Summary
我们提出了提取鼠脑围细胞的规程。该方案基于无抗生素富集定向围取剂，是体外研究提供高纯度、高产量的宝贵工具，从而减少了实验动物的数量。
Abstract
近年来，脑血管发育已成为血管生物学和病理学广泛研究的重点。围脑在血脑屏障形成和生理学中的重要性现已得到证明，但其分子基础在很大程度上仍不得而知。由于脑围细胞在神经系统疾病中的病理生理学作用是耐人寻味和重要的，体外模型不仅足够合适，而且能够纳入这些研究的不同技术。提出了几种方法，作为脑围取物提取的体外模型，尽管高产量的无抗生素方案是可取的。最重要的是，一种提高每次提取产量的方法减少了更多动物的使用。
本文提出了一种简单有效的提取具有足够高产出的脑质围细胞的方法。小鼠脑组织均质化与BSA-dextran溶液混合，用于分离组织碎片和微血管颗粒。我们建议分三步分离，然后进行过滤，以获得丰富的微容器滤液。用这种方法，从10只小鼠身上获得的微血管碎片数量足以使6孔板的9孔（每孔9.6厘米2）的种子。最有趣的是，使用该协议，用户可以在通道2中获得27口丰井（每口9.6厘米2）。通过经典围盘标记的表达，证实了围生培养物的纯度：NG2、PDGFR-+和CD146。该方法为围细胞的生理和病理生理学研究提供了一种高效可行的体外工具。
Introduction
脑围细胞是神经血管单元（NVU）的重要组成部分，它包括血脑屏障（BBB）、胶质细胞、细胞外基质和神经元的脑内皮细胞的功能单元。围细胞是中枢神经系统（CNS）调节功能的重要组成部分，因为它们是分子和细胞信息交换的接口之一。
大脑围盘嵌入大脑微血管的侧，对于建立1和维持2个 BBB 生理学至关重要。近期的几部作品也突出了脑围细胞在血管生成3和血管成熟4、内皮形态生成5和生存6中的作用，以及控制大脑胆固醇代谢7的作用。重要的是，这些过程的调节失调是神经退行性疾病的病因特征。
事实上，围卵体是正常BBB功能的功能必需品，它防止几种神经系统疾病的发展。减生生理学和血样丧失是阿尔茨海默氏病8种进展的常见分母，白质功能障碍9，多发性硬化症10，败血性脑病11，急性期缺血性中风12和其他神经系统疾病。围卵体也有助于肿瘤转移13。有趣的是，在神经创伤和疾病之后，围细胞也表现出一种拯救作用：在脑1的再骨髓、缺血性中风、脊髓损伤14和促进血管生成15。围观的易感性，以加强神经创伤和紊乱的病理生理学表现，使他们成为潜在的治疗目标16。
BBB中围卵体体体研究模型是进行广泛研究的重要工具。这些模型通过表示 BBB 等的工作模型，为更详尽的研究提供了一个平台。例如，这些模型可用于了解围细胞内的细胞生理学以及NVU的其他细胞类型。此外，体外模型是测试新药和分子对围细胞的药理作用的第一手研究工具。这些模型也可以用来理解围细胞在神经系统疾病中的病理生理学作用。然而，体外模型的发展需要增加输出，以实现实验自由。这些模型应该简单快捷，并减少实验动物使用的数量。此外，能够将此类模型开发为双细胞和三元细胞培养模型是可取的。
已经开发了许多协议。提格斯等人17、陈等人18、汤森等人19人、山崎拓等人20人、克劳奇和多奇21人提出的议定书是满足大多数必需品的值得称赞的方法。所有这些方法都产生了有效的结果，但是对大量实验动物的依赖仍然是这些协议的一个共同点。因此，必须开发一种高输出方法，以尽可能高的效率隔离和纯化围细胞。在此协议中，使用多个围细胞标记验证第二次通道后获得的细胞纯度。我们检查了血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β），它被用作围脑17的经典标记物，以及NG2（神经元胶质抗原2），它是围脑介导血管形态发生22和血管化23的标记。我们还检查了分化146（CD146）的簇，这被报告为在Pericys17，18中表达的分子之一。
在这里，我们提出了从小鼠（野生型或转基因）中提取原生游生物的协议，它将满足上述所有要求，并实现高产量。我们采用抗生素和免疫盘自由选择为基础的初级脑围盘增殖方法，这将证明自己是进行体外研究的有效模型。
Protocol
所有实验都按照研究所的动物使用和处理指南进行。根据法国法律，阿尔托依大学的动物设施已得到地方当局的批准（编号：B62-498-5）。根据欧盟立法（第2010/63/EU号指令），所有程序均由当地动物护理和使用委员会（北帕斯-德卡莱动物研究委员会，参考：C2EA 75）和法国研究部（参考：201509011541152）批准。
1. 准备解决方案
- 在汉克平衡盐溶液（HBSS）中制备500 mL的洗涤缓冲液A（WBA）：10 mM HEPES溶液。储存在4°C。
- 在 HBSS 中制备 500 mL 的洗涤缓冲液 B （WBB）：0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 与 10 mM HEPES 溶液。储存在4°C。
- 在WBA中制备300 mL的30%dextran溶液，在室温下过夜混合溶液。在110°C下对溶液进行高压灭菌，在使用前30分钟。高压灭菌后，让溶液在室温下休息2-3小时，将溶液储存在4°C。
- 在冷dextran溶液中制备100 mL 0.1%BSA溶液。剧烈摇动3-4分钟，储存在4°C。
- 通过在基础DMEM介质中溶解20%小牛血清、2mM谷氨酰胺、50μg/mL金霉素、1%维生素、2%氨基酸碱基中鹰（BME），制备完整的Dulbeco改性鹰培养基（DMEM），并储存在4°C。在使用前加入1纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）。
- 通过在围生培养基培养基培养基培养基培养基培养基培养中添加围生生长补充剂（与围生培养素培养素培养素）和20%胎儿小牛血清（FCS）制备完整的围生培养物，并储存在4°C。
2. 脑组织恢复和脑脑切除
- 为保持一致性，在每批萃取中使用年龄相仿和性别相同的小鼠。使用无病原体的动物庇护所，并提供获得水的机会。为了确保动物的效率和使用，避免组织材料的损失。
- 安乐死C57BL/6J，4-6周大，雄性小鼠（扬维尔实验室，法国圣岛勒）。
- 在无菌条件下快速切除脑组织，避免对组织的任何损伤。小心地将组织置于40 mL的冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 将冷PBS中的脑组织转移到培养皿（100毫米x15毫米）。
- 将脑组织放在无菌无绒擦拭上，并用弯曲的尖钳，去除小脑、纹状体和腹神经。
- 用棉签去除所有可见的脑膜炎。将脑组织倒置放置，并用棉签用向外轻描边打开叶。去除所有可见的血管。
- 将脑筋自由脑组织放入培养皿（100毫米 x 15毫米），带15 mL的冷WBB。
3. 同质化
- 将组织转移到大球组织磨砂管中，用钳子加入3-4 mBB的WBB。
- 用"松弛"的虫子切碎组织55次。用 WBB 冲洗"松弛"的刺。现在，用"紧"的虫子切碎浆料25次。
- 将浆料平均分成两个 50 mL 管，加入 1.5 倍的冷 30% BSA-dextran 体积，大力摇动管以混合浆料。
4. 血管分数的分离
- 剧烈摇动管后，在3，000 x g和4°C下离心管25分钟。
- 将上清液（连同上骨髓层）转移到2个新管中，在3，000 x g和4°C下离心25分钟。通过加入3 mL的冷WBB（保持颗粒在4°C）从第一个离心中保存颗粒。
- 重复步骤 4.2 并小心地保存从第 2个离心的颗粒。
- 从步骤4.3中丢弃从管子中的组织碎片的dextran和骨髓。将颗粒保存在冷 WBB 中。
- 从步骤 4.1 将管 1 和管 2 的内容汇集起来，最后体积为 10 mL，带冷 WBB。
- 对步骤 4.2 和步骤 4.3 中的管重复此步骤。
注：最后，有3个管从3离心。 - 使用 10 mL 移液器用 6 向上和向下冲程分离颗粒，直到颗粒没有可见的团块残留。
- 借助真空过滤器组件和尼龙网状过滤器，过滤每个管的电池悬浮液。
注：此过滤步骤对于通过网状过滤器去除更长/更大的容器非常重要。 - 在室温下，借助平尖钳或 WBB 中的刮刀，通过刮擦过滤器来恢复和重新悬浮毛细血管。使用新过滤器过滤悬浮液以恢复更多毛细血管
- 将滤液平均分成两管，在 1，000 x g和 RT 下将离心机7分钟。
注：在此离心步骤中，准备酶溶液。根据使用的动物数量确定所需的WBB体积（见材料表）。在WBB中加入1倍的DNase 1和1x的Tosyl-L-l-盐酸乙烷（TLCK）（见材料表），预温至37°C。 - 用酶预加热的WBB在一个管中收集步骤4.10中的颗粒。加入预加热的1x胶原酶/消胶酶。将管子放在37°C的摇摇台水浴中，精确33分钟。
- 加入30 mL的冷WBB，停止酶反应。在 1，000 x g和 RT 下将悬架离心 7 分钟。
- 小心地丢弃上清液，并使用 10 mL 移液器将 WBB 中的颗粒分离，向上和向下冲程 6 次。这一步应该不那么严格，而且相对来说要快一些。
- 在 1，000 x g和 RT 下将悬架离心 7 分钟。
注：在此步骤中，从培养皿中丢弃涂层，并在室温下用 DMEM 冲洗一次。在 RT 处将细胞培养皿涂覆至少 1 小时。 - 从步骤 4.14 中获得的管中丢弃上清液，并在新的完整 DMEM 介质中分离颗粒，在 9 口 6 孔板（1 口 9.6 厘米2口）中将细胞（第 0 天，P0）板。
5. 脑血管扩散
- 在无菌培养箱中保持细胞培养在37°C和5%CO2。在电镀电池 24 小时（第 1 天）后，通过小心地清除碎屑来更换培养层。第 1 天后，每 48 小时更改一次区域性介质。
- 观察细胞培养至少7-8天。此时，内皮单层顶部的细胞生长应该是可观察到的。
- 在明胶涂层培养板上的围流培养基中通过通道1（P1），在第8-10天（取决于汇合）中通过细胞。每 2 天更改一次文化介质。观察细胞6-7天。细胞在第17天再次连续分裂至通道2（P2），第24天仅在第24天通过3（P3），在明胶涂层板中生长在过节培养基中。
注：细胞应准备好在近80-90%的汇合下进行实验/观察。
Representative Results
此协议（图 1） 在 P0 播种时有效产生 9 口井（6 孔板）（图 2A（P0：第 1 天）。
从P0到P2，有特定的形态特征，通过这些特征可以观察到内皮细胞（用白色箭头表示）和围细胞的逐渐增加（用黑色箭头表示）。在P0中，从微血管发育的细长内皮细胞是丰度（图2A，P0：第3天），而这种拉长细胞的丰度在P1中减少，在P2中不存在。相反，在P2中，围卵体表现为丰富的四边形细胞（图2A，P2：第18天）。
为了确认P2中过冰菌培养物的纯度，我们使用定量PCR（图2B）、免疫细胞化学（图2C）和西印（图3）检查了NG2、CD146和PDGFR-beta作为过核子标记的表达。与小鼠大脑总（Ms Br）提取物中的表达相比，P2中的围杨表示更高的CD146、NG2和PDGFR-+水平。作为对照，在P2中也观察到内皮标记物闭塞和CD31、星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和微胶合标记CD11b的表达。
图 1：协议摘要。此轮廓表示围取提取的关键步骤，首先从玻璃刺磨机的组织分解开始，然后进行 dextran 和过滤的 3 步分离。该协议采用33分钟的酶消化步骤。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：细胞形态和标记表达。（A） 在 P0、P1 和 P2 扩散阶段中，围冰体相对比图像。P0 中的丰富内皮细胞用白色箭头表示。它们的数量在P1中减少，在P2中消失。圆周由黑色箭头指示。（B） 在P2中用多微体对P146、NG2和PDGFR-α表达进行PCR分析，在P1和小鼠大脑（Ms Br）样本中具有围细胞。（C） P2中具有代表性的围细胞图像，显示CD146、PDGFR-+和NG2的免疫染色阳性。刻度条：50 μm（20 倍放大倍数）和 20 μm（40 倍放大倍数）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：细胞培养物的代表性纯度。分析CD146，PDGFR-α，NG2，块状，GFAP，CD31，CD11b和图布林表达，通过西方印迹在P2和小鼠大脑（Ms Br）样本中。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：组织分解、纯化、浓缩和酶消化的不同方法的代表性比较。每个已发布的协议都用指示来概括每个协议所使用的动物数量。还就播种时获得的井数指明了产出。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
脑围细胞是NVU不可分割的一部分，在BBB24的诱导和维护中发挥了积极作用。同样，这些细胞在不同的神经退行性疾病和血管病变中的作用是耐人寻味的。因此，高效的高输出原发性细胞模型将为体外研究提供一个有效的平台。
对于主围细胞的隔离，提出了各种协议（图4）。Tigges等人17日提出了一种方法，包括皮质组织与脑膜炎。这种方法是招标组织从6小鼠（37°C，70分钟消化与木瓜素/DNase酶），然后通过21G和18G针分解步骤。该协议建议一步分离（在22%BSA/PBS溶液中离心），产生至少2个胶原蛋白I涂层孔的6孔板。细胞在内皮细胞生长培养基（ECGM）中保持，直到通过3，后来在过膜生长培养基（PGM）中，用于通过细胞，以促进围细胞增殖。在另一种类似方法中，陈等人18建议在37°C下用灭菌的剃刀刀片切碎组织，用胶原酶/DNase进行组织消化90分钟。细胞的一步分离（在22%BSA中离心）后，去除骨髓层，在ECGM中洗涤颗粒两次。微血管被镀在3孔胶原蛋白我涂6孔板。到达汇合后，细胞通过两次，后来在PGM中维持。最后，如果细胞以3的比例传递，我们只有在协议开始时使用10个小鼠时，才能获得27口6孔板。
在汤姆森等人中，作者建议通过两步酶消化分离大脑围细胞。脑和白质被去除，大脑样本被切成小块。组织片在胶原酶/DNase I中进行第一次酶反应，在37°C下进行75分钟，在20%BSA中分离一个步骤。在37°C下，在胶原酶/消酶/DNase I中收集并进一步消化颗粒50分钟。这一步之后是微容器分离在33%Percoll梯度和进一步洗涤一次。微血管被播种在胶原蛋白IV/纤维蛋白涂层35毫米的菜肴。在DMEM中，10%的FCS和亚霉素硫酸盐在DMEM中受到10%的FCS和亚霉素的增殖。在另一种两步酶消化方法中，山崎等人建议在寒冷的DMEM20中切碎被切除的组织。在第一次酶反应中，样品在37°C下用胶原酶/DNase I处理75分钟。一步离心后，颗粒再次洗涤一次，并在胶原酶/消糖中启动第二次酶反应，在37°C下进行60分钟。一步分离后，颗粒在22%BSA溶液中重新悬浮和离心。最后，将微血管颗粒重新悬浮在6孔板中。对于5个小鼠大脑，1孔6孔板可以镀。为了获得围细胞，内皮培养体在小鼠大脑内皮细胞（mBEC）介质II中维持时，通过三次。克劳奇和多奇20建议由FACS的围卵净化方法。来自小鼠大脑皮层和心室-心室-下室区域的组织样本被微解剖，用手术刀彻底切碎。胶原酶/消酶在37°C下孵育30分钟后，在22%v/v Percoll溶液中分离消化的组织与骨髓和碎屑离心。然后，在荧光结合抗体中孵育细胞悬浮液，用于FACS分析和分类。分类的细胞被镀在胶原蛋白涂层的24孔板。建议一个皮层产生足够的细胞，在24孔板的1孔中一个电镀。
即使生产，这些方法也有几个限制，从使用大量动物进行单批次隔离到输出量非常有限。
在开发这个建议的协议过程中，我们成功地获得了高产量：从10只小鼠中获得9口6孔板。为此，去除脑膜炎可确保一步从组织中取出大型血管。大球组织磨床更适合于大脑等软组织。它还确保通过松散的虫子减少样品，与紧绷的虫子同质化，并防止不必要的细胞损伤。初级细胞培养方案的主要目标之一是减少组织浪费和延长脑血管检索。在提出的协议中，这是通过重复离心的dextran-BSA注入组织均质实现。三步离心方法有助于从组织均质中恢复大量血管。这提供了3倍的微容器回收。分离后，过滤是下一个必不可少的步骤，有利于排除平滑肌细胞相关的大血管。正如前面提到的，不同的酶的组合已经提出酶消化。虽然DNase和胶原酶/消血酶分别用于减少细胞团块和分离单个细胞，但防止细胞在此类侵入性环境中死亡非常重要，而TLCK可以预防这种死亡，从而提高最终产量。最初，第一个段落允许生长内皮单层，后来支持在单层上附加的围目的生长。由于原发内皮细胞的存活率在通过后减少，提高了内皮细胞的取回概率。此外，该协议采用了另一种通过，确保避免内皮细胞污染。应该注意的是，随着P2的细胞数量增加，细胞对进一步传递的依赖性降低。此外，它减少了坐前生长被平滑肌细胞超越的可能性，平滑肌细胞以高得多的速度增殖。
为了实现更高的输出，有几个步骤至关重要，应该根据温度和时间准确执行。组织均质混合到BSA-dextran中应该很快。离心步骤后的颗粒分离应迅速防止细胞死亡。此外，33分钟的酶消化应精确和小心。该协议的一个限制是7-8天的持续时间，内皮单层被允许生长，并进一步促进围细胞的生长。显然，微血管的隔离是btter，单层的生长更快，因此有增加的虹动。建议每次提取时不要使用少于10只小鼠，以确保有足够的微血管分数来支持其进一步生长。如果仔细遵循上述点，很容易达到脑血管培养所需的细胞密度。
体外模型为衍生模型的开发提供了一个可行的平台，以获取有关神经紊乱期间NVU其他细胞之间的病理生理学相关性和通信的更多信息。分离的围细胞可以纳入双细胞培养（内皮或胶质细胞）和三细胞培养（内皮细胞和胶质细胞）模型中。这里尚未讨论这些模型的开发。总之，该协议为分离具有较高产出的原发细胞提供了一种方法，并为与脑血管生物学相关的体外研究提供了更好的平台。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
LT 和 FG 由国家重建局（ANR，ANR-15-JPWG-0010）在欧盟联合方案 – 神经退行性疾病研究 （JPND） 项目 SNOWBALL 的框架内授予。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
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