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Cancer Research

Endpoint importanti e marcatori proliferativi per valutare piccole lesioni intestinali e adattamento utilizzando un modello murino di mucosite indotta dalla chemioterapia

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire importanti endpoint e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucotisi indotta dalla chemioterapia. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare e usando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l'altezza del villus come endpoint.

Abstract

L'adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l'intestino viene perso a causa di un trauma. Le risposte adattive, come la proliferazione delle cellule della cripta e l'aumento dell'assorbimento dei nutrienti, sono fondamentali nel recupero, ma poco comprese. Comprendere il meccanismo molecolare alla base delle risposte adattive è fondamentale per facilitare l'identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l'adattamento. Diversi approcci e modelli sono stati descritti in tutta la letteratura, ma è necessario un modo descrittivo dettagliato per eseguire essenzialmente le procedure per ottenere dati riproducibili. Qui, descriviamo un metodo per stimare endpoint importanti e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucosite indotta dalla chemioterapia nei topi. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare, così come utilizzando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l'altezza del villus come endpoint. Alcuni dei passaggi critici all'interno del metodo descritto sono la rimozione e la pesatura dell'intestino tenue e il sistema software piuttosto complesso suggerito per la misurazione di questa tecnica. Questi metodi hanno i vantaggi che non richiedono molto tempo e che sono convenienti e facili da realizzare e misurare.

Introduction

L'adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l'intestino viene perso a causa di malattia o chirurgia1,2. Dopo il trauma, l'intestino subisce una risposta adattiva morfometrica e funzionale, caratterizzata da proliferazione delle cellule della cripta e aumento dell'assorbimento dei nutrienti3. Questo passaggio è fondamentale per il ripristino, ma poco compreso. Gli studi sperimentali della risposta adattiva intestinale si sono concentrati sui cambiamenti che si verificano dopo la resezione intestinale in topi, ratti e maiali, ma la comprensione del meccanismo molecolare alla base della risposta adattiva in altri tipi di lesioni (ad esempio, chimica o batterica) è fondamentale per facilitare l'identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l'adattamento. Sperimentalmente, diversi approcci sono stati utilizzati per descrivere il complesso indice molecolare e cellulare di piccole patologie intestinali, tra cui il punteggio istopatologico e la misurazione dell'esito della lesione. Nonostante ciò, ciò che è assente dalla letteratura è una descrizione dettagliata di come eseguire le procedure necessarie per ottenere dati riproducibili. Quando si identificano i fattori coinvolti nell'adattamento, come gli ormoni intestinali, un modello animale facile, a basso costo e riproducibile è garantito e qui suggeriamo l'uso di un modello di mucosite intestinale indotta da chemioterapia (CIM).

Uno degli endpoint più semplici e molto informativi sia della lesione che dell'adattamento è misurare la massa dell'intestino tenue (SI). Sappiamo che un segno distintivo della mucosite è l'apoptosi degli enterociti, l'atrofia del villus dipendente dal tempo e la mitosi ridotta. Pertanto, l'esame della morfologia intestinale è altamente rilevante nei modelli preclinici4,5. Nell'uomo, un declino dell'agrullllllina al plasma, un marcatore di enterociti funzionanti, correla con punteggi di tossicità e marcatori infiammatori6 oltre alla capacità di assorbimento7, suggerendo che questo aminoacido è un eccellente biomarcatore di Mucosite. L'inciglia può essere misurata sia nei topi che nei ratti, e ha mostrato eccellenti correlazioni con la lunghezza del villus8, la sopravvivenza della cripta9e la mucosite indotta da radiazioni10.

Uno dei principali vantaggi della misurazione dell'agrumile al plasma è la capacità di raccogliere misurazioni ripetute da un animale. Tuttavia, il prelievo di sangue multiplo nei topi è limitato a un volume totale di sangue di 6 l/g/settimana e richiede l'anestesia generale. Questo purtroppo limita anche l'uso delle misurazioni dell'agruminellina nei topi. Inoltre, la misurazione dell'acitrulllo richiede cromatografia liquida ad alte prestazioni11,12, che è costosa e richiede molto tempo. Recentemente, abbiamo dimostrato che i livelli di agruminellline nei topi sono significativamente correlati al peso DI SI (p < 0,001) (dati inediti), rendendo l'agrumilluna una misurazione diretta che riflette la massa enterocitica. Una limitazione alla misurazione del peso SI è la necessità di sacrificare i topi e quindi non sono possibili misurazioni ripetute all'interno dello stesso mouse. Tuttavia, il metodo offre la possibilità di eseguire una serie di altre analisi tissutali dirette alla questione della ricerca, e questi fatti possono plausibilmente compensare l'uso aggiuntivo degli animali. Suggeriamo quindi di utilizzare il peso SI come un biomarcatore facile, a basso costo e veloce di lesioni e adattamento nei topi. Per garantire la riproducibilità e la variazione analitica accettabile, l'intestino deve essere accuratamente rimosso dall'animale, lavato con salina, svuotato e asciugato prima della pesata. In questo articolo viene illustrato esattamente come viene eseguita questa procedura.

Un altro segno distintivo della mucosite è la perdita delle cellule proliferanti nelle cripte e un'iperproliferazione compensativa durante il periodo rigenerativo3. Il marcatore cellulare Ki67 è stato spesso utilizzato per determinare le cellule proliferali veloci per mezzo di immunostachimica13. Anche se Ki67 è un semplice marcatore di proliferazione, ha una tendenza all'imprecisione poiché Ki67 è presente durante tutte le fasi attive del ciclo cellulare (G1, S, G2 e M)14. L'etichettatura specifica è essenziale per rilevare le cellule replicanti, motivo per cui suggeriamo l'incorporazione in situ di 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU), un analogo sintetico della tiofina, in quanto è in gran parte limitato alla replica delle cellule nella fase S15. BrdU viene iniettato negli animali 150 minuti prima del sacrificio e le cellule possono essere successivamente rilevate con immunohistochimica utilizzando anticorpi specifici BrdU. In questo articolo di metodo, mostriamo esattamente come misurare l'area delle cellule immunopositive BrdU all'interno di una cripta utilizzando un software di immagine libera.

I cambiamenti morfologici e funzionali sono spesso studiati in modelli di mucosite indotta da 5-FU, dove l'adattamento intestinale viene valutato dall'altezza del villus e dalla profondità della cripta. Durante questo studio, abbiamo scoperto che durante la fase acuta della mucosite, che è uguale alla fase di lesione, la proliferazione misurata dall'incorporazione di BrdU non è correlata alla profondità della cripta. In contrasto con questo, la profondità della cripta è significativamente correlata con la proliferazione osservata nella fase di riparazione della mucosite, da 3 a 5 giorni dopo l'induzione. Ciò suggerisce che la fase acuta della mucosa non è misurabile solo per profondità della cripta. Suggeriamo che quando si utilizza la proliferazione come endpoint nella fase acuta dei topi mucositi, l'incorporazione di BrdU dovrebbe essere usata preferibilmente, ma quando si quantifica l'iperproliferazione nella fase successiva durante la fase rigenerativa, la profondità della cripta è un ragionevole alternativa all'incorporazione di BrdU. L'obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere questo modello in modo che possa essere utilizzato da tutti i ricercatori, sia nel campo dell'oncologia, ma soprattutto i ricercatori non hanno familiarità con i modelli di lesioni intestinali.

Il modello descritto può essere utilizzato per fenotipo modelli transgenici in base alla risposta adattiva utilizzando peso corporeo, peso SI e profondità della cripta come endpoint. Ad esempio, mostriamo qui come abbiamo usato il modello di 5-fluorouracil (5-FU) indotto mucosite in un modello di knock out cellulare con insufficiente secrezione L-cell16. Peptide-1 glucagon-like (GLP-1) e peptide-2 glucagon-like (GLP-2) sono ormoni intestinali co-secreted dalle cellule L enteroendocrine in risposta all'assunzione di cibo17,18. GLP-2 è riconosciuto come un fattore importante per la guarigione intestinale, la regolazione dell'apoptosi mucosale e il miglioramento della funzione di barriera della funzione di barriera del SI19,20,21,22. Sulla base della letteratura, abbiamo ipotizzato che gli ormoni endogeni siano essenziali per l'iperproliferazione compensativa che si verifica nella risposta adattiva dopo l'infortunio.

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Protocol

Tutti i metodi descritti sono stati condotti in conformità con gli orientamenti della legislazione danese che disciplinano la sperimentazione animale (1987). Gli studi sono stati condotti con il permesso del Danish Animal Experiments Inspectorate (2013-15-2934-00833) e del comitato etico locale.

NOTA: Sono stati ottenuti topi femminili C57BL/6J (20-25 g) e alloggiati otto per gabbia in standard 12 h light, 12 h dark cycle con libero accesso all'acqua e al chow standard. Gli animali sono stati lasciati ad acclimatarsi per una settimana prima dell'inizio degli esperimenti.

1. Induzione della mucosite con 5 fluorouracil

  1. Ottenere 5-fluorouracil (5-FU) in una soluzione 50 mg/mL.
  2. Pesare e registrare il peso corporeo dei topi. Dal peso corporeo, calcolare la quantità di 5-FU per l'iniezione (ad esempio, 400 mg/kg).
  3. Preparare una siringa da 1 mL collegata a un ago da 27 G x 30 mm e riempire la siringa con la quantità calcolata di 5-FU per l'iniezione.
  4. Filtrare il mouse con il metodo scruff. Per fare questo, afferrare la base della coda con una mano e posizionarla su una superficie di presa di piedi, come un coperchio della barra di filo. Mentre si posiziona la coda con una mano, tenere la forsa del collo con l'altra mano.
  5. Posizionare saldamente il corpo del mouse su una mano estendendo l'indice e il pollice indietro il più possibile. Posizionare la coda tra le dita di questa stessa mano per fissare il mouse.
  6. Pur mantenendo il mouse in una presa ferma ma delicata, esporre il lato ventrale del mouse e inserire l'ago nella cavità intraperitoneale sul quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome. Aspirare per garantire una corretta collocazione e iniettare il 400 mg/kg 5-FU.

2. Collezione di tessuti

  1. Anestesizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina/xylazina (100/10 mg/kg) diluita in soluzione salina (0,9% NaCl). Monitorare la profondità dell'anestesia osservando il riflesso di ritiro del pizzico.
    NOTA: L'anestesia è un'anestesia non di recupero.
  2. Registrare il peso del mouse anestesizzato.
  3. Posizionare il topo in una posizione supina ed eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale, seguita da un'incisione della cavità toracica per introdurre lo pneumotorace.
  4. Usando le forbici, sacrifica l'animale tagliando aprire il diaframma.
  5. Rimuovere l'intestino tenue. Tagliare superiore al piloro, ritrarre con attenzione l'intestino tenue lontano dalla carcassa fino a raggiungere il cecum e fare un taglio appena prima del cecum.
  6. Usando le pinze, bloccare delicatamente il lume prossimale. Utilizzando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G attaccato, lavare l'intestino tenue con la salina per rimuovere le feci.
  7. Rimuovere delicatamente la salina dal lume intestinale con strumenti chirurgici.
  8. Posizionare l'intestino tenue su carta pulita per rimuovere con attenzione l'eccesso di salina.
  9. Registrare il peso del tessuto lavato.
  10. Calcolare il piccolo peso intestinale arrossato come percentuale del peso corporeo.

3. Istologia dell'intestino tenue

  1. Preparazione dei tessuti
    1. In un cofano fumatore, utilizzare le forbici per tagliare 3 cm sezioni del tessuto intestinale arrossato da ogni topo dal duodenum, jejunum e ileum e fissare le sezioni in 10% formalina per 24 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Il volume fissativo deve essere di 5-10 volte del volume del tessuto.
    2. Trasferire il tessuto fisso in una tagliere.
    3. Utilizzando un bisturi, tagliare il tessuto a circa 1 cm e trasferirlo in una cassetta di incorporamento.
      NOTA: La cassetta deve essere etichettata con l'identificazione del campione (ID) a matita.
    4. Sommerse la cassetta nel 70% di etanolo e conservatela a 4 gradi centigradi fino a un'ulteriore elaborazione.
  2. Incorporamento di tessuti in paraffina
    1. Disidratare il tessuto mettendo in soluzioni alcoliche ascendenti. Posizionare la cassetta nel 70% di etanolo per 1 h, seguita da 80% etanolo per 1 h, 95% etanolo per 1 h e 100% etanolo per 1,5 h. Trasferire la cassetta dal 100% di etanolo a xilene per 1,5 h.
    2. Immergi la cassetta con cera di paraffina riscaldata tra i 58 e i 60 gradi centigradi. Utilizzare pinze per posizionare il tessuto in un orientamento trasversale e lasciare i blocchi raffreddare più di 24 h fino a quando solido.
  3. Taglio dei tessuti con un microtoma
    1. Posizionare il blocco, tessuto a faccia in giù sul ghiaccio per 5 min.
    2. Tagliare le sezioni trasversali del blocco di tessuto tra i 3 e 5 m, facendo sezioni trasversali del duodenum, del jejunum e dell'ileo.
    3. Collocare il nastro di paraffina in un bagno d'acqua situato tra i 40 e i 45 gradi centigradi. Utilizzare le pinze per separare le sezioni.
    4. Utilizzare vetrini al microscopio per raccogliere le sezioni dall'acqua.
    5. Asciugare all'aria i vetrini per 30 min prima di colorare.
      NOTA: Per la conservazione per un periodo di tempo più lungo, conservare i vetrini in frigorifero.
  4. Macchie ematossilina-eosin del tessuto
    1. Posizionare i vetrini del microscopio in una culla istologica. Depararizzare i vetrini in un armadio riscaldante fissato a 60 gradi centigradi per 60 min.
      NOTA: I vetrini direttamente dal frigorifero devono essere lasciati per raggiungere la temperatura ambiente prima di metterli in un armadio di riscaldamento.
    2. Nel cofano dei fumi, reidratare il tessuto in 3 cambi di un agente di compensazione (Tabella dei materiali), fare 20 tuffi nel primo vaso agente di compensazione e poi lasciarli riposare per 7-8 min in ciascuno dei due barattoli di clearing agent aggiuntivi. Trasferire le diapositive a soluzioni alcoliche decrescenti, iniziare con 3 cambi del 99% di etanolo, seguiti da 2 cambi del 96% di etanolo e del 70% di etanolo. Fai un minimo di 20 tuffi in ogni barattolo. Trasferire in acqua corrente e lasciare riposare i vetrini per 5 min.
    3. Immergere le diapositive nell'ematossitale di Meyer filtrato per 1 min.
    4. Lavare i campioni in acqua corrente del rubinetto per 5 min.
    5. Immergete le sezioni nella macchia di eosina per un minimo di 1/2, quindi risciacquatevi nell'acqua del rubinetto.
    6. Disidratare il tessuto mettendo in soluzioni alcoliche ascendenti. Inizia con il 70% di etanolo, seguito da 96% etanolo, 96% etanolo e 4 volte 99% di etanolo. Fare un minimo di 20 tuffi in ogni barattolo, e lasciare che la culla stare in 99% etanolo fino a quando non sono montati.
    7. Montare i copricopro applicando una piccola quantità del supporto di montaggio alla superficie dei vetrini. Posizionare il coperchio sopra il supporto di montaggio senza creare bolle sotto la coverslip. Lasciare asciugare per 24 ore.
    8. Esaminare il tessuto utilizzando un microscopio luminoso collegato a una fotocamera per ottenere foto istologiche. Utilizzare un obiettivo 10x per scattare istantanee fino a raggiungere una copertura completa della diapositiva di tessuto.

4. Misurazione della profondità della cripta e/o dell'altezza della villus

  1. Scaricare e installare il software di analisi (ad es., zen Lite, Tabella dei materiali).
  2. Aprire l'immagine nel software e connettersi alla fotocamera. Scatta istantanee in modalità fotocamera con obiettivo 20x.
  3. In modalità di elaborazione, aprire lo snapshot.
  4. Per misurare la profondità della cripta: nella vista 2D,selezionare lo strumento linea dalla scheda grafica. Scegliere una cripta ben orientata e iniziare la linea nella parte inferiore di un villus e finire nella parte inferiore della cripta. Ripetere questa azione per 20 cripte ben orientate (Figura supplementare 1).
  5. Per misurare l'altezza del villus: nella vista 2D, selezionare lo strumento linea dalla scheda grafica. Scegliere un villus ben orientato e iniziare la linea alla fine della proiezione luminale e terminare all'inizio della cripta. Ripetere questa azione per 20 villi ben orientati (Figura supplementare 1).
  6. Passare dalla vista 2D alla vista Misura per visualizzare le misure.
  7. Esportare le misurazioni e calcolare la media della profondità della cripta e dell'altezza del villus.

5. Quantificazione BrdU (proliferazione) mediante immunohistochimica

  1. Iniezione della soluzione BrdU
    1. Pesare e registrare il peso corporeo dei topi.
    2. In un cofa fumato, preparare una quantità rappresentativa di 0,5% w/v bromodeoxyuridina (BrdU) soluzione in fosfato buffered salina (PBS).
    3. Nel cofano del fume, iniettare 50 mg/kg di BrdU mediante iniezione intraperitoneale.
      NOTA: Per garantire che ogni topo sia eutanasia esattamente a 150 min di iniezione post BrdU, iniettare ogni singolo topo in successione con un intervallo di 10-20 min in mezzo per eseguire correttamente la raccolta dei tessuti.
    4. Registrare il tempo di iniezione.
    5. Attendere 150 min, quindi anetizzare i topi e raccogliere il tessuto come descritto nei passaggi 2.1.2.7. Eseguire l'immunohistochimica BrdU come descritto nella sezione 5.2.
  2. immunohistochimica BrdU
    1. Preparare il tessuto come descritto nei passaggi 3.1.1.3.3.4.
    2. Per il recupero dell'antigene, posizionare una culla di scorrimento con le sezioni in un barattolo di istologia di vetro e riempirla con il tampone EDTA (pH 9) in un forno a microonde per 1 min a 750 W seguito da 9 min a 350 W. Ciclo di ripetizione.
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si asciughi, il che potrebbe richiedere l'aggiunta di più tamponamenti ai barattoli tra il riscaldamento.
    3. Lavare le sezioni 2 x 3 volte nel buffer salina tris e nel buffer a polysorbate 20 (TBS-T) per 3 min ciascuna.
    4. Applicare 5 gocce di blocco di perossido (Tabella dei materiali) per 10,15 min a temperatura ambiente per bloccare l'attività endogena perossidasi. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
    5. Applicare 5 gocce di buffer di blocchi di roditori (Tabella dei materiali) per 30 min a temperatura ambiente, per bloccare il legame non specifico. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
    6. Incubare le sezioni con un anticorpo monoclonale anti-BrdU diluito 1:500 per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
    7. Visualizza l'immunopositività usando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) applicando 5 gocce di perossidasi di rafano a ogni vetrino e incubaperdi per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire le sezioni in un cofano di fumi, aggiungere 150 -L di DAB e incubare per 5 min.
      NOTA: Indossare sempre i guanti durante la manipolazione del DAB e smaltire i rifiuti in modo appropriato.
    8. Risciacquare le sezioni in acqua deionizzata.
    9. Disidratare il tessuto e montare un coperchio come descritto nei passaggi 3.4.6 e 3.4.7.
  3. Visualizzazione delle immunoreazioni
    1. Visualizza il campione di tessuto con un microscopio luminoso collegato a una telecamera.
    2. Utilizzare il software di analisi per ottenere immagini al microscopio utilizzando un obiettivo 20x di tutte le sezioni e salvare i file nel file . formato JPG.
    3. Scattare un'istantanea di un micrometro di fase utilizzando un obiettivo 20x, che verrà utilizzato come strumento di calibrazione nel software ImageJ.
  4. Misurazione dell'area delle cellule immunoreattive BrdU
    1. Installare il software ImageJ (Tabella dei materiali).
    2. Assegnazione della scala a un'immagine in ImageJ: aprire l'immagine del micrometro dello stage utilizzando il file ImageJ Comando di menu Apri. Selezionare lo strumento di selezione lineare.
    3. Selezionare lo strumento diritto e disegnare una linea retta sull'immagine del micrometro per definire una distanza nota.
    4. Selezionate Imposta scala (Set Scale) dal menu Analizza (Analyse).
    5. Immettere un valore nella casella Distanza nota e definire l'unità di lunghezza nella casella Unità di lunghezza. Selezionare Globale in modo che questa calibrazione si applichi a tutte le immagini aperte in questa sessione ImageJ.
    6. Aprire un'immagine di interesse utilizzando il file ImageJ Aprire il comando di menu per misurare l'area delle cellule immunoreattive BrdU per cripta.
    7. Impostare la grafica a colori su 8 bit nel menu Immagine/Tipo.
    8. Aumentare il contrasto dell'immagine in Processo/Migliora contrasto e impostare i pixel saturi su 0,4%.
    9. Applicare una soglia all'immagine per segmentare l'immunopositività. Selezionare Immagine/Regola sotto il menu, quindi soglia e selezionare il colore Rosso (area scura visualizzata in rosso). Scegli una soglia di circa il 10-20% spostando la barra di soglia.
      NOTA: scegliere una soglia che includa tutte le celle positive BrdU con il minor numero possibile di sfondo. La percentuale scelta dovrebbe essere applicata a tutte le sezioni.
    10. Scegli una cripta ben orientata, cioè una cripta completa dal tessuto intatto, e seleziona lo strumento di selezione a mano libera per contrassegnare l'area intorno ad essa.
    11. Per misurare l'area di soglia, selezionare la scheda Analizza, seguita da Analizza particelle. Nella finestra Analizza particella, impostate Dimensione su 20-infinito, fate clic sulla casella unità pixel, impostate Circolarizza su 0,00-1,00e impostate Mostra su Contorni. Fare clic sulle caselle Visualizza risultati, Riepilogae Includi fori.
      NOTA: i valori delle celle brdU positive vengono generati automaticamente in una finestra dei risultati, mostrando le singole misurazioni per ogni cella brdU positiva. Inoltre, viene generata automaticamente una finestra di riepilogo, che mostra il numero di conteggi, l'area totale, le dimensioni medie e la percentuale di area con celle brdU positive.
    12. Ripetere i passaggi 5.4.10 e 5.4.11 per misurare una nuova cripta. I risultati di tutte le cripte misurate verranno visualizzati nella finestra Riepilogo.

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Representative Results

Nel primo esperimento, abbiamo indotto la mucosite nei topi al giorno 0 e sacrificato un gruppo di topi ogni giorno per 5 giorni consecutivi. Quando si misura il peso SI, abbiamo scoperto che questo parametro è diminuito dal giorno 2 fino al giorno 4 suggerendo una perdita nella massa enterocite. Abbiamo anche scoperto che al giorno 5, il peso SI non era significativamente diverso dal giorno 0 (topi non trattati) (Figura 1). La proliferazione misurata dall'incorporazione di BrdU è stata quasi abolita al giorno 1 e al giorno 2, ma al giorno 4 e al giorno 5 c'erano circa quadruplicate e cinque volte aumenti della proliferazione, rispettivamente (Figura 2). Questa iperproliferazione è stata illustrata anche durante la misurazione della profondità della cripta (Figura 3). Ciò che non è illustrato misurando la profondità della cripta è la perdita di cellule che proliferano al giorno 1 e al giorno 2, dove la profondità della cripta è stata ridotta di circa il 13% ma non era significativamente diversa dai topi sani. Potremmo dimostrare che, nella fase rigenerativa della mucosite c'era una forte correlazione tra l'incorporazione di BrdU e la profondità della cripta, ma questo non contava per la fase acuta che indicava che la profondità della cripta come endpoint potrebbe non essere adatta nella fase acuta di mucosite (Figura 4).

Nel secondo studio, abbiamo esaminato la mucostis nel nostro modello murino transgenico con una secrezione cellulare a L insufficiente. I topi con carenti GLP-1 e GLP-2 hanno mostrato una grave perdita di peso corporeo (BW) e una diminuzione del peso delle SI nella fase di recupero, che è stata molto significativa rispetto ai topi a 5 FU di tipo selvatico (WT) (p < 0,01) (Figura 5A,B). Inoltre, i topi transgenici non hanno mostrato un'iperproliferazione compensativa; cripte erano significativamente più brevi che in entrambi i topi WT e controlli sani. Contrariamente a questo i topi WT hanno mostrato un aumento della profondità della cripta come segno di iperproliferazione (Figura 5C).

Figure 1
Figura 1: Piccolo peso intestinale. I topi sono stati sacrificati da 1 a 5 giorni dopo l'iniezione 5-FU al giorno 0 e il peso intestinale è stato misurato come descritto. I risultati sono indicati come media : errore standard della media (SEM). n n - 13. Questa cifra è stata modificata da Hytting-Andreasen et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Cellule immunopositive BrdU per cripta per il duodenum, il jejunum e l'ileum del SI. I topi sono stati sacrificati da 1 a 5 giorni dopo l'iniezione 5-FU al giorno 0 e l'incorporazione di BrdU è stata quantificata dall'immunoistochimica come descritto. I risultati sono indicati come media . -p < 0,05, 'p < 0.001 rispetto al giorno 0 (analisi della varianza [ANOVA] seguita da Test di confronto multiplo Dunnett). p < 0.001 rispetto al giorno 0 (ANOVA seguito da Test di confronto multiplo Dunnett). Questa cifra è stata modificata da Hytting-Andreasen et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Misurazione della profondità della cripta. I topi sono stati sacrificati da 1 a 5 giorni dopo l'iniezione 5-FU al giorno 0 e la profondità della cripta è stata misurata come descritto. I risultati sono indicati come media . p , 0,001 rispetto al giorno 0 (ANOVA seguito da Dunnett multiple comparison test). Questa cifra è stata modificata da Hytting-Andreasen et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Correlazione di profondità della cripta e BrdU. La profondità della cripta (in duodenum, jejunum e ileum) è correlata all'incorporazione di BrdU ad ogni giorno di sacrificio utilizzando un test di correlazione Pearson a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: I topi carenti GLP-1 e GLP-2 non si rigenerano dopo la mucosite acuta. (A) Variazione del peso di BW (%), (B) SI (g) e (C) della profondità della cripta in ileum (M). I risultati sono indicati come media : SEM. Tg - topi transgenici; WT - topi di tipo selvaggio; 5-FU - 5-fluorouracil. n - 4/8. < 0,05, -p < 0,01, sp < 0,001 rispetto al controllo integro (WT saline), a s < 0,05, aa - p < 0,01, aaa - p < 0,001 rispetto a WT 5-FU (ANOVA bidirezionale seguito da Bonferroni test multipli [BW] o ANOVA seguito da Dtanet com durante il test). Questa cifra è stata modificata da Hytting-Andreasen et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Piccolo tessuto intestinale prima dell'induzione della mucosite, durante la fase acuta e la fase di recupero della mucosite. (A) Colorazione Emotoxylin ed eosina (H&E) e colorazione (D) BrdU in topi non trattati. La linea tratteggiata nera nel pannello A esemplifica una cripta ben orientata, mentre la linea verde tratteggiata dimostra un villus ben orientato. (B) Colorazione H&E e colorazione BrdU durante la fase acuta della mucosite. (C) Colorazione H&E e colorazione BrdU durante la fase di recupero dopo l'induzione della mucosite. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Qui, dimostriamo un metodo ampiamente accessibile per studiare le lesioni e la rigenerazione delle SI in un modello murino. Esiste un'ampia varietà di modelli animali preclinici di lesioni intestinali, ma è fondamentale capire che ogni modello è unico e che gli endpoint devono essere appropriati per rispondere alla domanda di ricerca. Questo modello è eccellente per studiare la risposta adattiva alle lesioni, ma gli endpoint devono essere modificati quando si utilizza il modello come modello preclinico della mucosite. Tuttavia, la traduzione da modelli animali a pazienti è impegnativa23. I nostri endpoint suggeriti di peso E proliferazione di SI dovrebbero essere limitati allo studio della sola risposta adattiva. Lo studio dei fattori endogeni spesso richiede l'uso di topi transgenici, e anche se la piccola resezione intestinale è possibile nei topi1, questo modello potrebbe essere un'alternativa per evitare la mortalità post-operatoria. Quando si applica questo modello ai topi transgenici, è importante guardare i topi con attenzione e monitorare il loro peso ogni giorno. Durante questo studio, alcuni dei topi hanno sperimentato una perdita di peso fino al 30%, che è abbastanza sostanziale. Per evitare un'elevata mortalità nei fenotipi sensibili, suggeriamo di eseguire studi pilota su topi transgenici, poiché potrebbe essere necessario regolare la dose.

Un passaggio critico all'interno del metodo descritto è la rimozione e la pesatura del SI. È importante che la rimozione e la manipolazione vengano eseguite nello stesso modo e dallo stesso ricercatore ogni volta per evitare grandi variazioni di analisi.

La consistenza della selezione della cripta e del villus è importante per evitare la varianza e la distorsione durante la misurazione della profondità della cripta e dell'altezza del villus. Quando si incorpora il tessuto in paraffina, l'intestino è posizionato in posizione eretta per fare tagli trasversali, aumentando così la possibilità di villi e cripte intatte. Dopo il taglio del tessuto, viene selezionata una cripta e/o un villus ben orientati. La selezione si basa sulla visualizzazione completa dell'intera cripta e villus nello stesso piano e sulla presenza di bordi chiari delle celle all'interno della cripta e del villus. Una limitazione a questo metodo è l'approccio un po 'soggettivo quando si seleziona una cripta ben orientata dal momento che la selezione di una cripta ben orientata e/o villi è fatta dopo aver tagliato il tessuto. Uno studio precedente24 ha presentato un metodo alternativo per superare questa limitazione, in cui usano la microdissezione. In questo metodo, villi e cripte vengono selezionati durante l'osservazione al microscopio, prima del taglio del tessuto, rendendo così possibile garantire che una cripta e un villi intatti vengano sezionati dal tessuto.

A differenza dei metodi precedenti utilizzati per la quantità di celle brdU positive25,26, questo protocollo descrive l'area delle cellule positive BrdU per cripta, che fornisce un modo rapido per quantificare le cellule proliferative all'interno di ogni cripta. Questa tecnica, tuttavia, può essere un po 'restrittiva in quanto richiede una conoscenza più profonda del software suggerito per la misurazione di questa tecnica. Una futura applicazione di questo protocollo potrebbe essere quella di creare un metodo più automatico generato per quantificare e misurare le cellule positive BrdU.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione illimitata del Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research e della Lundbeck Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

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Ricerca sul cancro Problema 147 piccole lesioni intestinali marcatori proliferanti BrdU profondità della cripta altezza del villus iperproliferazione compensativa
Endpoint importanti e marcatori proliferativi per valutare piccole lesioni intestinali e adattamento utilizzando un modello murino di mucosite indotta dalla chemioterapia
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Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

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