Summary
نحن نقدم بروتوكول لاستخراج العجانات الدماغية murine. استنادا إلى التخصيب الخالي من المضادات الحيوية استخراج perسيلات المنحى ، وهذا البروتوكول هو أداه قيمه للدراسات في المختبر توفير عاليه النقاء والغلة العالية ، التالي خفض عدد الحيوانية التجريبية المستخدمة.
Abstract
في السنوات الاخيره ، أصبحت بيريسيلات الدماغية بؤره البحث المستفيض في علم الاحياء الوعائية وعلم الامراض. ويتضح الآن اهميه pericytes في تكوين حاجز الدم في الدماغ وعلم وظائف الفسيولوجية ولكن الأساس الجزيئي لها لا يزال مجهولا إلى حد كبير. كما دور الفيزيولوجيا المرضية من بيريسيلات الدماغية في الاضطرابات العصبية هي مثيره للاهتمام وذات اهميه كبيره ، والنماذج في المختبر ليست فقط مناسبه بما فيه الكفاية ولكن أيضا قادره علي دمج تقنيات مختلفه لهذه الدراسات. وقد اقترحت عده طرق كما في نماذج المختبر لاستخراج بيريسيلات الدماغية, علي الرغم من ان بروتوكول خاليه من المضادات الحيوية مع ارتفاع الإنتاج هو مرغوب فيه. والاهم من ذلك ، فان الطريقة التي زادت الإنتاج لكل استخراج يقلل من استخدام المزيد من الماشية.
هنا ، نقترح طريقه بسيطه وفعاله لاستخراج pericytes الدماغي مع الإنتاج العالي بما فيه الكفاية. يخلط انسجه المخ الدماغ الخالط مع محلول الجيش الصربي-ديكبرين للفصل بين الحطام الانسجه وبيليه الاوعيه الدموية المجهرية. نقترح الانفصال ثلاث خطوات تليها الترشيح للحصول علي الترشيح الصغيرة الغنية الاوعيه. مع هذا الأسلوب ، كميه من شظايا الاوعيه الدقيقة التي تم الحصول عليها من 10 الفئران كافيه للبذور 9 الآبار (9.6 سم2 كل) من لوحه 6 جيدا. الأكثر أثاره للاهتمام مع هذا البروتوكول ، يمكن للمستخدم الحصول علي 27 الآبار pericyte الغنية (9.6 سم2 لكل) في مرور 2. يتم تاكيد نقاء الثقافات perسيلات مع التعبير عن علامات pericyte الكلاسيكية: NG2 ، PDGFR β و CD146. هذا الأسلوب يوضح أداه فعاله ومجديه في المختبر للدراسات الفسيولوجية والفيزيولوجيا المرضية علي perسيلات.
Introduction
بيريسيلات الدماغية هي عنصر أساسي من وحده الاوعيه الدموية (NVU) ، والذي يضم وحده وظيفية مع الخلايا الغشائية الدماغية من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ، والخلايا الددميه ، والمصفوفة خارج الخلية والعصبية. Pericytes هي جزء حيوي في العمل المنظم للجهاز العصبي المركزي (CNS) لأنها بمثابه واحده من واجات لتبادل المعلومات الجزيئية والخلوية.
وجزءا لا يتجزا من pericytes الدماغية في الجانب abluminal من الاوعيه الدقيقة الدماغ, وضرورية لإنشاء1 والحفاظ علي2 الفيزيولوجيا BBB. وقد أبرزت العديد من الاعمال الاخيره أيضا دور بيريسيلات الدماغية في الاوعيه3 ونضج السفينة4, البطانية تخلق5 والبقاء علي قيد الحياة6, وفي السيطرة علي استقلاب الكولسترول في الدماغ7. والاهم من ذلك ، فان خلل التنظيم في اي من هذه العمليات هي السمات المسببة للامراض التنكسية العصبية.
في الواقع ، pericytes هي ضرورة وظيفية للأداء العادي BBB وحمايتها ضد تطور العديد من الامراض العصبية. توليد الوظائف الفسيولوجية وفقدان pericytes هي القواسم المشتركة في تطور مرض الزهايمر8, فقدان الخلايا العصبية خلال ضعف المادة البيضاء9, التصلب المتعدد10, اعتلال الدماغ التفسخ11, السكتة الدماغية الحاده المرحلة12 وفي الاضطرابات العصبية الأخرى. Pericytes هي أيضا مفيده في ورم خبيث13. ومن المثير للاهتمام, وقد تبين أيضا pericytes لإظهار دور الإنقاذ بعد الصدمات العصبية والاضطرابات: في أعاده النخاع في الدماغ1, السكتة الدماغية, أصابه الحبل الشوكي14 وتعزيز تولد الاوعيه15. حساسية العجان لتعزيز المظهر المرضي للصدمات العصبية والاضطرابات يجعلها الهدف العلاجي المحتمل16.
في المختبر نماذج البحوث من pericytes في BBB أدوات هامه لاجراء دراسات واسعه النطاق. هذه النماذج توفر منصة للدراسات أكثر تفصيلا من خلال تمثيل نماذج العمل من BBB وأكثر من ذلك. علي سبيل المثال ، يمكن استخدام هذه النماذج لفهم فسيولوجيا الخلوية داخل العجان وبين أنواع الخلايا الأخرى من NVU. أيضا ، في نماذج المختبر هي أدوات التحقيق مباشره لاختبار التاثير الدوائي للعقاقير الجديدة والجزيئات علي pericytes. ويمكن أيضا ان تستخدم هذه النماذج لفهم الدور الباثولوجي من بيريسيلات فيما يتعلق بالاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فان تطوير النماذج في المختبر يتطلب زيادة الإنتاج لتمكين الحرية التجريبية. وينبغي ان تكون هذه النماذج سهله وسريعة ، والحد من عدد الحيوانية التجريبية المستخدمة. الاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي تطوير مثل هذه النماذج في نماذج ثقافة الخلايا المزدوجة والثلاثية أمر مرغوب فيه.
هناك العديد من البروتوكولات التي تم تطويرها. والبروتوكولات المقترحة من قبل Tigges et al.17، Chen et al.18، thomsen et al.19، يامازاكي Et Al.20، و كراوتش و doetsch21 هي النهج الجديرة بالثناء التي تلبي معظم الضروريات. كل هذه الأساليب تسفر عن نتائج فعاله ، ولكن الاعتماد علي عدد كبير من الكائنات التجريبية لا يزال قاسما مشتركا لهذه البروتوكولات. ولذلك ، يصبح إلزاميا لتطوير طريقه الإخراج العالية التي يمكن عزل وتنقيه pericytes مع اقصي قدر ممكن من الكفاءة. في هذا البروتوكول ، يتم التحقق من نقاء الخلايا التي تم الحصول عليها بعد مرور الثاني مع عده علامات pericytes. دققنا لمستقبلات عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية-β (pdgfr-β) ، والذي يستخدم كعلامة كلاسيكية من pericytes17، النسبة لNG2 (العصبية-غليال مستضد 2) ، والذي هو علامة pericytes توسط الاوعيه الدموية تخلق22 والاوعيه23. راجعنا أيضا لمجموعه من التمايز 146 (CD 146) ، التي تم الإبلاغ عنها باعتبارها واحده من الجزيئات التي أعرب عنها في perسيلات17،18.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لاستخراج pericytes الابتدائية من الفئران (نوع البرية أو transgenics) من شانها ان تلبي جميع المتطلبات المذكورة أعلاه مع ارتفاع الإنتاج. نحن نوظف المضادات الحيوية والمناعية الاختيار الحرة القائمة علي طريقه الانتشار لل pericytes الدماغية الابتدائية ، والتي سوف تثبت نفسها نموذجا فعالا لاجراء الدراسات في المختبر.
Protocol
وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها المعهد لاستخدام الماشية ومناولها. ووفقا للتشريع الفرنسي ، وافقت السلطات المحلية علي مرفق الحيوانية في جامعه ارتوف (المرجع: B62-5). وامتثالا لتشريعات الاتحاد الأوروبي (التوجيه 2010/63/EU) ، وافقت اللجنة المحلية لرعاية الماشية واستخدامها علي جميع الإجراءات التي اعتمدتها ، المرجع: C2EA 75 ، ووزارة البحوث الفرنسية (المرجع: 2015090115412152).
1-اعداد الحلول
- اعداد 500 مل من الغسالة العازلة A (WBA): 10 mM حل HEPES في الحل المتوازن الملح هانك (HBSS). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد 500 مل من الغسالة العازلة B (WBB): 0.1% المصل البقري الزلال (جيش صرب البوسنيين) مع محلول HEPES 10 ملم في HBSS. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد 300 مل من محلول ديديكسان 30 ٪ في WBA عن طريق خلط الحل بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة. الاوتوكلاف الحل في 110 درجه مئوية لمده 30 دقيقه قبل الاستخدام. بعد التعقيم ، والسماح للحل بقية في درجه حرارة الغرفة ل 2-3 h. تخزين الحل في 4 درجه مئوية.
- اعداد 100 مل من 0.1 ٪ من محلول الصرب البوسنيين في محلول ديديكسان الباردة. يهز بقوة لمده 3-4 دقيقه وتخزين في 4 درجه مئوية.
- اعداد الكاملة دولبيكو النسر المتوسطة المعدلة (DMEM) وسائل الاعلام الثقافة عن طريق تذويب 20% الساق المصل, 2 مم الجلوتامين, 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين, 1% الفيتامينات, 2% الأحماض الامينيه القاعدية النسر المتوسطة (BME) في القاعدية DMEM وسائل الاعلام وتخزين أضافه 1 نانوغرام/مل عامل نمو الخلايا الليفية الاساسيه (bFGF) قبل الاستخدام.
- اعداد وسائل الاعلام perسيلات كامله عن طريق أضافه المكملات النمو pericyte (المقدمة مع وسائل الاعلام pericyte) و 20 ٪ الجنين الساق المصل (FCS) في وسائل الاعلام القاعدية الثقافة pericyte وتخزين في 4 درجه مئوية.
2. استعاده انسجه المخ وأزاله السحايا
- للاتساق ، واستخدام الفئران من نفس العمر والمساواة بين الجنسين في كل دفعه من الاستخراج. استخدام ماوي الحيوانية خاليه من العوامل المسببة للمرض وتوفير الوصول إلى الماء الإعلان حسب. لضمان الكفاءة والحد الأدنى من استخدام الحيوانية ، وتجنب فقدان المواد النسيجية.
- موت ببطء C57BL/6J ، 4-6 أسابيع من العمر ، والفئران الذكور (مختبرات Janvier ، لو Genest سانت آيل ، فرنسا).
- بسرعة المكوس انسجه المخ في ظروف معقمه ، وتجنب اي ضرر للانسجه. وضع بعناية الانسجه في 40 مل من الفوسفات الباردة مخزنه المالحة (تلفزيوني).
- نقل انسجه المخ في الباردة التلفزيونية إلى طبق بيتري (100 مم × 15 مم).
- ضع انسجه المخ علي مسحه معقمه جافه خاليه من الوبر ومع ملقط الطرف المنحني ، وأزاله المخيخ والمخطط والأعصاب القذالي.
- أزاله جميع السحايا مرئية مع مسحه القطن. ضع انسجه المخ راسا علي عقب وافتح الفصوص بمسحه قطنية باستخدام ضربات الضوء الخارجي. أزاله جميع الاوعيه الدموية المرئية.
- ضع انسجه المخ الخالية من السحايا في طبق بيتري (100 مم × 15 مم) مع 15 مل من WBB البارد.
3-التجانس
- نقل الانسجه إلى أنبوب هاون طاحونة الانسجه Dounce وأضافه 3-4 mL من WBB مع ملقط.
- اللحم المفروم النسيج مع "فضفاضة" 55 مرات. شطف المدقه ' فضفاضة ' مع WBB. الآن المفروم الطين مع "ضيق" مدقه 25 مرات.
- تقسيم الطين علي قدم المساواة في أنابيب 2 50 mL وأضافه 1.5 x حجم الباردة 30 ٪ جيش صرب البوسنيين-ديكدكان ، تهتز بقوة الأنابيب لخلط الطين.
4. عزل جزء الاوعيه الدموية
- بعد تهتز بقوة الأنابيب ، والطرد المركزي أنابيب لمده 25 دقيقه في 3,000 x g و 4 ° c.
- نقل ماده طافي (جنبا إلى جنب مع طبقه المايلين اعلي) إلى 2 أنابيب جديده ، والطرد المركزي أنابيب لمده 25 دقيقه في 3,000 x g و 4 ° c. الحفاظ علي الكريات من الطرد الاولي عن طريق أضافه 3 مل من WBB الباردة (الحفاظ علي بيليه في 4 درجه مئوية).
- كرر الخطوة 4.2 والحفاظ بعناية علي الكريات من 2nd طرد.
- تخلص من الأنبوب من الخطوة 4.3 إلى النفايات. الحفاظ علي الكريات في WBB الباردة.
- تجمع محتويات أنبوب 1 وأنبوب 2 من الخطوة 4.1 وجعل ما يصل إلى الحجم النهائي من 10 مل مع WBB الباردة.
- كرر هذه الخطوة للأنابيب من الخطوة 4.2 والخطوة 4.3.
ملاحظه: وأخيرا ، هناك 3 أنابيب من 3 سينتريفوجيشنز. - انفصال بيليه مع 6 السكتات الدماغية صعودا وهبوطا باستخدام ماصه 10 مل ، حتى لا كتل مرئية من الكريات المتبقية.
- مع مساعده من الجمعية فلتر فراغ ومرشح شبكه النايلون ، وتصفيه تعليق الخلية من كل أنبوب.
ملاحظه: هذه الخطوة الترشيح المهم من أجل أزاله أطول/أكبر السفن عن طريق فلتر شبكه. - استعاده وأعاده تعليق الشعيرات الدموية عن طريق كشط فلتر مع مساعده من ملقط طرف مسطح أو مكشطه في WBB في درجه حرارة الغرفة. تصفيه التعليق مع فلتر جديد لاستعاده المزيد من الشعيرات الدموية
- تقسيم الترشيح علي قدم المساواة في اثنين من أنابيب والطرد المركزي لمده 7 دقائق في 1,000 x g و RT.
ملاحظه: اثناء هذه الخطوة طرد اعداد الحل الانزيمي. تحديد حجم WBB المطلوبة وفقا لعدد الكائنات المستخدمة (انظر جدول المواد). أضافه 1x من DNase 1 و 1x من Tosyl-L-lysyl-الكلوروميثان هيدروكلوريد (TLCK) (انظر جدول المواد) في wbb وقبل الحارة إلى 37 درجه مئوية. - جمع الكريات من الخطوة 4.10 في أنبوب واحد مع الحرارة قبل WBB مع الانزيمات. أضف درجه الحرارة السابقة 1x كولاجيناز/الاستغناء. وضع أنبوب في الجدول يهز حمام المياه في 37 درجه مئوية علي وجه التحديد 33 دقيقه.
- وقف تفاعل الانزيم عن طريق أضافه 30 مل من WBB الباردة. الطرد المركزي تعليق لمده 7 دقائق في 1,000 x g و RT.
- تجاهل ماده طافي بعناية وانفصال بيليه في wbb مع 6 السكتات الدماغية صعودا وهبوطا باستخدام ماصه 10 مل. وينبغي ان تكون هذه الخطوة اقل صرامة وأسرع نسبيا.
- الطرد المركزي تعليق لمده 7 دقائق في 1,000 x g و RT.
ملاحظه: اثناء هذه الخطوة ، تجاهل الطلاء من الاطباق الثقافية وشطفها مره واحده مع DMEM في درجه حرارة الغرفة. طبقه الخلايا الثقافة الاطباق علي الأقل 1 ح في RT. - تجاهل ماده طافي من أنبوب الحصول عليها في الخطوة 4.14 ، وانفصال بيليه في وسائل الاعلام dmem كامله جديده ، لوحه الخلايا (يوم 0 ، P0) في 9 ابار من لوحات 6-حسنا (1 بئر من 9.6 سم2 لكل منهما).
5. انتشار العجان الدماغي
- الحفاظ علي الثقافات الخلية في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 في حاضنه معقمه. استبدال وسائل الاعلام الثقافة بعد 24 ساعة (اليوم 1) من الطلاء الخلايا عن طريق أزاله الحطام بعناية. بعد اليوم 1 ، تغيير وسائل الاعلام الثقافة في كل 48 h.
- مراقبه ثقافة الخلية لمده لا تقل عن 7-8 يوما. وبحلول هذا الوقت ، يجب ان تكون الأورام الخلوية الموجودة علي الجانب العلوي من الطبقة الاحاديه البطانية قابله للملاحظة.
- مرور الخلايا في اليوم 8-10 (اعتمادا علي كونفلوينسي) في الوسط الثقافي pericyte إلى مرور 1 (P1) علي لوحات الثقافة المغلفة الجيلاتين. تغيير الوسائط الثقافية في كل يومين. مراقبه الخلايا لمده 6-7 أيام. يتم تقسيم الخلايا بشكل متتابع مره أخرى إلى المرور 2 (P2) في اليوم 17 [والمرور 3 (P3) في اليوم 24 فقط إذا لزم الأمر] ، نمت في المتوسطة perسيلات في لوحات الجيلاتين المغلفة.
ملاحظه: يجب ان تكون الخلايا جاهزه للتجارب/الملاحظة عند ما يقرب من 80-90% كونفلوينسي.
Representative Results
وينتج هذا البروتوكول (الشكل 1) بكفاءة 9 ابار (من 6 لوحات جيده) في وقت البذر في P0 (الشكل 2الف (P0: اليوم 1)).
من P0 إلى P2 ، وهناك الخصائص المورفولوجية المحددة التي الخلايا البطانية (المشار اليها بواسطة السهام البيضاء) و s زيادة تدريجيه في pericytes (المشار اليها بواسطة السهام السوداء) يمكن ملاحظتها. في P0 ، والخلايا البطانية ممدود النامية من الاوعيه الدقيقة هي في وفره (الشكل 2ا، P0: اليوم 3) ، في حين يتم تقليل وفره من هذه الخلايا الممدودة في P1 وغائبه في P2. علي العكس من ذلك ، تظهر العجانات كخلايا رباعيه التي وفيرة في P2 (الشكل 2ا، p2: اليوم 18).
لتاكيد نقاء الثقافة pericyte في P2 ، دققنا في التعبير عن NG2 ، CD146 و pdgfr-بيتا كما علامات pericyte باستخدام PCR الكمية (الشكل 2ب) ، المناعية (الشكل 2ج) ، ولطخه الغربية (الشكل 3). Pericytes في P2 التعبير عن مستويات اعلي من CD146 ، NG2 و PDGFR-β بالمقارنة مع التعبير في مجموع الدماغ الماوس (Ms Br) استخراج. كعنصر تحكم ، والتعبير عن علامات بطانية ترتبط و CD31 ، ولوحظت استروسيتيس علامة غليال البروتين الحمضي الليفي (gfap) وعلامة الخلايا الصغيرة CD11b أيضا غائبه في P2.
الشكل 1: ملخص البروتوكول. يمثل هذا المخطط التفصيلي الخطوات الحاسمة لاستخراج perسيلات الذي يبدا مع تفكك الانسجه مع طاحونة مدقه الزجاج تليها الانفصال 3-الخطوة في ديكسان والترشيح. هذا البروتوكول يستخدم 33 دقيقه انزيم الهضم خطوه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخلايا المورفولوجية وعلامات التعبير. (ا) صور علي النقيض من المرحلة الاوليه في مراحل الانتشار P0 و P1 و P2. ويشار إلى الخلايا البطانية وفيرة في P0 بواسطة السهام البيضاء. انخفض عددها في P1 وانها اختفت في P2. ويشار pericytes بالسهام السوداء. (ب) تحليل CD146 ، NG2 والتعبير PDGFR-β من قبل PCR في Pericytes في P2 مع Pericytes في P1 والماوس الدماغ (Ms Br) عينات. (ج) الصور التمثيلية لل pericytes في P2 المعرضة المناعي ايجابيه من CD146 ، PDGFR β و ، NG2. شريط المقياس: 50 μm (التكبير 20x) و 20 μm (40x التكبير). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النقاء التمثيلي لثقافات الخلية. تحليل CD146 ، PDGFR-β ، NG2 ، ترتبط ، GFAP ، CD31 ، CD11b والتعبير الأنابيب الغربية بالتنقيط في pericytes في P2 والماوس الدماغ (Ms Br) عينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنه تمثيليه للأساليب المختلفة لتفكك الانسجه وتنقيتها وإثراءها وهضمها الانزيمي. ويلخص كل بروتوكول منشور مع مؤشرات علي عدد الماشية المستخدمة لكل بروتوكول. ويشار أيضا إلى النواتج فيما يتعلق بعدد الآبار التي يتم الحصول عليها عند بذر البذور. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بيريسيلات الدماغية هي جزء لا يتجزا من NVU وتلعب دورا نشطا في الحث والصيانة من BBB24. المثل ، فان دور هذه الخلايا في اضطرابات الأعصاب المختلفة وامراض الاوعيه الدموية مثير للاهتمام. التالي ، فان كفاءه عاليه الإنتاج الابتدائي نموذج خليه pericyte توفير منصة فعاله للدراسات في المختبر.
وهناك بروتوكولات مختلفه اقترحت لعزل العجانات الاوليه (الشكل 4). واقترح tigges وآخرون17 طريقه بما في ذلك الانسجه القشرية مع السحايا. هذا النهج هو العطاء من الانسجه من 6 الفئران (37 درجه مئوية ، 70 دقيقه الهضم مع الانزيمات papain/DNase) تليها خطوه تفكك عبر 21 G و 18 G الابر. يقترح هذا بروتوكول فصل [ان-بست] (طرد في 22% [بوسني]/[ببس] حل) ان غله علي الأقل 2 كولاجين انا يكسو بئر من 6 بئر لوحه. ويتم الحفاظ علي الخلايا في متوسط نمو الخلايا البطانية (ECGM) حتى مرور 3 وفي وقت لاحق في المتوسط النمو بيريسيلات (PGM) لخلايا العبور لتعزيز انتشار بيريسيلات. وفي نهج مماثل آخر ، اقترح تشن وآخرون18 التفكك الانسجه عن طريق التعامل مع الانسجه مع شفره الحلاقة المعقمة والهضم الانسجه مع كولاجيناسي/dnase ل 90 دقيقه في 37 درجه مئوية. بعد فصل خطوه واحده (طرد في 22 ٪ بوسني) من الخلايا ، يتم أزاله طبقه الميلين ويغسل بيليه مرتين في ECGM. يتم طلاء الاوعيه الدقيقة في 3 ابار من الكولاجين انا المغلفة لوحات 6-حسنا. بعد الوصول إلى التقاء ، يتم الاحتفاظ بالخلايا مرتين وبعد ذلك في PGM. في النهاية ، إذا تم تمرير الخلايا في نسبه 3 ، يمكننا الحصول علي 27 الآبار من لوحات 6-حسنا فقط في استخدام 10 الفئران في بداية البروتوكول.
في Thomsen وآخرون ، يقترح المؤلفون عزل العجان الدماغي عن طريق هضم انزيم من خطوتين19. يتم أزاله السحايا والمادة البيضاء ، ويتم قطع عينات الدماغ إلى قطع صغيره. الأجزاء الانسجه الخضوع للتفاعل الانزيم الأول في كولاجيناسي/DNase ط ل 75 دقيقه في 37 درجه مئوية ، بعد خطوه واحده من الانفصال في 20 ٪ جيش الصرب البوسني. يتم جمع بيليه ومزيد من هضمها في كولاجيناز/ديداز/DNase انا ل 50 min في 37 ° c. ويتبع هذه الخطوة عن طريق فصل الاوعيه الدقيقة في التدرج Percoll 33 ٪ وكذلك غسلها مره واحده. يتم بذر الاوعيه الدقيقة علي الكولاجين IV/fibronectin المغلفة 35 مم الاطباق. ويفضل انتشار البيرولات بنسبه 10 ٪ FCS وسلفات جنتاميسين في DMEM لمده 10 أيام. في نهج آخر من خطوتين انزيم الهضم, Yamazaki وآخرون اقتراح التنميق من الانسجه المثيرة في DMEM20الباردة. في تفاعل الانزيم الأول ، يتم التعامل مع عينات مع كولاجيناسي/DNase انا ل 75 دقيقه في 37 درجه مئوية. بعد خطوه واحده طرد ، يتم غسلها مره أخرى بيليه مره واحده ويبدا رد فعل الانزيم الثاني في كولاجيناز/ديداز ل 60 دقيقه في 37 درجه مئوية. وبعد الانفصال بخطوه واحده ، يعاد تعليق البيليه وطرد في حل 22 في المائة من الجيش الصربي البوسني. وأخيرا ، يتم أعاده تعليق بيليه الاوعيه الدموية المجهرية ومطلي في لوحه 6-حسنا. ل 5 أدمغه الماوس ، 1 جيدا من لوحه 6-حسنا يمكن ان تكون مطليه. للحصول علي pericytes ، يتم تمرير الثقافات البطانية ثلاث مرات في حين الحفاظ عليها في الخلية الدماغية الدماغ البطانية (mBEC) المتوسطة الثاني. كراوتش و Doetsch20 تشير pericyte طريقه تنقيه من قبل facs. عينات الانسجه من القشرة والبطين – منطقه البطين من الدماغ الماوس هي الصغرى تشريح ومفروم تماما مع مشرط. بعد حضانة انزيم كولاجيناز/ديداز لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية ، يتم فصل الانسجه المهضومة عن الميالين والحطام طرد في محلول Percoll v/v بنسبه 22%. ثم يتم احتضان تعليق الخلية في الأجسام المضادة فلوريسسينتلي مترافق ل FACS التحليل والفرز. يتم طلاء الخلايا التي تم فرزها في الآبار المغلفة الكولاجين من 24 لوحه جيدا. ومن المقترح ان القشرة واحده تعطي ما يكفي من الخلايا لطلاء واحد في 1 بئر من لوحه 24 بئر.
حتى لو كانت منتجه ، هذه الأساليب تاتي مع عده قيود ، من استخدام عدد كبير من الماشية لعزل دفعه واحده إلى كميه محدوده جدا من الإنتاج.
خلال تطوير هذا البروتوكول المقترح ، كنا ناجحين في الحصول علي الإنتاج العالي: 9 ابار من 6-بئر لوحه من عدد قليل من 10 الفئران. ولهذا الغرض ، فان أزاله السحايا تضمن أزاله الاوعيه الكبيرة من الانسجه بخطوه واحده. مطحنه الانسجه داونصه هو أكثر ملاءمة للانسجه الرخوة مثل الدماغ. كما يضمن الحد من العينة مع المدقه فضفاضة ، والتجانس مع مدقه ضيق ، ويمنع الضرر الخلوية غير الضرورية. واحده من الأهداف الرئيسية في بروتوكولات ثقافة الخلايا الاوليه هو الحد الأدنى من النفايات من الانسجه واسترداد موسعه من الاوعيه الدموية الدماغية. في البروتوكول المعروض ، يتم تحقيق ذلك من خلال الطرد المتكررة من الانسجه المتجانسة التي غرست في النسيج. نهج طرد من ثلاث خطوات يساعد علي استعاده كميات كبيره من الاوعيه الدموية من الانسجه المتجانسة. وهذا يوفر الانتعاش 3x تعزيز الاوعيه الدقيقة. بعد الانفصال ، الترشيح هو الخطوة الاساسيه التالية ، التي تفضل استبعاد الخلايا العضلية الملساء المرتبطة بالاوعيه الكبيرة. كما ذكر قبل مزيج من الانزيمات المختلفة وقد اقترح للهضم الانزيمي. في حين يتم استخدام DNase و collagenase/الاستغناء للحد من كتل من الخلايا وعزل الخلايا المفردة علي التوالي ، فمن المهم جدا لمنع موت الخلايا في مثل هذه البيئة الغازية ويتم منع هذا من قبل TLCK ، مما يزيد من العائد النهائي. في البداية ، يسمح للممر الأول ان ينمو أحادي الطبقة البطانية ، والذي يدعم في وقت لاحق نمو العجانات المرفقة علي الانفرادي. منذ البقاء علي قيد الحياة من الخلايا البطانية الاوليه عند المرور ، فانه يعزز احتمال لاستخراج pericyte. وعلاوة علي ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول مرور آخر يضمن تجنب تلوث الخلايا البطانية. وتجدر الاشاره إلى انه مع وجود عدد أكبر من الخلايا من P2 ، يتم تقليل الاعتماد علي مزيد من المرور من الخلايا. الاضافه إلى ذلك ، فانه يقلل من امكانيه النمو pericyte التي تجاوزتها خلايا العضلات الملساء ، والتي تتكاثر علي معدل اعلي بكثير.
من أجل تحقيق إنتاج اعلي ، هناك العديد من الخطوات التي هي حاسمه ويجب ان يتم تنفيذها بدقه فيما يتعلق بدرجه الحرارة والوقت. يجب ان يكون خلط الانسجه المتجانسة في الجيش الصربي البوسني-ديدككان سريعا. التفكك بيليه بعد الخطوات طرد ينبغي ان تكون سريعة لمنع موت الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان يتم 33 دقيقه من الهضم الانزيمي بدقه وعناية. واحده من القيود لهذا البروتوكول هو 7-8 المدة اليوم الذي يسمح الأحادي البطانية للنمو وزيادة تسهيل نمو العجان. ومن الواضح ان عزله الاوعيه المجهرية هي بوتر ، ونمو الأحادي أسرع ، التالي هناك عدد متزايد من العجانات. فمن المستحسن عدم استخدام اقل من 10 الفئران في كل استخراج لضمان عدد كاف من كسور الاوعيه الدقيقة لدعم النمو perسيلات أكثر من ذلك. إذا تم اتباع النقاط المذكورة أعلاه بعناية ، يمكن تحقيق كثافة الخلية المطلوبة للثقافة pericyte الدماغية بسهوله.
في نماذج المختبر توفير منصة ممكنة لتطوير نماذج مشتقه للحصول علي مزيد من المعلومات حول الاهميه المرضية والاتصالات بين الخلايا الأخرى من NVU خلال الاضطرابات العصبية. ويمكن دمج العجانات المعزولة في الثقافة الخلوية الثنائية (مع الخلايا البطانية أو الحلزونية) والثقافة الخلوية الثلاثية (الخلايا البطانية والكريات الدخليه). ولم تتم مناقشه تطوير هذه النماذج هنا. وفي الختام ، يوفر هذا البروتوكول نهجا واحدا لعزل الخلايا الاوليه ذات الإنتاج الأعلى ومنصة أفضل للبحوث المختبرية المتعلقة بالبيولوجيا المخية الدماغية.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد منحت الوكالة الوطنية للبحوث (ANR, جبوج-0010) في اطار البرنامج المشترك للاتحاد الأوروبي – البحوث المتعلقة بامراض الأعصاب (جبند) لمشروع كره الثلج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
