuta fasen av mukosit inte är mätbara av crypt djup ensam. Vi föreslår att vid användning av proliferation som en Endpoint i den akuta fasen av mukosit möss, BrdU inkorporering bör helst användas men när kvantitera hyperproliferation i senare skede under regenerativ fas, Crypt djup är en rimlig alternativ till BrdU-inkorporering. Målet med denna studie var att beskriva denna modell på ett sätt som den kan användas av alla forskare, både inom onkologi men framförallt forskare som inte är bekanta med tarm skade modeller.
Den beskrivna modellen kan användas för att fenotyp transgena modeller enligt den adaptiva svar med hjälp av kroppsvikt, SI vikt och crypt djup som endpoints. Som ett exempel visar vi här hur vi använde modellen av 5-fluorouracil (5-FU) inducerad mukosit i en cellulär knock out-modell med otillräcklig L-cells sekretion16. Glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) och glukagon-liknande peptid-2 (GLP-2) är intestinala hormoner som utsöndras från de enteroendokrina L-celler som svar på födointag17,18. GLP-2 är erkänd som en viktig faktor för intestinal healing, regleringen av slemhinnor apoptos och förbättring av barriärfunktion av Si19,20,21,22. Baserat på litteraturen, vi hypotesen att endogena hormoner är nödvändiga för kompenserande hyperproliferation inträffar i adaptiv respons efter skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna metoder genomfördes i enlighet med riktlinjerna i dansk lagstiftning om djurförsök (1987). Studierna utfördes med tillstånd från den danska Animal experiment Inspectorate (2013-15-2934-00833) och den lokala etiska kommittén.
Anmärkning: kvinnliga C57BL/6J möss (~ 20 − 25 g) erhölls och inrymt åtta per bur i standard 12 h ljus, 12 h mörk cykel med fri tillgång till vatten och standard Chow. Djuren lämnades att acklimatisera sig en vecka innan experiment började.
1. induktion av mukosit med 5-fluorouracil
- Få 5-fluorouracil (5-FU) i en 50 mg/mL lösning.
- Väg och registrera mössen kroppsvikt. Från kroppsvikten, beräkna mängden 5-FU för injektion (t. ex. 400 mg/kg).
- Bered en 1 mL spruta ansluten till en 27 G x 30 mm nål och Fyll sprutan med den beräknade mängden 5-FU för injektion.
- Begränsa musen med kragen-metoden. För att göra detta, greppa basen av svansen med ena handen och placera den på en tå-gripande yta, till exempel en tråd bar locket. Medan du placerar svansen med en hand, håll skruff av halsen med den andra handen.
- Placera stadigt musens kropp över ena handen genom att förlänga pekfingret och tummen tillbaka så långt som möjligt. Placera svansen mellan fingrarna på samma hand för att säkra musen.
- Samtidigt bibehålla musen i ett fast men skonsamt grepp, exponera den ventrala sidan av musen och sätt in nålen i intraperitoneal hålighet på nedre högra eller vänstra kvadranten av buken. Aspirera för att säkerställa korrekt placering och injicera 400 mg/kg 5-FU.
2. insamling av vävnader
- Anesthetize musen med en intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin (100/10 mg/kg) utspädd i saltlösning (0,9% NaCl). Övervaka djupet av anestesi genom att observera den nypa tillbakadragande reflex.
Obs: anestesi är en icke-återhämtning anestesi. - Anteckna vikten av den sövda musen.
- Placera musen i en ryggläge och utföra en laparotomi att exponera bukhålan, följt av ett snitt av bröstet hålighet att införa pneumothorax.
- Med hjälp av sax, offra djuret genom att skära öppna membranet.
- Ta bort tunntarmen. Skär överlägsen pylorus, försiktigt dra in tunntarmen bort från kadaver tills blindtarmen är nådd och göra ett snitt strax före blindtarmen.
- Med hjälp av tång, försiktigt klämma den proximala lumen stängt. Med en 1 mL spruta med en 25 G nål fäst, spola tunntarmen med saltlösning för att ta bort avföring.
- Ta försiktigt bort saltlösning från tarm lumen med kirurgiska instrument.
- Placera tunntarmen på ren blotting papper för att försiktigt ta bort överflödig saltlösning.
- Registrera vikten av spolas vävnad.
- Beräkna spolas liten intestinal vikt som en procentandel av kroppsvikten.
3. tunntarm histologi
-
Vävnads beredning
- I en draghuva, använda sax för att skära 3 cm delar av spolas tarm vävnad från varje mus från tolvfingertarmen, jejunum och ileum och fixera avsnitten i 10% formalin för 24 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: fixativ volymen bör vara 5 − 10 gånger av vävnads volymen. - Överför den fasta vävnaden till en skärbräda.
- Använd en skalpell, trimma vävnaden till ca 1 cm och överför till en inbäddnings kassett.
Obs: kassetten ska märkas med prov identifikation (ID) i blyerts. - Sänk in kassetten i 70% etanol och förvara vid 4 ° c tills den bearbetas vidare.
- I en draghuva, använda sax för att skära 3 cm delar av spolas tarm vävnad från varje mus från tolvfingertarmen, jejunum och ileum och fixera avsnitten i 10% formalin för 24 h vid rumstemperatur.
-
Vävnads inbäddning i paraffin
- Torka av vävnaden genom att placera i stigande alkohollösningar. Placera kassetten i 70% etanol för 1 h, följt av 80% etanol för 1 h, 95% etanol för 1 h och 100% etanol för 1,5 h. överför kassetten från 100% etanol till xylen för 1,5 h.
- Sänk ned kassetten med paraffinvax som värms upp mellan 58 − 60 ° c. Använd tång för att placera vävnaden i en tvärgående orientering och lämna blocken svalna mer än 24 h tills fast.
-
Skära vävnad med hjälp av en mikrotom
- Placera block, vävnad framsidan ner på isen i 5 min. med en mikrotom, trimma paraffin blocken med en tjocklek av 10 − 30 μm för att exponera vävnaden ytan.
- Skär tvärsnitt av vävnads blocket mellan 3 − 5 μm, vilket gör tvärgående sektioner från tolvfingertarmen, jejunum och ileum.
- Placera paraffin band i ett vattenbad som ligger mellan 40 − 45 ° c. Använd PINDATA för att separera sektionerna.
- Använd Mikroskop diabilder för att plocka upp sektionerna från vattnet.
- Lufttorka bilderna i 30 min före färgning.
Observera: för lagring under en längre tid, lagra bilder i ett kylskåp.
-
Hematoxylin-eosin färgning av vävnad
- Placera Mikroskop bilderna i en histologisk vagga. Deparaffinize bilderna i ett värmeskåp inställt på 60 ° c för 60 min.
Obs: bilder direkt från kylskåpet ska lämnas för att nå rumstemperatur innan de placeras i ett värmeskåp. - I rök huven, rehydrera vävnaden i 3 förändringar av en clearing agent (tabell över material), gör 20 dips i den första clearing agent jar och sedan låta dem stå för 7 − 8 min i varje av de två ytterligare clearing agent burkar. Överför bilderna till fallande alkohollösningar, börja med 3 förändringar på 99% etanol, följt av 2 förändringar på 96% etanol och 70% etanol. Gör minst 20 dips i varje burk. Överför till rinnande vatten och låt glidbanorna stå i 5 minuter.
- Sänk ner bilderna i filtrerade Meyer ' s hematoxylin i 1 min.
- Tvätta proverna i rinnande kranvatten i 5 min.
- Doppa sektioner i eosin fläcken i 1 − 2 min, skölj sedan i kranvatten.
- Torka av vävnaden genom att placera i stigande alkohollösningar. Börja med 70% etanol, följt av 96% etanol, 96% etanol och 4 gånger 99% etanol. Gör minst 20 dips i varje burk, och låt vaggan stå i 99% etanol tills de är monterade.
- Montera täckglas genom att applicera en liten mängd av monterings mediet till ytan på bilderna. Lägg täckglan ovanpå monteringsmedlet utan att skapa bubblor under täcksteget. Låt den torka i 24 h.
- Undersök vävnaden med hjälp av ett ljusmikroskop anslutet till en kamera för att få histologiska foton. Använd ett 10X-mål för att ta ögonblicksbilder tills en fullständig täckning av vävnads bilden har uppnåtts.
- Placera Mikroskop bilderna i en histologisk vagga. Deparaffinize bilderna i ett värmeskåp inställt på 60 ° c för 60 min.
4. mätning av crypt djup och/eller moderkaksprov höjd
- Ladda ner och installera analysprogram varan (dvs. Zen lite, tabell över material).
- Öppna bilden i programvaran och Anslut till kameran. Ta ögonblicksbilder i kameraläge med 20x mål.
- Öppna ögonblicksbilden i bearbetningsläge.
- Så här mäter du kryptdjupet: i 2D-vynväljer du linjeverktyget på fliken grafik. Välj en välorienterad krypta och starta linjen längst ner på en moderkaksprov och avsluta på botten av kryptan. Upprepa denna åtgärd för 20 välorienterade krypter (kompletterande figur 1).
- Så här mäter du moderkaksprov höjd: i 2D-vynväljer du linjeverktyget på fliken grafik. Välj en välorienterad moderkaksprov och starta linjen i slutet av den luminala projektion och avsluta i början av kryptan. Upprepa denna åtgärd för 20 välorienterade villi (kompletterande figur 1).
- Växla från 2D-vy till måttvyn för att Visa mätningarna.
- Exportera mätningarna och beräkna medelvärdet av kryptan djup och moderkaksprov höjd.
5. BrdU-kvantifiering (spridning) genom immunohistokemi
- Injektion av BrdU-lösningen
- Väg och registrera mössen kroppsvikt.
- Bered en representativ mängd 0,5% w/v Bromdeoxiuridin (BrdU) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en draghuv.
- Injicera 50 mg/kg BrdU i rök kåpan genom intraperitoneal injektion.
Obs: för att säkerställa att varje mus är euthanized på exakt 150 min post BrdU injektion, injicera varje enskild mus i följd med 10 − 20 min intervall däremellan för att korrekt utföra vävnad insamling. - Anteckna tidpunkten för injektionen.
- Vänta 150 min, sedan söva möss och samla in vävnaden som beskrivs i steg 2.1 − 2.7. Utför BrdU immunohistokemi enligt beskrivningen i avsnitt 5,2.
- BrdU immunohistokemi
- Bered vävnaden enligt beskrivningen i steg 3.1.1 − 3.3.4.
- För antigen hämtning, placera en bild vagga med sektionerna i en glas histologisk burk och fyll den med EDTA buffert (pH 9) i en mikrovågsugn för 1 min vid 750 W följt av 9 min vid 350 W. Upprepa cykeln.
Obs: se till att vävnaden inte torkar ut, vilket kan kräva att lägga mer buffert till burkar mellan uppvärmning. - Tvätta sektionerna 2 − 3 gånger i Tris-buffrad saltlösning och polysorbat 20 (TBS-T) buffert för 3 min vardera.
- Applicera 5 droppar av peroxid block (tabell över material) för 10 − 15 min vid rumstemperatur för att blockera endogen peroxidasaktivitet. Tvätta sektionerna 2 − 3 gånger i TBS-T buffert för 3 min vardera.
- Applicera 5 droppar av gnagare blockbuffert (tabell över material) för 30 min vid rumstemperatur, att blockera icke-specifik bindning. Tvätta sektionerna 2 − 3 gånger i TBS-T buffert för 3 min vardera.
- Inkubera avsnitten med en monoklonal mus anti-BrdU antikropp utspädd 1:500 för 1 h vid rumstemperatur. Tvätta sektionerna 2 − 3 gånger i TBS-T buffert för 3 min vardera.
- Visualisera immunopositivitet med 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) genom att applicera 5 droppar pepparrotperoxidas till varje bild och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Överför sektionerna till en draghuv, tillsätt 150 μL av DAB och inkubera i 5 min.
Observera: Använd alltid handskar vid hantering av DAB och kassera avfall på lämpligt sätt. - Skölj sektioner i avjoniserat vatten.
- Torka av vävnaden och montera en täckslip enligt beskrivningen i steg 3.4.6 och 3.4.7.
- Visualisering av immunoreactions
- Visualisera vävnadsprovet med ett lätt Mikroskop anslutet till en kamera.
- Använd analysprogram varan för att få mikroskopbilder med ett 20x mål för alla sektioner och spara filer i. JPG-format.
- Ta en ögonblicksbild av en etapp mikrometer med ett 20x mål, som kommer att användas som ett kalibreringsverktyg i ImageJ programvara.
- Mätning av området för BrdU immunoreaktiva celler
- Installera ImageJ-programvara (tabell över material).
- Tilldela skala till en bild i ImageJ: öppna scenen mikrometer bild med hjälp av ImageJ fil | Öppna menykommandot. Välj verktyget linjär markering.
- Välj det raka verktyget och rita en rak linje på mikrometerbilden för att definiera en känd sträcka.
- Välj Ställ in skala på analysera -menyn.
- Ange ett värde i rutan känd sträcka och definiera längdenheten i rutan enhets längd . Välj Global så att kalibreringen gäller för alla avbildningar som öppnas i den här imagej-sessionen.
- Öppna en bild av intresse med hjälp av filen ImageJ | Öppna menykommandot för att mäta området för de BrdU immunoreaktiva cellerna per krypta.
- Ställ in färg grafiken på 8 bitar under menyn bild/typ .
- Öka kontrasten på bilden under process/förbättra kontrasten och ställa in mättade pixlar till 0,4%.
- Tillämpa ett tröskelvärde på bilden för att segmentera den immunpositivitet. Välj bild/justera under meny, sedan tröskel och välj den röda färgen (mörkt område som visas i rött). Välj ett tröskelvärde på cirka 10 − 20% genom att flytta tröskel fältet.
Obs: Välj ett tröskelvärde som inkluderar alla BrdU positiva celler med så lite bakgrund som möjligt. Den valda procentsatsen bör gälla för alla avsnitt. - Välj en välorienterad crypt, dvs en komplett krypta från intakt vävnad, och välj fri hands markeringsverktyget för att markera området runt det.
- För att mäta tröskelområdet, Välj fliken analysera , följt av analysera partiklar. I fönstret analysera partikel anger du storlek till 20-oändlighet, klickar på rutan pixel enheter, anger cirkularitet till 0,00 − 1,00och anger Visa till konturer. Klicka på rutor Visa resultat, sammanfattaoch Inkludera hål.
ANMÄRKNINGAR: värdena för BrdU-positiva celler genereras automatiskt i ett resultatfönster, som visar de enskilda måtten för varje BrdU-positiv cell. Dessutom genereras ett sammanfattningsfönster automatiskt, som visar antalet räkningar, total yta, genomsnittlig storlek och procentandel av området med BrdU-positiva celler. - Upprepa steg 5.4.10 och 5.4.11 för att mäta en ny krypta. Resultaten av alla uppmätta kryptor visas i sammanfattnings fönstret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det första experimentet, vi inducerade mukosit i möss på dag 0 och offrade en grupp möss varje dag för 5 dagar i följd. Vid mätning av SI-vikt, fann vi att denna parameter minskade från dag 2 till dag 4 tyder på en förlust i enterocyte massan. Vi fann också att SI-vikten vid dag 5 inte signifikant skiljer sig från dag 0 (obehandlade möss) (figur 1). Spridningen mätt genom införlivandet av BrdU var nästan avskaffades vid dag 1 och dag 2, men dag 4 och dag 5 var det ungefär fyra gånger och femfaldig ökning av spridningen, respektive (figur 2). Denna hyperproliferation illustrerades också vid mätning av kryptan (figur 3). Vad som inte illustreras genom att mäta kryptan djup är förlusten i prolifererande celler vid dag 1 och dag 2, där crypt djup reducerades med cirka 13% men var inte signifikant annorlunda från de friska möss. Vi kan visa att det i regenerativ fas av mukosit fanns en stark korrelation mellan BrdU inkorporering och crypt djup, men detta inte räknas för den akuta fasen indikerar att crypt djup som en Endpoint kanske inte lämpar sig i den akuta fasen av mukosit (figur 4).
I den andra studien undersökte vi mucostis i vår transgena musmodell med otillräcklig utsöndring av L-celler. Möss med bristfällig GLP-1 och GLP-2 uppvisade en allvarlig förlust av kroppsvikt (BW) och en minskning av SI-vikten i återhämtningsfasen, vilket var mycket signifikant jämfört med 5-FU-möss av vild typ (p < 0,01) (figur 5a, B). Dessutom kunde de transgena möss inte Visa kompenserande hyperproliferation; kryptor var signifikant kortare än i både WT-möss och friska kontroller. I motsats till detta visade WT-möss en ökning av crypt-djupet som ett tecken på hyperproliferation (figur 5c).
Figur 1: liten tarm vikt. Möss offrades 1 till 5 dagar efter 5-FU injektion på dag 0 och tarm vikten mättes enligt beskrivningen. Resultaten visas som medelvärdet ± standardfel av medelvärdet (SEM). n = 13. Denna siffra har modifierats från Hytting-Andreasen et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: BrdU immunpositiva celler per krypta för tolvfingertarmen, jejunum och ileum i si. Möss offrades 1 till 5 dagar efter 5-FU injektion på dag 0 och BrdU inkorporering kvantifierades av immunohistokemi som beskrivs. Resultaten visas som medelvärdet ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 jämfört med dag 0 (analys av varians [ANOVA] följt av Dunnett multipeljämförelse test). p < 0,001 jämfört med dag 0 (ANOVA följt av Dunnett multipla jämförelse test). Denna siffra har modifierats från Hytting-Andreasen et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mätning av krypdjup. Möss offrades 1 till 5 dagar efter 5-FU injektion på dag 0 och crypt djup mättes som beskrivs. Resultaten visas som medelvärdet ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 jämfört med dag 0 (ANOVA följt av Dunnett flera jämförelse test). Denna siffra har modifierats från Hytting-Andreasen et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: korrelation mellan crypt DEPTH och BrdU. Crypt djup (i tolvfingertarmen, jejunum, och ileum) är korrelerad till BrdU inkorporering vid varje dag av uppoffring med tvåsidiga Pearson korrelation test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: möss med GLP-1-och GLP-2-brist regenererar inte efter akut mukosit. A) ändring av BW (%), (B) SI-vikt (g) och (C) krypdjup i ileum (μm). Resultaten visas som medelvärde ± SEM. TG = transgena möss; WT = möss med vild typ; 5-FU = 5-fluorouracil. n = 4 − 8. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 jämfört med friska kontroll (WT Saline), a = p < 0,05, AA = p < 0,01, AAA = p < 0,001 jämfört med WT 5-FU (tvåvägsanova följt av Bonferroni flera jämförelse test [BW] eller ANOVA följt av Dunnett Multiple jämf på prov). Denna siffra har modifierats från Hytting-Andreasen et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: liten tarm vävnad före induktion av mukosit, under den akuta fasen och återhämtningsfasen av mukosit. A) hemotoxylin och eosin (H & E) färgning och (D) BrdU-färgning hos obehandlade möss. Den svarta prickade linjen i panel A exemplifierar en välorienterad krypta, medan den prickig gröna linjen visar en välorienterad villus. B) H & E färgning och (E) BrdU-färgning under den akuta fasen av mukosit. C) H & E färgning och (F) BrdU-färgning under återhämtningsfasen efter induktion av mukosit. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att studera SI skada och förnyelse i en musmodell. Det finns ett brett utbud av prekliniska djurmodeller av tarm skador, men det är viktigt att vi förstår att varje modell är unik och att ändpunkterna måste vara lämpliga för att besvara forskningsfrågan. Denna modell är utmärkt att studera adaptiv svar på skada, men ändpunkterna bör ändras när du använder modellen som en preklinisk modell av mukosit. Men, översättning från djurmodeller till patienter är utmanande23. Våra föreslagna endpoints av SI vikt och spridning bör begränsas till studier av adaptiv respons endast. Studiet av endogena faktorer kräver ofta användning av transgena möss, och även om liten tarm resektion är möjlig i möss1, denna modell kan vara ett alternativ för att undvika postoperativ dödlighet. Vid tillämpning av denna modell på transgena möss, det är viktigt att titta på möss noggrant och övervaka deras vikt varje dag. Under denna studie upplevde några av mössen en viktminskning på upp till 30%, vilket är ganska betydande. För att undvika hög dödlighet i känsliga fenotyper föreslår vi att du utför pilotstudier på transgena möss, eftersom dosjustering kan behövas.
Ett kritiskt steg inom den beskrivna metoden är avlägsnande och vägning av SI. Det är viktigt att avlägsnande och hantering utförs på samma sätt och av samma forskare varje gång för att undvika stora Inter-assay variationer.
Konsekvensen av crypt och moderkaksprov val är viktigt att undvika varians och bias vid mätning av crypt djup och moderkaksprov höjd. När du bäddar in vävnaden i paraffin, är tarmarna placerade i upprätt läge för att göra tvärgående nedskärningar, vilket ökar möjligheten för intakt villi och kryptor. Efter styckning av vävnaden, en välorienterad crypt och/eller moderkaksprov väljs. Urvalet bygger på en fullständig visualisering av hela kryptan och moderkaksprov i samma plan och närvaron av tydliga gränser av celler inom kryptan och moderkaksprov. En begränsning av denna metod är den något subjektiva metoden när man väljer en välorienterad krypta eftersom valet av en välorienterad crypt och/eller villi görs efter styckning vävnaden. En tidigare studie24 har presenterat en alternativ metod för att övervinna denna begränsning, där de använder microdissection. I denna metod, villi och kryptor väljs medan Observera under ett mikroskop, innan vävnaden skärs, vilket gör det möjligt att se till att en intakt krypta och villi är dissekeras från vävnaden.
Till skillnad från tidigare metoder som används för att kvantifiera BrdU positiva celler25,26, detta protokoll beskriver området för BrdU positiva celler per crypt, vilket ger ett snabbt sätt att kvantitera proliferativa celler inom varje krypta. Denna teknik kan dock vara något restriktiv eftersom det kräver en djupare kunskap om programvaran som föreslås för mätningen av denna teknik. En framtida tillämpning av detta protokoll kan vara att skapa en mer automatisk genererad metod för att kvantifiera och mäta de BrdU positiva cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett fritt bidrag från Novo Nordisk Center för grundläggande metabolisk forskning och Lundbecks stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
