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Cancer Research

Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour établir les points de terminaison importants et les marqueurs proliérants des petites lésions intestinales et de l'hyperprolifération compensatoire utilisant un modèle de muqueuse chimiothérapie-induite. Nous démontrons la détection des cellules proliférantes utilisant un marqueur spécifique de cycle cellulaire et utilisant le petit poids intestinal, la profondeur de crypte, et la taille de villus comme points de terminaison.

Abstract

L'adaptation intestinale est le mécanisme compensatoire naturel qui se produit lorsque l'intestin est perdu en raison d'un traumatisme. Les réponses adaptatives, telles que la prolifération des cellules cryptiques et l'absorption accrue des nutriments, sont essentielles à la récupération, mais mal comprises. Il est essentiel de comprendre le mécanisme moléculaire qui sous-tend les réponses adaptatives pour faciliter l'identification des nutriments ou des médicaments afin d'améliorer l'adaptation. Différentes approches et modèles ont été décrits dans toute la littérature, mais une façon descriptive détaillée d'exécuter essentiellement les procédures est nécessaire pour obtenir des données reproductibles. Ici, nous décrivons une méthode pour estimer les points de terminaison importants et les marqueurs proliérants des petites lésions intestinales et de l'hyperprolifération compensatoire utilisant un modèle de muqueuse induite par la chimiothérapie chez la souris. Nous démontrons la détection des cellules proliférantes utilisant un marqueur spécifique de cycle cellulaire, aussi bien qu'utilisant le petit poids intestinal, la profondeur de crypte, et la taille de villus comme points de terminaison. Certaines des étapes critiques de la méthode décrite sont l'enlèvement et la pesée de l'intestin grêle et le système logiciel assez complexe suggéré pour la mesure de cette technique. Ces méthodes ont les avantages qu'elles ne prennent pas de temps, et qu'elles sont rentables et faciles à réaliser et à mesurer.

Introduction

L'adaptation intestinale est le mécanisme compensatoire naturel qui se produit lorsque l'intestin est perdu en raison de la maladie ou la chirurgie1,2. Après un traumatisme, l'intestin subit une réponse adaptative morphométrique et fonctionnelle, caractérisée par la prolifération des cellules de crypte et l'absorption accrue des nutriments3. Cette étape est essentielle dans la récupération, mais mal comprise. Les études expérimentales de la réponse adaptative intestinale se sont concentrées sur les changements se produisant après la petite résection d'entrailles chez les souris, les rats, et les porcs, mais comprenant le mécanisme moléculaire derrière la réponse adaptative dans d'autres genres de dommages (par exemple, chimique ou bactérienne) est crucial pour faciliter l'identification des nutriments ou des médicaments afin d'améliorer l'adaptation. Expérimentalement, différentes approches ont été employées pour décrire l'index moléculaire et cellulaire complexe de la petite pathologie intestinale, y compris la notation histopathologique et mesurant l'issue des dommages. Malgré cela, ce qui est absent de la littérature est une description détaillée de la façon d'effectuer les procédures qui sont nécessaires pour obtenir des données reproductibles. Lors de l'identification des facteurs impliqués dans l'adaptation, tels que les hormones intestinales, un modèle animal facile, à faible coût, et reproductible est justifiée et ici nous suggérons d'utiliser un modèle de muqueuse intestinale induite par la chimiothérapie (CIM).

L'un des critères d'évaluation les plus simples et les plus informatifs de la blessure et de l'adaptation est de mesurer la masse de l'intestin grêle (SI). Nous savons qu'une caractéristique de la muqueuse est l'apoptose des entéroocytes, l'atrophie de villus dépendante du temps et la mitose réduite. Par conséquent, l'examen de la morphologie intestinale est très pertinent dans les modèles précliniques4,5. Chez l'homme, une baisse de la citrulline plasmatique, un marqueur des entéroocytes fonctionnels, est en corrélation avec les scores de toxicité et les marqueurs inflammatoires6 en plus de la capacité absorptive7, suggérant que cet acide aminé est un excellent biomarqueur de Mucite. Citrulline peut être mesurée chez les souris et les rats, et a montré d'excellentes corrélations avec villus longueur8, survie crypte9, et la muqueuse induite par rayonnement10.

Un avantage majeur de la mesure de la citrulline plasmatique est la capacité de recueillir des mesures répétées d'un animal. Cependant, l'échantillonnage sanguin multiple chez la souris est limité à un volume sanguin total de 6 L/g/semaine et nécessite une anesthésie générale. Cela limite malheureusement également l'utilisation de mesures citrulline chez la souris. En outre, la mesure de la citrulline nécessite une chromatographie liquide de haute performance11,12, ce qui est coûteux et long. Récemment, nous avons montré que les niveaux de citrulline chez les souris sont en corrélation significative avec le poids de si (p lt; 0.001) (données non publiées), faisant de citrulline une mesure directe reflétant la masse d'entéroocytes. Une limitation à la mesure du poids SI est la nécessité pour les souris d'être sacrifiés et donc pas de mesures répétées dans la même souris sont possibles. Pourtant, la méthode offre la possibilité d'effectuer une variété d'autres analyses tissulaires dirigées vers la question de recherche, et ces faits peuvent vraisemblablement compenser l'utilisation supplémentaire des animaux. Nous suggérons donc d'utiliser le poids SI comme biomarqueur facile, peu coûteux et rapide des blessures et de l'adaptation chez la souris. Pour assurer la reproductibilité et la variation analytique acceptable, les intestins doivent être soigneusement enlevés de l'animal, rincés avec salin, vidés et séchés avant de peser. Dans cet article, nous montrons exactement comment cette procédure est effectuée.

Une autre caractéristique de la muqueuse est la perte des cellules proliférantes dans les cryptes et une hyperprolifération compensatoire au cours de la période régénérative3. Le marqueur cellulaire Ki67 a été fréquemment utilisé pour déterminer les cellules proliférantes rapides au moyen de l'immunohistochimie13. Même si Ki67 est un simple marqueur de prolifération, il a une tendance à l'imprécision car Ki67 est présent pendant toutes les phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2 et M)14. L'étiquetage spécifique est essentiel pour détecter les cellules réplitaires, c'est pourquoi nous suggérons l'incorporation in situ de 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), un analogue synthétique de la thymidine, car il est largement limité aux cellules de reproduction dans la phase S15. BrdU est injecté dans les animaux 150 minutes avant le sacrifice et les cellules peuvent être ensuite détectées avec immunohistochimie à l'aide d'anticorps spécifiques BrdU. Dans cet article de méthode, nous montrons exactement comment mesurer la zone des cellules immunopositives de BrdU dans une crypte utilisant un logiciel libre d'image.

Les changements morphologiques et fonctionnels sont souvent étudiés dans des modèles de mucosite induits par 5-FU, où l'adaptation intestinale est évaluée par la hauteur de villus et la profondeur de crypte. Au cours de cette étude, nous avons constaté que pendant la phase aigue de la muqueuse, qui est égale à la phase de blessure, la prolifération mesurée par l'incorporation de BrdU n'est pas corrélée avec la profondeur de crypte. En revanche, la profondeur de crypte est significativement corrélée avec la prolifération vue dans la phase de réparation de la muqueuse, 3 à 5 jours après l'induction. Ceci suggère que la phase aigue de la muqueuse n'est pas mesurable par la profondeur de crypte seule. Nous suggérons que lors de l'utilisation de la prolifération comme point final dans la phase aigue des souris muqueuses, l'incorporation brdU devrait de préférence être utilisée, mais lors de la quanticité de l'hyperprolifération dans le stade ultérieur au cours de la phase de régénération, la profondeur de la crypte est un raisonnable alternative à l'incorporation de BrdU. L'objectif de cette étude était de décrire ce modèle d'une manière qu'il peut être utilisé par tous les chercheurs, à la fois dans le domaine de l'oncologie, mais surtout les chercheurs ne connaissent pas les modèles de blessures intestinales.

Le modèle décrit peut être utilisé pour phénotype modèles transgéniques en fonction de la réponse adaptative en utilisant le poids corporel, le poids SI et la profondeur de la crypte comme points de terminaison. Par exemple, nous montrons ici comment nous avons utilisé le modèle de la muqueuse induite par 5-fluorouracil (5-FU) dans un modèle cellulaire knock-out avec une sécrétion de cellules L insuffisante16. Le peptide-1 de Glucagon-like (GLP-1) et le peptide glucagon-like-2 (GLP-2) sont des hormones intestinales co-sécrétées des cellules L entéroendocrines en réponse à la prise de nourriture17,18. GLP-2 est reconnu comme un facteur important pour la guérison intestinale, la régulation de l'apoptose muqueuse et l'amélioration de la fonction barrière de la SI19,20,21,22. Basé sur la littérature, nous avons supposé que les hormones endogènes sont essentielles pour l'hyperprolifération compensatoire se produisant dans la réponse adaptative après des dommages.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ont été menées conformément aux lignes directrices de la législation danoise régissant l'expérimentation animale (1987). Des études ont été réalisées avec la permission de l'Inspection danoise des expériences animales (2013-15-2934-00833) et du comité d'éthique local.

REMARQUE : Des souris femelles C57BL/6J (20 à 25 g) ont été obtenues et logées huit par cage dans une lumière standard de 12 h, un cycle sombre de 12 h avec un accès gratuit à l'eau et à la chow standard. Les animaux ont dû s'acclimater pendant une semaine avant le début des expériences.

1. Induction de mucosite à l'aide de 5-fluorouracil

  1. Obtenir 5-fluorouracil (5-FU) dans une solution de 50 mg/mL.
  2. Peser et enregistrer le poids corporel des souris. À partir du poids corporel, calculez la quantité de 5-FU pour l'injection (par exemple, 400 mg/kg).
  3. Préparer une seringue de 1 ml reliée à une aiguille de 27 G x 30 mm et remplir la seringue avec la quantité calculée de 5-FU pour l'injection.
  4. Retenez la souris par la méthode des éraflures. Pour ce faire, saisissez la base de la queue d'une main et placez-la sur une surface qui accroche les orteils, comme un couvercle de barre métallique. Tout en positionnant la queue d'une main, tenez le cou avec l'autre main.
  5. Placez fermement le corps de la souris sur une main en étendant l'index et le pouce aussi loin que possible. Placez la queue entre les doigts de cette même main pour fixer la souris.
  6. Tout en maintenant la souris dans une poignée ferme mais douce, exposez le côté ventral de la souris et insérez l'aiguille dans la cavité intrapéritonéale sur le quadrant inférieur droit ou gauche de l'abdomen. Aspirer pour assurer un bon placement et injecter le 400 mg/kg 5-FU.

2. Collection de tissus

  1. Anesthésiez la souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (100/10 mg/kg) diluée dans une solution saline (0,9 % De NaCl). Surveillez la profondeur de l'anesthésie en observant le réflexe de sevrage de pincement.
    REMARQUE : L'anesthésie est une anesthésie non-récupération.
  2. Enregistrez le poids de la souris anesthésiée.
  3. Placez la souris en position de supine et effectuez une laparotomie pour exposer la cavité abdominale, suivie d'une incision de la cavité thoracique pour introduire le pneumothorax.
  4. À l'aide de ciseaux, sacrifiez l'animal en coupant le diaphragme.
  5. Retirer l'intestin grêle. Couper supérieur au pylorus, retirer soigneusement l'intestin grêle de la carcasse jusqu'à ce que le cecum soit atteint et faire une coupe juste avant le cecum.
  6. À l'aide de forceps, serrer doucement le lumen proximal fermé. À l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille de 25 G attachée, rincer l'intestin grêle avec de la saline pour enlever les excréments.
  7. Retirez délicatement le salin du lumen intestinal avec des instruments chirurgicaux.
  8. Placer l'intestin grêle sur du papier buvard propre pour enlever soigneusement l'excès de salin.
  9. Enregistrez le poids du tissu rincé.
  10. Calculez le petit poids intestinal en pourcentage du poids corporel.

3. Histologie de l'intestin grêle

  1. Préparation des tissus
    1. Dans une hotte de fumée, utilisez des ciseaux pour couper des sections de 3 cm du tissu intestinal rincé de chaque souris du duodénum, du jejunum et de l'iléum et fixez les sections en 10 % de formaline pendant 24 h à température ambiante.
      REMARQUE : Le volume fixatif doit être 5 à 10 fois le volume de tissu.
    2. Transférer le tissu fixe sur une planche à découper.
    3. À l'aide d'un scalpel, couper le tissu à environ 1 cm et le transférer dans une cassette d'intégration.
      REMARQUE : La cassette doit être étiquetée avec l'identification de l'échantillon (ID) au crayon.
    4. Immerger la cassette dans 70 % d'éthanol et conserver à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit traité plus loin.
  2. Incorporation de tissu dans la paraffine
    1. Déshydrater le tissu en plaçant dans des solutions d'alcool ascendantes. Placez la cassette dans 70 % d'éthanol pour 1 h, suivie de 80 % d'éthanol pour 1 h, 95 % d'éthanol pour 1 h et 100 % d'éthanol pour 1,5 h. Transférer la cassette de 100 % d'éthanol à xylène pendant 1,5 h.
    2. Immerger la cassette avec de la cire de paraffine chauffée entre 58 et 60 oC. Utilisez des forceps pour positionner le tissu dans une orientation transversale et laisser les blocs refroidir plus de 24 h jusqu'à consistance solide.
  3. Découpage des tissus à l'aide d'un microtome
    1. Placer le bloc, le tissu face vers le bas sur la glace pendant 5 min. À l'aide d'un microtome, couper les blocs de paraffine à une épaisseur de 10 à 30 m pour exposer la surface du tissu.
    2. Couper les sections transversales du bloc tissulaire entre 3 et 5 m, en faisant des sections transversales du duodénum, du jejunum et de l'iléum.
    3. Placer le ruban de paraffine dans un bain d'eau situé entre 40 et 45 oC. Utilisez des forceps pour séparer les sections.
    4. Utilisez des lames de microscope pour ramasser les sections de l'eau.
    5. Sécher les lames à l'air pendant 30 min avant de les tacher.
      REMARQUE : Pour le stockage sur une plus longue période de temps, conserver les glissières dans un réfrigérateur.
  4. Coloration hématoxylin-éosine de tissu
    1. Placez les lames de microscope dans un berceau d'histologie. Déparaffiniser les glissières dans une armoire chauffante fixée à 60 oC pendant 60 min.
      REMARQUE : Les glissières directement du réfrigérateur doivent être laissées pour atteindre la température ambiante avant de les placer dans une armoire chauffante.
    2. Dans le capot de fumée, réhydrater le tissu en 3 changements d'un agent de compensation (Table of Materials), faire 20 trempettes dans le premier pot d'agent de compensation, puis les laisser reposer pendant 7 à 8 min dans chacun des deux pots supplémentaires agent de compensation. Transférez les diapositives à des solutions d'alcool descendantes, commencez par 3 changements de 99 % d'éthanol, suivis de 2 changements de 96 % d'éthanol et 70 % d'éthanol. Faire un minimum de 20 trempettes dans chaque bocal. Transférer à l'eau courante et laisser reposer les toboggans pendant 5 min.
    3. Immerger les diapositives dans l'hématoxylin filtré meyer pendant 1 min.
    4. Laver les échantillons dans l'eau courante du robinet pendant 5 min.
    5. Immerger les sections dans la tache d'éosine pendant 1/2 min, puis rincer à l'eau du robinet.
    6. Déshydrater le tissu en plaçant dans des solutions d'alcool ascendantes. Commencez avec 70 % d'éthanol, suivi de 96 % d'éthanol, 96 % d'éthanol et 4 fois 99 % d'éthanol. Faire un minimum de 20 trempettes dans chaque bocal, et laisser le berceau se tenir dans 99% d'éthanol jusqu'à ce qu'ils soient montés.
    7. Le mont couvre en appliquant une petite quantité du support de montage à la surface des glissières. Placez la couverture sur le dessus du support de montage sans créer de bulles sous le bordereau. Laisser sécher pendant 24 h.
    8. Examinez le tissu à l'aide d'un microscope léger relié à une caméra pour obtenir des photos histologiques. Utilisez un objectif 10x pour prendre des instantanés jusqu'à ce qu'une couverture complète de la diapositive tissulaire soit atteinte.

4. Mesure de la profondeur de la crypte et/ou de la hauteur du villus

  1. Téléchargez et installez le logiciel d'analyse (c.-à-d. Zen Lite, Table of Materials).
  2. Ouvrez l'image dans le logiciel et connectez-vous à la caméra. Prenez des instantanés en mode caméra avec objectif 20x.
  3. En mode de traitement, ouvrez l'instantané.
  4. Pour mesurer la profondeur de la crypte : dans la vue 2D,sélectionnez l'outil de ligne à partir de l'onglet graphique. Choisissez une crypte bien orientée et commencez la ligne au bas d'un villus et finissez au bas de la crypte. Répétez cette action pour 20 cryptes bien orientées (figuresupplémentaire 1).
  5. Pour mesurer la hauteur des villus : dans la vue 2D,sélectionnez l'outil de ligne à partir de l'onglet graphique. Choisissez un villus bien orienté et commencez la ligne à la fin de la projection lumineuse et terminez au début de la crypte. Répétez cette action pour 20 villosités bien orientées (figuresupplémentaire 1).
  6. Passez de la vue 2D à la vue Mesure pour afficher les mesures.
  7. Exporter les mesures et calculer la moyenne de la profondeur de la crypte et de la hauteur du villus.

5. Quantification BrdU (prolifération) par immunohistochimie

  1. Injection de la solution BrdU
    1. Peser et enregistrer le poids corporel des souris.
    2. Dans une hotte de fumée, préparer une quantité représentative de 0,5 % w/v bromodeoxyuridine (BrdU) solution en phosphate tamponné saline (PBS).
    3. Dans le capot de fumée, injecter 50 mg/kg de BrdU par injection intrapéritonéale.
      REMARQUE : Pour s'assurer que chaque souris est euthanasiée à exactement 150 min après l'injection de BrdU, injectez chaque souris individuelle successivement avec un intervalle de 10 à 20 min entre les deux afin d'effectuer correctement la collecte des tissus.
    4. Enregistrez l'heure de l'injection.
    5. Attendez 150 min, puis anesthésiez les souris et collectez le tissu tel que décrit dans les étapes 2.1-2.7. Effectuer l'immunohistochimie brdU tel que décrit dans la section 5.2.
  2. Immunohistochimie BrdU
    1. Préparer le tissu tel que décrit dans les étapes 3.1.1-3.3.4.
    2. Pour la récupération d'antigène, placez un berceau de diapositives avec les sections dans un bocal d'histologie en verre et remplissez-le avec le tampon EDTA (pH 9) dans un four à micro-ondes pendant 1 min à 750 W suivi de 9 min à 350 W. Cycle de répétition.
      REMARQUE : Assurez-vous que le tissu ne se dessèche pas, ce qui pourrait nécessiter l'ajout d'un tampon supplémentaire dans les bocaux entre le chauffage.
    3. Laver les sections 2 à 3 fois dans un tampon salin tampon tris tampon né sur 20 (TBS-T) pendant 3 min chacune.
    4. Appliquer 5 gouttes de bloc de peroxyde (Table of Materials) pendant 10 à 15 min à température ambiante pour bloquer l'activité endogène de peroxidase. Laver les sections 2 à 3 fois dans le tampon TBS-T pendant 3 min chacune.
    5. Appliquer 5 gouttes de tampon de bloc de rongeurs (Table des matériaux) pendant 30 min à température ambiante, pour bloquer la liaison non spécifique. Laver les sections 2 à 3 fois dans le tampon TBS-T pendant 3 min chacune.
    6. Incuber les sections avec un anticorps anti-BrdU de souris monoclonale dilué 1:500 pour 1 h à température ambiante. Laver les sections 2 à 3 fois dans le tampon TBS-T pendant 3 min chacune.
    7. Visualisez l'immunopositivité à l'aide de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en appliquant 5 gouttes de peroxidase de raifort à chaque diapositive et incuber pendant 15 min à température ambiante. Transférer les sections sur une hotte à fumée, ajouter 150 L de DAB et incuber pendant 5 min.
      REMARQUE : Portez toujours des gants lorsque vous manipulez le DAB et éliminez les déchets de façon appropriée.
    8. Rincer les sections dans l'eau déionisée.
    9. Déshydrater le tissu et monter un bordereau tel que décrit dans les étapes 3.4.6 et 3.4.7.
  3. Visualisation des immunoréactions
    1. Visualisez l'échantillon de tissu à l'aide d'un microscope léger relié à une caméra.
    2. Utilisez le logiciel d'analyse pour obtenir des images au microscope en utilisant un objectif 20x de toutes les sections et enregistrer des fichiers dans le . Format JPG.
    3. Prenez un instantané d'un micromètre de scène à l'aide d'un objectif 20x, qui sera utilisé comme un outil d'étalonnage dans le logiciel ImageJ.
  4. Mesure de la zone des cellules immunoréactives BrdU
    1. Installer le logiciel ImageJ (Table of Materials).
    2. Attribuer l'échelle à une image dans ImageJ : Ouvrez l'image micrométrique de scène à l'aide du fichier ImageJ (fr) Ouvrez la commande du menu. Sélectionnez l'outil de sélection en ligne droite.
    3. Sélectionnez l'outil droit et tracez une ligne droite sur l'image micrométrique pour définir une distance connue.
    4. Sélectionnez L'échelle de définir dans le menu Analyse.
    5. Entrez une valeur dans la case Distance connue et définissez l'unité de longueur dans la boîte Unité de longueur. Sélectionnez Global afin que cet étalonnage s'applique à toutes les images qui sont ouvertes dans cette session ImageJ.
    6. Ouvrez une image d'intérêt à l'aide du fichier ImageJ ( Commande de menu ouverte pour mesurer la zone des cellules immunoréactives BrdU par crypte.
    7. Définir les graphiques de couleur à 8 bits sous le menu Image/Type.
    8. Augmentez le contraste de l'image sous Le contraste Process/Enhance et fixez les pixels saturés à 0,4 %.
    9. Appliquer un seuil à l'image pour segmenter l'immunopositivité. Sélectionnez Image/Ajuster sous le menu, puis seuil et sélectionnez la couleur rouge (zone sombre indiquée en rouge). Choisissez un seuil d'environ 10 à 20 % en déplaçant la barre de seuil.
      REMARQUE: Choisissez un seuil qui inclut toutes les cellules positives BrdU avec le moins de fond possible. Le pourcentage choisi devrait s'appliquer à toutes les sections.
    10. Choisissez une crypte bien orientée, c'est-à-dire une crypte complète à partir de tissus intacts, et sélectionnez l'outil de sélection de la main libre pour marquer la zone qui l'entoure.
    11. Pour mesurer la zone de seuil, sélectionnez l'onglet Analyse, suivi des particules D'Analyse. Dans la fenêtre de particules Analyse, définiz la taille à 20-infini, cliquez sur les unités de pixelde boîte , définicircularité à 0.00 -1.00, et définiz Afficher les contours. Cliquez sur les boîtes Afficher les résultats, résumer, et inclure des trous.
      REMARQUE : Les valeurs des cellules positives BrdU sont automatiquement générées dans une fenêtre de résultat, montrant les mesures individuelles pour chaque cellule positive brdU. En outre, une fenêtre de synthèse est générée automatiquement, montrant le nombre de comptes, la superficie totale, la taille moyenne et le pourcentage de la surface avec des cellules positives BrdU.
    12. Répétez les étapes 5.4.10 et 5.4.11 pour mesurer une nouvelle crypte. Les résultats de toutes les cryptes mesurées seront affichés dans la fenêtre Résumé.

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Representative Results

Dans la première expérience, nous avons induit la mucosite chez les souris au jour 0 et sacrifié un groupe de souris chaque jour pendant 5 jours consécutifs. En mesurant le poids de SI, nous avons constaté que ce paramètre a diminué du jour 2 au jour 4 suggérant une perte dans la masse d'entéroocyte. Nous avons également constaté qu'au jour 5, le poids de l'IS n'était pas significativement différent du jour 0 (souris non traitées) (Figure 1). La prolifération mesurée par l'incorporation de BrdU a été presque abolie au premier et au deuxième jour, mais au jour 4 et au jour 5, il y a eu environ quatre fois et cinq fois plus de prolifération, respectivement (figure 2). Cette hyperprolifération a également été illustrée lors de la mesure de la profondeur de la crypte (Figure 3). Ce qui n'est pas illustré par la mesure de la profondeur de la crypte est la perte dans les cellules proliférantes au jour 1 et au jour 2, où la profondeur de la crypte a été réduite d'environ 13 %, mais n'était pas significativement différente des souris en bonne santé. Nous pourrions montrer que, dans la phase régénératrice de la muqueuse, il y avait une forte corrélation entre l'incorporation de BrdU et la profondeur de la crypte, mais cela ne comptait pas pour la phase aigue indiquant que la profondeur de la crypte comme point de terminaison pourrait ne pas convenir dans la phase mucosie (Figure 4).

Dans la deuxième étude, nous avons examiné mucostis dans notre modèle transgénique de souris avec la sécrétion insuffisante de cellules de L. Les souris présentant des GLP-1 et GLP-2 déficients ont montré une perte grave de poids corporel (BW) et une diminution du poids si dans la phase de récupération, qui était très significative par rapport au type sauvage (WT) 5-FU souris (p lt; 0.01) (Figure 5A,B). En outre, les souris transgéniques n'ont pas montré l'hyperprolifération compensatoire ; les cryptes étaient significativement plus courtes que dans les souris de WT et les contrôles sains. Contrairement à cela, les souris WT ont montré une augmentation de la profondeur de la crypte comme un signe d'hyperprolifération (Figure 5C).

Figure 1
Figure 1 : Petit poids intestinal. Les souris ont été sacrifiées 1 à 5 jours après injection de 5-FU au jour 0 et le poids intestinal a été mesuré comme décrit. Les résultats sont présentés comme une erreur moyenne de la moyenne (SEM). n 13. Ce chiffre a été modifié à partir de Hytting-Andreasen et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Cellules immunopositives BrdU par crypte pour le duodénum, le jejunum et l'ilum de l'IS. Les souris ont été sacrifiées 1 à 5 jours après injection de 5-FU au jour 0 et l'incorporation de BrdU a été quantifiée par immunohistochimie comme décrit. Les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la SEM. n ' 13. lt; 0,05, p 'lt; 0,001 par rapport au jour 0 (analyse de la variance [ANOVA] suivie du test de comparaison multiple de Dunnett). p lt; 0,001 par rapport au jour 0 (ANOVA suivi du test de comparaison multiple de Dunnett). Ce chiffre a été modifié à partir de Hytting-Andreasen et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Mesure de la profondeur de la crypte. Les souris ont été sacrifiées 1 à 5 jours après injection de 5-FU au jour 0 et la profondeur de crypte a été mesurée comme décrit. Les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la SEM. n ' 13. lt; 0,05, 0,01 p lt; 0,001 par rapport au jour 0 (ANOVA suivi du test de comparaison multiple du Dunnett). Ce chiffre a été modifié à partir de Hytting-Andreasen et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Corrélation de la profondeur de la crypte et du BrdU. La profondeur de la crypte (en duodénum, jejunum et ileum) est corrélée à l'incorporation de BrdU à chaque jour de sacrifice à l'aide du test de corrélation Pearson à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Les souris déficientes GLP-1 et GLP-2 ne se régénèrent pas après une muqueuseaigue. (A) Changement de BW (%), (B) poids SI (g), et (C) profondeur de crypte dans l'ilém (m). Les résultats sont présentés comme des souris moyennes , SEM. Tg et transgéniques; WT - souris de type sauvage; 5-FU 5-fluorouracil. n ' 4 à 8. p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0,01, p 'lt; 0.001 par rapport à un contrôle sain (WT saline), un 'p 'lt; 0.05, aa 'p 'lt; 0.01, aaa 'p 'lt; 0.001 comparé à WT 5-FU (aNOVA bidirectionnelle suivie par Bonferroni test de comparaison multiple [BW] ou ANOVA suivi par Duparis multiple Comparis à l'essai). Ce chiffre a été modifié à partir de Hytting-Andreasen et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Petit tissu intestinal avant l'induction de la muqueuse, pendant la phase aigue et la phase de récupération dela muqueuse. (A) Haemotoxylin et eosin (H et E) coloration et (D) BrdU coloration chez les souris non traitées. La ligne pointillée noire du panneau A illustre une crypte bien orientée, tandis que la ligne verte pointillée démontre un villus bien orienté. (B) Coloration h et E et (E) coloration BrdU pendant la phase aigue de la muqueuse. (C) coloration de H et E et (F) coloration brdU pendant la phase de récupération après l'induction de la muqueuse. Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ici, nous démontrons une méthode largement accessible pour étudier les blessures et la régénération si dans un modèle de souris. Il existe une grande variété de modèles animaux précliniques de lésions intestinales, mais il est essentiel que nous comprenions que chaque modèle est unique et que les critères d'évaluation doivent être appropriés pour répondre à la question de recherche. Ce modèle est excellent pour étudier la réponse adaptative aux blessures, mais les critères d'évaluation doivent être modifiés lors de l'utilisation du modèle comme modèle préclinique de muqueuse. Cependant, la traduction des modèles animaux aux patients est un défi23. Nos critères d'évaluation suggérés du poids et de la prolifération de si devraient être limités à l'étude de la réponse adaptative seulement. L'étude des facteurs endogènes nécessite souvent l'utilisation de souris transgéniques, et même si la petite résection intestinale est possible chez la souris1, ce modèle pourrait être une alternative pour éviter la mortalité post-opératoire. Lors de l'application de ce modèle à des souris transgéniques, il est important de surveiller attentivement les souris et de surveiller leur poids tous les jours. Au cours de cette étude, certaines des souris ont connu une perte de poids allant jusqu'à 30%, ce qui est assez substantiel. Pour éviter une mortalité élevée chez les phénotypes sensibles, nous suggérons d'effectuer des études pilotes chez des souris transgéniques, car l'ajustement de la dose pourrait être nécessaire.

Une étape critique dans la méthode décrite est l'enlèvement et la pesée de l'IS. Il est important que l'enlèvement et la manipulation soient effectués de la même manière et par le même chercheur à chaque fois afin d'éviter de grandes variations d'inter-points.

La cohérence de la sélection de crypte et de villus est importante pour éviter la variance et le biais lors de la mesure de la profondeur de la crypte et de la hauteur des villus. Lors de l'intégration du tissu dans la paraffine, les intestins sont positionnés en position verticale pour faire des coupes transversales, augmentant ainsi la possibilité de villosités et de cryptes intactes. Après la coupe du tissu, une crypte bien orientée et/ou villus est sélectionnée. La sélection est basée sur la visualisation complète de toute la crypte et des villus dans le même plan et la présence de frontières claires de cellules dans la crypte et le villus. Une limitation à cette méthode est l'approche quelque peu subjective lors de la sélection d'une crypte bien orientée depuis la sélection d'une crypte bien orientée et / ou villi est faite après la coupe du tissu. Une étude précédente24 a présenté une méthode alternative pour surmonter cette limitation, où ils utilisent la microdissection. Dans cette méthode, les villosités et les cryptes sont sélectionnées lors de l'observation au microscope, avant que le tissu ne soit coupé, ce qui permet de s'assurer qu'une crypte et des villosités intactes sont disséquées du tissu.

Contrairement aux méthodes précédentes utilisées pour la quantité des cellules positives BrdU25,26, ce protocole décrit la zone des cellules positives BrdU par crypte, qui fournit un moyen rapide de quantifier les cellules proliférantes dans chaque crypte. Cette technique, cependant, peut être quelque peu restrictive car elle exige une connaissance plus profonde du logiciel suggéré pour la mesure de cette technique. Une application future de ce protocole pourrait être de créer une méthode générée plus automatique pour quantifier et mesurer les cellules positives BrdU.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention sans restriction du Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research et de la Fondation Lundbeck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

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References

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Recherche sur le cancer numéro 147 petites lésions intestinales marqueurs proliérants BrdU profondeur de crypte hauteur de villus hyperprolifération compensatoire
Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie
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Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

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