Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת נקודות קצה חשובות וסמנים מתרבים של נזקי מעיים קטנים ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה. אנו להדגים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות מחזור התא סמן מסוים באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה.

Abstract

עיבוד המעיים הוא מנגנון פיצוי טבעי המתרחשת כאשר המעי אובד עקב טראומה. התגובות אדפטיבית, כגון הפצת תאים קריפטה וספיגת מזון מוגבר, הם קריטיים התאוששות, עדיין מובן בצורה גרועה. הבנת המנגנון המולקולרי מאחורי התגובות אדפטיבית חיונית כדי להקל על זיהוי של חומרים מזינים או תרופות כדי לשפר את ההסתגלות. במהלך הספרות תוארו גישות ומודלים שונים, אך יש צורך באופן תיאורי מפורט לבצע את ההליכים כדי להשיג נתונים מתספרים. כאן, אנו מתארים שיטה להערכת נקודות קצה חשוב וסמנים מתרבים של פציעת מעיים קטנה ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה בעכברים. אנו מדגימים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות סמן מחזור התא מסוים, כמו גם באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה. חלק מהשלבים הקריטיים בשיטה המתוארת הם הסרת ושקילה של המעי הדק ומערכת התוכנה המורכבת למדי המוצעת למדידה של טכניקה זו. לשיטות אלה יש את היתרונות שהם אינם צורכים זמן, וכי הם חסכוניים וקל לבצע ולמדוד.

Introduction

עיבוד המעיים הוא מנגנון פיצוי טבעי המתרחשת כאשר המעי אובד עקב מחלה או ניתוח1,2. לאחר טראומה, הבטן עוברת תגובה אדפטיבית ופונקציונלית הסתגלות, המאופיינת על ידי התפשטות התא קריפטה וספיגת מזון מוגבר3. שלב זה הוא קריטי בהחלמה, אך מובן בצורה עלובה. מחקרים ניסיוניים של תגובת המעי האדפטיבית התמקדו השינויים המתרחשים לאחר כריתת המעי הקטן עכברים, חולדות, וחזירים, אך הבנת המנגנון המולקולרי מאחורי התגובה האדפטיבית סוגים אחרים של פציעות (g., כימיה או חיידקי) הוא חיוני כדי להקל על זיהוי של חומרים מזינים או תרופות כדי לשפר את ההסתגלות. בעבר, השתמשו בגישות שונות לתיאור האינדקס המולקולרי והסלולארי המורכב של מחלות המעי הקטנות, כולל הניקוד החילוגי ומדידת תוצאת הפציעה. למרות זאת, מה שנעדר מהספרות הוא תיאור מפורט של האופן שבו יש לבצע את ההליכים הנחוצים להשגת נתונים שאינם מופיעים. כאשר מזהים גורמים המעורבים בהסתגלות, כגון הורמוני בטן, עלות קלה, נמוכה, ומודל בעלי חיים הנקרא מוצדקת וכאן אנו מציעים באמצעות מודל של mucositis מעיים כימותרפיה (CIM).

אחת מנקודות הקצה הפשוטות והאינפורמטיביות ביותר של פגיעות והסתגלות היא למדוד את המסה של המעי הדק (SI). אנו יודעים כי סימן ההיכר של mucositis הוא אפופטוזיס של בידור, ניוון ויליוס תלויי זמן והופחת מיטוזיס. לפיכך, בחינת מורפולוגיה של המעיים רלוונטית במידה רבה למודלים קליניים4,5. בבני אדם, ירידה בחוט הפלזמה, סמן של התפקוד התפקודי, התואם לתוצאות רעילות וסמנים דלקתיים6 בנוסף לקיבולת הספיגה7, מציע שחומצת אמינו זו היא ביוארנקר מעולה של mucositis. ניתן למדוד את שורת העכבר בשני עכברים וחולדות, והוא הראה קשרים מצוינים עם אורך ליה8, קריפטה הישרדות9, ו המושרה קרינה mucositis10.

היתרון העיקרי של מדידת קו הפלזמה הוא היכולת לאסוף מדידות חוזרות ונשנות מבעל חיים אחד. עם זאת, דגימות דם מרובות בעכברים מוגבל נפח הדם הכולל של 6 μL/g/שבוע דורש הרדמה כללית. זה למרבה הצער גם מגביל את השימוש במדידות הסיטרולקו בעכברים. יתר על כן, המדידה של הסירולקו דורשת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים11,12, שהיא יקרה וגוזלת זמן. לאחרונה, הראינו כי רמות מצודות בעכברים להתאים באופן משמעותי עם משקל SI (p < 0.001) (נתונים שלא פורסמו), הפיכת קו הסירוסי למדידה ישירה המשקף המסה בידור. מגבלה למדידת משקל SI היא הצורך להקריב את העכברים ולכן אין מדידות חוזרות בתוך אותו עכבר אפשריות. עדיין השיטה מספקת את האפשרות לבצע מגוון של ניתוחי רקמות אחרים המכוונים לשאלת המחקר, ועובדות אלה יכולות לפצות על שימוש נוסף בבעלי חיים. אנו, לכן, מציעים באמצעות משקל SI קל, בעלות נמוכה, ביואריקר מהיר של פציעה והסתגלות בעכברים. כדי להבטיח שינוי וריאציה אנליטית מקובלת, יש להסיר בזהירות את המעיים מהחיה, הסמיקה בתמיסת מלח, מרוקנת ומיובשת לפני שמשקלם. במאמר זה, אנו מראים בדיוק כיצד הליך זה מבוצע.

עוד סימן ההיכר של mucositis הוא אובדן של תאים מתרבים בקריפטטים ו היפרהיפרציה פיצוי במהלך תקופת ההתחדשות3. הסמן הסלולר Ki67 השתמשו לעתים קרובות כדי לקבוע תאים מהירים מתרבים באמצעות אימונוהיסטוכימיה13. למרות Ki67 הוא סמן פשוט של התפשטות, יש לו נטייה שלא כמו Ki67 קיים במהלך כל השלבים הפעילים של מחזור התא (G1, S, G2, ו M)14. תוויות ספציפיות חיוני כדי לזהות תאים משכפלים, ולכן אנו מציעים התאגדות באתרו של 5-bromo-2'-deoxyuridine (Bromo), אנלוגי סינתטי של thymidine, כפי שהוא מוגבל ברובו לשכפול תאים ב-S-שלב15. BrdU מוזרק בעלי חיים 150 דקות לפני הקרבת ותאים יכול להיות מזוהה לאחר מכן עם אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים ספציפיים BrdU. במאמר שיטה זה, אנו מראים בדיוק כיצד למדוד את האזור של תאים אימונוdu החיסונית בתוך קריפטה באמצעות תוכנה חינם תמונה.

מורפולוגית ושינויים פונקציונליים נלמדים לעתים קרובות ב 5-פו המושרה מודלים mucositis, שבו הסתגלות המעיים מוערך על ידי הגובה והמסתורין עומק קריפטה. במהלך מחקר זה, מצאנו כי במהלך שלב אקוטי של mucositis, אשר שווה לשלב הפציעה, התפשטות שנמדד על ידי התאגדות BrdU אינו מתואם עם עומק הקריפטה. בניגוד לזה, עומק קריפטה בקורלציה משמעותית עם התפשטות לראות בשלב התיקון של mucositis, 3 כדי 5 ימים לאחר האינדוקציה. זה מרמז כי השלב האקוטי של mucositis אינו מדיד על ידי עומק קריפטה לבד. אנו מציעים כי בעת שימוש בהפצה כנקודת קצה בשלב אקוטי של עכברים mucositis, התאגדות BrdU צריך לשמש בעדיפות, אבל כאשר כימות התפשטות בשלב מאוחר יותר במהלך שלב ההתחדשות, עומק הקריפטה הוא הגיוני חלופה להתאגדות BrdU. המטרה של מחקר זה היה לתאר את המודל הזה באופן שבו זה יכול לשמש את כל החוקרים, הן בתחום האונקולוגיה, אבל במיוחד חוקרים לא מכירים מודלים לפציעה במעיים.

המודל המתואר ניתן להשתמש כדי פניטיפ מודלים על פי התגובה האדפטיבית באמצעות משקל הגוף, משקל SI ועומק קריפטה כמו נקודות קצה. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד השתמשנו המודל של 5-fluorouracil (5-FU) המושרה mucositis במודל הסלולר להוציא את התמונה עם הפרשה הנייד מספיק16. Glucagon כמו פפטיד-1 (glp-1) ו glucagon כמו פפטיד-2 (glp-2) הם הורמוני מעיים שכונתיות מתוך התאים האנדוקריניים L-האנדוקרינית בתגובה לצריכת מזון17,18. Glp-2 מוכר כגורם חשוב לריפוי במעיים, התקנה של אפופטוזיס רירית ושיפור תפקוד המכשול של SI19,20,21,22. בהתבסס על הספרות, אנו שיערו כי הורמונים אנדוגניים חיוניים לפיצוי היפרההפצה המתרחשים תגובה אדפטיבית לאחר הפציעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות בוצעו בהתאם להנחיות החקיקה הדנית המסדירים ניסויים בבעלי חיים (1987). מחקרים בוצעו בהיתר מניסויי בעלי החיים הדני Inspectorate (2013-15-2934-00833) והועדה האתית המקומית.

הערה: נשים C57BL/6J (~ 20-25 גרם) הושגו ושוכנו שמונה לכל כלוב באור הסטנדרטי 12 h, 12 h מחזור כהה עם גישה חופשית מים ואוכל רגיל. בעלי חיים נותרו להיות מנוצלים למשך שבוע לפני תחילת הניסויים.

1. אינדוקציה של mucositis באמצעות 5-fluorouracil

  1. להשיג 5-fluorouracil (5-פו) בפתרון 50 mg/mL.
  2. שוקלים ומקליטים את משקל הגוף של העכברים. ממשקל הגוף, לחשב את כמות 5-פו עבור הזרקה (למשל, 400 mg/ק"ג).
  3. להכין מזרק 1 מ ל מחובר 27 G x 30 מ"מ מחט ולמלא את המזרק עם כמות מחושבת של 5-פו להזרקה.
  4. לרסן את העכבר על ידי שיטת הגביל. כדי לעשות זאת, לתפוס את הבסיס של הזנב עם יד אחת ולמקם אותו על משטח מרתק הבוהן, כגון מכסה בר חוט. בזמן שאתם ממקמים את הזנב ביד אחת, החזיקו את העורף עם היד השנייה.
  5. מיקום יציב של הגוף של העכבר על יד אחת על ידי הרחבת האצבע ואת האגודל בחזרה ככל האפשר. מניחים את הזנב בין האצבעות של יד זו כדי לאבטח את העכבר.
  6. תוך שמירה על העכבר באחיזה המשרד אך עדין, לחשוף את הצד הגחוני של העכבר ולהכניס את המחט לתוך החלל הפנימי הצפק על הרבע הימני התחתון או השמאלי של הבטן. מנושף כדי להבטיח השמה הנכון ולהזריק 400 mg/ק"ג 5-FU.

2. אוסף רקמות

  1. מורדם העכבר עם הזרקה תוך הצפק של קטמין/xylazine (100/10 מ"ג/ק"ג) מדולל בתמיסה מלוחים (0.9% הנאל). לעקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות רפלקס הנסיגה צביטה.
    הערה: ההרדמה היא הרדמה ללא שחזור.
  2. . הקלט את משקלו של העכבר המשמורדם
  3. מניחים את העכבר במצב פרקדן ולבצע כריתת אונה כדי לחשוף את חלל הבטן, ואחריו חתך של חלל החזה להציג את החזה האוויר.
  4. באמצעות מספריים, להקריב את החיה על ידי גזירה לפתוח את הסרעפת.
  5. להסיר את המעי הדק. גזור מעולה pylorus, בזהירות למשוך את המעי הדק הרחק מן הגווייה עד מעי הוא הגיע ולעשות חתך ממש לפני מעי.
  6. מלחציים בעדינות. באמצעות מזרק 1 mL עם מחט 25 גרם מוצמד, ריקון המעי הדק עם תמיסת מלח כדי להסיר את הצואה.
  7. להסיר בעדינות את תמיסת המלח מתוך לומן המעי עם כלי ניתוח.
  8. מניחים את המעי הדק על נייר לחסום נקי כדי בזהירות להסיר תמיסת מלח עודף.
  9. . להקליט את המשקל של הרקמה הסמוק
  10. חישוב משקל המעי הקטן הסמוק כאחוז ממשקל הגוף.

3. היסטולוגיה המעי הדק

  1. הכנת רקמה
    1. בתוך מכסה המנוע, להשתמש במספריים לחתוך 3 מקטעים ס מ של רקמת המעי הסמוק מכל עכבר מתוך התריסריון, מעי ו מעי ומקטעי התקבע ב 10% פורמלין עבור 24 h בטמפרטורת החדר.
      הערה: נפח התיקונים אמור להיות 5-10 פעמים של נפח הרקמה.
    2. העבר את הרקמה הקבועה לקרש חיתוך.
    3. באמצעות אזמל, לקצץ את הרקמה כ 1 ס מ ולהעביר לתוך קלטת הטבעה.
      הערה: יש לציין את הקלטת באמצעות זיהוי לדוגמה (ID) בעיפרון.
    4. הטבול את הקלטת ב-70% אתנול ואחסן ב -4 ° c עד לעיבוד נוסף.
  2. הטמעת רקמות בפרפין
    1. מייבשים את הרקמה על ידי הצבת פתרונות לאלכוהול עולים. מניחים את הקלטת ב 70% אתנול עבור 1 h, ואחריו 80% אתנול עבור 1 h, 95% אתנול עבור 1 h ו 100% אתנול עבור 1.5 h. להעביר את הקלטת מ 100% אתנול כדי קסילן עבור 1.5 h.
    2. לטבול את הקלטת עם פרפין שעווה מחומם בין 58 ל 60 ° c. מלקחיים להשתמש כדי למקם את הרקמה בכיוון רוחבי ולהשאיר את אבני להתקרר יותר 24 h עד מוצק.
  3. רקמת חיתוך באמצעות מיקרוטומה
    1. בלוק, הפנים למטה על הקרח במשך 5 דקות. באמצעות microtome, לקצץ את גושי פרפין בעובי של 10-30 יקרומטר לחשוף את משטח הרקמה.
    2. גזור חתך צולבות של בלוק הרקמה בין 3-5 μm, ביצוע קטעים רוחבי מן התריסריון, מעי ו ileum.
    3. מניחים סרט פרפין באמבט מים בין 40 ל-45 ° c. השתמש מלקחיים כדי להפריד את הסעיפים.
    4. השתמש שקופיות מיקרוסקופ לאסוף את החלקים מן המים.
    5. האוויר יבש את השקופיות עבור 30 דקות לפני הצביעת.
      הערה: לאחסון במשך פרק זמן ארוך יותר, אחסן שקופיות במקרר.
  4. המטאוקסילין-אאוזין כתמים של רקמה
    1. מניחים את שקופיות המיקרוסקופ בעריסה היסטולוגיה. דפפיזציה השקופיות בארון חימום מוגדרות ב-60 ° c עבור 60 דקות.
      הערה: יש להשאיר שקופיות ישירות מהמקרר כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני הצבתו בארון חימום.
    2. בתוך מכסה המנוע, מימה מחדש את הרקמה ב 3 שינויים של סוכן סליקה (טבלה של חומרים), לעשות 20 מטבלים בצנצנת סוכן הניקוי הראשון ולאחר מכן לתת להם לעמוד 7-8 דקות בכל אחד משני צנצנות הניקוי הנוסף. להעביר את השקופיות לפתרונות אלכוהול יורדים, להתחיל עם 3 שינויים של 99% אתנול, ואחריו 2 שינויים של 96% אתנול ו 70% אתנול. לעשות מינימום של 20 מטבלים בכל צנצנת. העבר למים זורמים ותן לשקופיות לעמוד במשך 5 דקות.
    3. לטבול את השקופיות ב המטאוקסילין של מאייר במשך 1 דקות.
    4. רוחצים את הדגימות של מי ברז זורמים עבור 5 דקות.
    5. לטבול קטעים בכתם אאוזין עבור 1-2 דקות, ואז לשטוף את מי ברז.
    6. מייבשים את הרקמה על ידי הצבת פתרונות לאלכוהול עולים. התחל עם 70% אתנול, ואחריו 96% אתנול, 96% אתנול, ו 4 פעמים 99% אתנול. לעשות מינימום של 20 מטבלים בכל צנצנת, ולתת את העריסה לעמוד 99% אתנול עד שהם נטענים.
    7. שמיכות הר על-ידי החלת כמות קטנה של מדיום ההרכבה על פני השטח של השקופיות. שים את שמיכות על גבי המדיום להרכבה מבלי ליצור בועות תחת coverslip. . תנו לו להתייבש 24 שעות ביממה
    8. בדוק את הרקמה באמצעות מיקרוסקופ קל המחובר למצלמה כדי להשיג תמונות היסטולוגית. השתמש במטרת 10x כדי לצלם תמונות עד שתגיע כיסוי מלא של שקופית הרקמה.

4. מדידת עומק הקריפטה ו/או גובה היליוס

  1. הורד והתקן את תוכנת הניתוח (כלומר, זן לייט, לוח חומרים).
  2. פתח את התמונה בתוכנה והתחבר למצלמה. צלם תמונות במצב מצלמה עם המטרה 20x.
  3. במצב עיבוד, פתח את התמונה.
  4. כדי למדוד את עומק הקריפטה: בתצוגה דו-ממדית, בחר בכלי השורה מהכרטיסיה הגרפיקה. בחר קריפטה היטב ולהתחיל את הקו בתחתית של ויליוס ולסיים בתחתית הקריפטה. חזור על פעולה זו עבור 20 הקריפטטים היטב (איור משלים 1).
  5. כדי למדוד את גובה הווייוס: בתצוגה דו-ממדית, בחר בכלי השורה מהכרטיסיה הגרפיקה. בחר ליה היטב ולהתחיל את הקו בסוף הקרנת הלומיאל ולסיים בתחילת הקריפטה. חזור על פעולה זו עבור 20 villi היטב (איור משלים 1).
  6. מעבר מתצוגה דו-ממדית לתצוגת המידה כדי להציג את המידות.
  7. לייצא את המידות ולחשב את הממוצע של עומק הקריפטה ואת גובה ליה.

5. בדיקת קוונפיקציה (התפשטות) על ידי אימונוהיסטוכימיה

  1. הזרקת התמיסה של BrdU
    1. שוקלים ומקליטים את משקל הגוף של העכברים.
    2. בתוך מכסה המנוע, להכין כמות ייצוגית של 0.5% w/v ברומאודלדין (BrdU) הפתרון בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS).
    3. במנוע, להזריק 50 מ"ג/ק ג של BrdU על ידי הזרקת הצפק.
      הערה: כדי להבטיח כי כל עכבר מורמת בדיוק 150 דקות לאחר הזרקת BrdU, להזריק כל עכבר בנפרד ברציפות עם 10 לפחות 20 דקות מרווח בין כדי לבצע כהלכה את אוסף הרקמה.
    4. . להקליט את זמן ההזרקה
    5. המתן 150 דקות, לאחר מכן להרדמה עכברים ולאסוף את הרקמה כמתואר בשלבים 2.1-2.7. בצעו BrdU אימונוהיסטוכימיה כמתואר בסעיף 5.2.
  2. ברדו אימונוהיסטוכימיה
    1. הכינו את הרקמה כמתואר בצעדים 3.1.1-3.3.4.
    2. עבור אחזור אנטיגן, המקום עריסה שקופית עם הסעיפים בצנצנת היסטולוגיה זכוכית ולמלא אותו עם מאגר EDTA (pH 9) במיקרוגל מיקרוגל עבור 1 דקות ב 750 W ואחריו 9 דקות ב 350 W. חזור על מחזור.
      הערה: ודא שהרקמה אינה מייבשת, דבר שעשוי לדרוש הוספת מאגר נוסף לצנצנות שבין החימום.
    3. לשטוף את הסעיפים 2-3 פעמים ב-tris באגירה מלוחים ו polysorbate 20 (TBS-T) מאגר עבור 3 דקות כל אחד.
    4. החל 5 טיפות של בלוק מי חמצן (לוח חומרים) עבור 10-15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום פעילות peroxidase אנדוגני. שטוף סעיפים 2-3 פעמים במאגר TBS-T עבור 3 דקות לכל אחד.
    5. החל 5 טיפות של מאגר בלוק מכרסם (טבלת חומרים) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום איגוד לא ספציפי. שטוף סעיפים 2-3 פעמים במאגר TBS-T עבור 3 דקות לכל אחד.
    6. מודלת את הסעיפים עם העכבר המונבטיים אנטי BrdU נוגדן מדולל 1:500 עבור 1 h בטמפרטורת החדר. שטוף סעיפים 2-3 פעמים במאגר TBS-T עבור 3 דקות לכל אחד.
    7. המחש את האימונושליליות באמצעות 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת) על ידי החלת 5 טיפות של חזרת peroxidase לכל שקופית ו מודטה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את הסעיפים לתוך מכסה המנוע, להוסיף 150 μL של התוספת ו דגירה של 5 דקות.
      הערה: תמיד לובשים כפפות כאשר אתם מטפלים בקלות והיפטרו מפסולת.
    8. לשטוף חלקים במים מוכי.
    9. מייבשים את הרקמה ומהר שמיכות כמתואר בשלבים 3.4.6 ו 3.4.7.
  3. הדמיה של הפעולות החיסורימיות
    1. דמיינו את דגימת הרקמה עם מיקרוסקופ קל המחובר למצלמה.
    2. השתמש בתוכנת ניתוח כדי לקבל תמונות מיקרוסקופ באמצעות מטרה 20x של כל הסעיפים ולשמור קבצים ב. פורמט JPG.
    3. קח תמונה של מיקרומטר שלב באמצעות מטרה 20x, אשר ישמש ככלי כיול בתוכנת ImageJ.
  4. מדידת השטח של התאים האימונופעילים BrdU
    1. התקנת תוכנת ImageJ (טבלת חומרים).
    2. הקצאת קנה מידה לתמונה ב-ImageJ: פתח את תמונת המיקרומטר בשלבים באמצעות הקובץ ImageJ | הפקודה ' פתח תפריט '. בחרו בכלי בחירת הקו הישר.
    3. בחרו בכלי הישר וציירו קו ישר בתמונת המיקרומטר כדי להגדיר מרחק ידוע.
    4. בחר ' קבע קנה מידה ' מתחת לתפריט ' נתח '.
    5. הזינו ערך בתיבה ' מרחק מוכר ' והגדירו את יחידת האורך בתיבה ' יחידת אורך '. בחר באפשרות כללית כך שכיול זה יחול על כל התמונות הפתוחות בהפעלת imagej זו.
    6. פתח תמונה של עניין באמצעות הקובץ ImageJ | הפקודה ' פתח תפריט ' כדי למדוד את האזור של התאים החיסוניים של BrdU לכל קריפטה.
    7. הגדר את גרפיקת הצבע ל-8 סיביות תחת התפריט תמונה/סוג .
    8. הגדילו את הניגודיות של התמונה בניגוד לתהליך/שיפור הניגודיות וקבעו את הפיקסלים הרוויים ל-0.4%.
    9. החילו סף על התמונה כדי לפלח את הדיאלקטרי החיסונית. בחר תמונה/התאם תחת תפריט, לאחר מכן הסף ובחר את צבע אדום (אזור כהה המוצג באדום). בחר מסף של כ-10-20% על-ידי הזזת סרגל הסף.
      הערה: בחר סף הכולל את כל התאים החיוביים של BrdU בעלי רקע קטן ככל האפשר. האחוז שנבחר צריך לחול על כל המקטעים.
    10. לבחור קריפטה היטב, כלומר, קריפטה מלאה מרקמות שלמות, ולבחור את הכלי בחירה ביד חופשית כדי לסמן את האזור סביבו.
    11. כדי למדוד את אזור הסף, בחר את הכרטיסייה ' נתח ' ואחריו חלקיקים לנתח. בחלון החלקיקים לנתח , הגדר גודל ל -20-אינסוף, לחץ על יחידות הפיקסליםבתיבה, הגדר את החוגה ל-0.00- 1.00והגדר את הצג לקווי מתאר. לחץ על תיבות להצגת תוצאות, סכם וכלול חורים.
      הערה: הערכים עבור תאים חיוביים של BrdU נוצרים באופן אוטומטי בחלון תוצאה, ומציגים את המידות הבודדות עבור כל תא חיובי BrdU. יתר על כן, חלון סיכום נוצר באופן אוטומטי, המציג את מספר הספירות, האזור הכולל, הגודל הממוצע ואחוז השטח עם תאים חיוביים BrdU.
    12. חזור על הצעדים 5.4.10 ו 5.4.11 למדוד קריפטה חדשה. התוצאות של כל הקריפטטים שנמדדו יוצגו בחלון הסיכום .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסוי הראשון, אנו המושרה mucositis בעכברים ביום 0 והקריבו קבוצה של עכברים כל יום במשך 5 ימים רצופים. כאשר מדידת משקל SI, מצאנו כי פרמטר זה ירד מיום 2 עד יום 4 רומז הפסד במסה הenterocyte. מצאנו גם כי ביום 5, משקל SI לא היה שונה באופן משמעותי מיום 0 (עכברים לא מטופלות) (איור 1). ההתפשטות הנמדדת על ידי התאגדות BrdU כמעט בוטלה ביום 1 ויום 2, אבל ביום 4 ויום 5 היו בערך ארבעה קיפול וחמש קיפול בהפצה, בהתאמה (איור 2). היפרהפצה זו מומחש גם בעת מדידת עומק הקריפטה (איור 3). מה לא מומחש על ידי מדידת עומק קריפטה הוא אובדן של תאים מתרבים ביום 1 ויום 2, שבו עומק קריפטה הופחת על ידי כ 13% אבל לא היה שונה באופן משמעותי מן העכברים בריאים. אנחנו יכולים להראות כי, בשלב ההתחדשות של mucositis היה מתאם חזק בין התאגדות BrdU ועומק קריפטה, אבל זה לא נחשב לשלב אקוטי המציין כי עומק הקריפטה כמו נקודת קצה עשוי לא להיות מתאים בשלב אקוטי של mucositis (איור 4).

במחקר השני, בדקנו את המוגניים במודל העכבר הטרנסגני שלנו ללא הפרשת תא L מספיק. עכברים עם לקוי GLP-1 ו-GLP-2 הראו אובדן חמור של משקל הגוף (BW) וירידה במשקל SI בשלב ההתאוששות, אשר היה משמעותי מאוד לעומת סוג פראי (WT) 5-FU עכברים (p < 0.01) (איור 5A, B). יתר על כן, העכברים הטרנסגניים לא הצליחו להפגין היפרפרציה; הקריפטטים היו קצרים באופן משמעותי מאשר בשני עכברי WT ובקרות בריאות. בניגוד לכך, עכברים WT הראו עלייה בעומק הקריפטה כסימן של היפרהפצה (איור 5C).

Figure 1
איור 1: משקל המעי הקטן. עכברים היו הקריבו 1 עד 5 ימים לאחר ההזרקה 5-FU ביום 0 ומשקל המעי נמדד כמתואר. התוצאות מוצגות כמשמעות של ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM). n = 13. איור זה שונה מההיסדר-Anden ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התאים האימונובתאי החיסונית לכל קריפטה עבור התריסריון, jejunum, ו מעי של SI. עכברים הוקרב 1 עד 5 ימים לאחר הזרקה 5-FU ביום 0 ו-BrdU התאגדות היה ככמת על ידי אימונוהיסטוכימיה כמתואר. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. n = 13. * p < 0.05, * * * p < 0.001 בהשוואה ליום 0 (ניתוח של סטיה [ANOVA] ואחריו Dunnett בדיקת השוואה מרובה). p < 0.001 לעומת היום 0 (ANOVA ואחריו דאננט מבחן מרובה השוואה). איור זה שונה מההיסדר-Anden ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידה של עומק קריפטה. עכברים היו הקריבו 1 עד 5 ימים לאחר הזרקה 5-FU ביום 0 ו עומק הקריפטה נמדד כמתואר. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. n = 13. * p < 0.05, * * * p < 0.001 בהשוואה ליום 0 (ANOVA ואחריו Dunnett בדיקות מרובות השוואה). איור זה שונה מההיסדר-Anden ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: המתאם של עומק הקריפטה BrdU. עומק קריפטה (ב תריסריון, jejunum ו ileum) הוא מתואם להתאגדות BrdU בכל יום של ההקרבה באמצעות דו-זנבית במבחן מתאם פירסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: glp-1 ו glp-2 עכברים לקוי להיכשל להתחדש לאחר mucositis חריפה. (א) שינוי BW (%), (ב) SI משקל (g), ו (ג) עומק קריפטה ב מעי (μm). התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. עכברים מטרנסגניים של Tg =; WT לעכבר סוג פראי; 5-FU = 5-fluorouracil. 2-8. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 לעומת שליטה בריאה (WT מלוחים), = p < 0.05, aa = p < 0.01, aaa = p < 0.001 לעומת WT 5-FU (2-way ANOVA ואחריו Bonferroni מבחן השוואה מרובה [BW] או ANOVA ואחריו דאננט מרובים במבחן). איור זה שונה מההיסדר-Anden ואח '16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: רקמת המעי הקטנה לפני אינדוקציה של mucositis, במהלך השלב החריף ואת שלב ההחלמה של mucositis. (A) Haemotoxylin ו אאוזין (H & E) צביעת ו (ד) brdu צביעת עכברים מטופל. השורה המנוקדת השחורה בפאנל מציגה את הקריפטה היטב, ואילו הקו הירוק המנוקד ממחיש את הוויאוס היטב. (ב) H & הצביעת e ו (E) brdu כתמים בשלב אקוטי של mucositis. (ג) H & הצביעת E ו (ו) brdu כתמים במהלך ההתאוששות שלב לאחר אינדוקציה של mucositis. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מדגימים שיטה הנגישה באופן נרחב כדי ללמוד פציעה SI והתחדשות במודל העכבר. מגוון רחב של מודלים בעלי חיים פרה-קליניים של נזקי מעיים קיימים, אך חיוני שנבין שכל דגם הוא ייחודי ושנקודות הקצה חייבות להיות מתאימות למענה לשאלת המחקר. מודל זה מצוין כדי ללמוד תגובה אדפטיבית לפציעה, אבל נקודות הקצה צריך להיות שונה בעת שימוש במודל כמודל טרום קליני של mucositis. עם זאת, תרגום מדגמי בעלי חיים למטופלים הוא מאתגר23. הציע נקודות הקצה של משקל SI והתפשטות צריך להיות מוגבל למחקר של תגובה אדפטיבית בלבד. המחקר של גורמים אנדוגניים לעתים קרובות דורש שימוש בעכברים טרנסגניים, וגם אם כריתת המעי הקטנה אפשרית עכברים1, מודל זה יכול להיות אלטרנטיבה כדי למנוע תמותה שלאחר הניתוח. כאשר מיישמים מודל זה לעכברים טרנסגניים, חשוב לראות את העכברים בזהירות ולעקוב אחר המשקל שלהם כל יום. במהלך מחקר זה, חלק מהעכברים חוו ירידה במשקל של עד 30%, וזה די משמעותי. כדי להימנע מתמותה גבוהה בפנוטיפים רגישים, אנו ממליצים לבצע לימודי פיילוט בעכברים טרנסגניים, כיוון שהתאמת המינון עשויה להיות נחוצה.

צעד קריטי בתוך השיטה המתוארת הוא ההסרה והמשקל של ה-SI. חשוב שניתן יהיה לבצע את ההסרה והטיפול באותו אופן ובאמצעות אותו חוקר בכל פעם כדי להימנע מווריאציות של שינויים בין-מרחבים.

העקביות של בחירת הקריפטה ו-ליה חשוב כדי למנוע סטיה והטיה בעת מדידת עומק הקריפטה וגובה ליה. בעת הטמעת הרקמה בפרפין, המעיים ממוקמים בתנוחה זקופה כדי ליצור חתכים רוחביים, ובכך להגדיל את האפשרות של villi שלמים וקריפטטים. לאחר חיתוך הרקמה, בוחרים בקריפטה ו/או ליה. הבחירה מבוססת על ההדמיה המלאה של הקריפטה כולה, וילאוס באותו מישור ונוכחות של גבולות ברורים של תאים בתוך הקריפטה וילאוס. מגבלה לשיטה זו היא גישה סובייקטיבית במקצת בעת בחירת קריפטה היטב מאז הבחירה של קריפטה היטב ו/או villi נעשה לאחר חיתוך הרקמה. המחקר הקודם24 הציג שיטה חלופית כדי להתגבר על מגבלה זו, שם הם משתמשים בניתוח מיקרו. בשיטה זו, villi ו הקריפטטים נבחרים תוך כדי התבוננות תחת מיקרוסקופ, לפני שחותכים את הרקמה, ובכך לאפשר להבטיח כי קריפטה שלמה ולהיות גזור מן הרקמה.

בניגוד לשיטות קודמות ששימשו לכמות brdu תאים חיוביים25,26, פרוטוקול זה מתאר את האזור של תאים חיוביים brdu לכל קריפטה, אשר מספק דרך מהירה כדי כימות תאים מתרבים בתוך כל קריפטה. טכניקה זו, עם זאת, עשויה להיות מגבילה במקצת כיוון שהיא דורשת ידע מעמיק יותר של התוכנה המוצעת למדידה של טכניקה זו. יישום עתידי של פרוטוקול זה יכול להיות כדי ליצור שיטה אוטומטית יותר שנוצר לכמת ולמדוד את התאים החיוביים BrdU.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענק בלתי מוגבל ממרכז נובו נורדיסק למחקר בסיסי מטבולית וקרן לונלבק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 147 פציעת מעיים קטנה סמנים מתרבים brdu עומק קריפטה גובה ליה פיצוי יתר
חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter