Summary
We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.
Abstract
In de afgelopen jaren, cerebrale pericytes zijn uitgegroeid tot de focus van uitgebreid onderzoek in vasculaire biologie en pathologie. Het belang van pericytes in de bloed-hersen barrière vorming en fysiologie wordt nu aangetoond, maar de moleculaire basis blijft grotendeels onbekend. Aangezien de pathofysiologische rol van cerebrale pericytes aan neurologische aandoeningen intrigerend is en van groot belang, zijn de in vitro modellen niet alleen voldoende geschikt maar ook in staat om verschillende technieken voor deze onderzoeken op te nemen. Verschillende methoden zijn voorgesteld als in vitro modellen voor de extractie van cerebrale pericytes, hoewel een antibioticum-vrij protocol met een hoog vermogen wenselijk is. Het allerbelangrijkste is dat een methode met een toegenomen output per extractie het gebruik van meer dieren vermindert.
Hier, wij stellen voor een eenvoudige en efficiënte methode voor het extraheren van cerebrale pericytes met voldoende hoge output. Het muis hersenweefsel homogeniëren wordt gemengd met een BSA-dextran-oplossing voor de scheiding van het weefsel puin en de microvasculaire pellet. We stellen een scheiding van drie stappen voor, gevolgd door filtratie om een permeabiliteit rijk filtraat te verkrijgen. Bij deze methode is de hoeveelheid microvasculaire fragmenten verkregen uit 10 muizen voldoende om 9 putjes (9,6 cm2 elk) van een 6-Wells plaat te zaaien. Het meest interessant met dit protocol, de gebruiker kan verkrijgen 27 pericyte Rich Wells (9,6 cm2 elk) in passage 2. De zuiverheid van de pericyte culturen wordt bevestigd met de uitdrukking van klassieke pericyte markers: NG2, PDGFR-β en CD146. Deze methode demonstreert een efficiënte en haalbare in-vitro tool voor fysiologische en pathofysiologisch onderzoek op pericytes.
Introduction
Cerebrale pericytes zijn een essentieel onderdeel van de neurovasculaire eenheid (NVU), die bestaat uit een functionele eenheid met de cerebrale endotheliale cellen van de bloed-hersen barrière (BBB), gliacellen, extracellulaire matrix en neuronen. Pericytes zijn een essentieel onderdeel van de gereguleerde werking van het centrale zenuwstelsel (CNS), omdat ze fungeren als een van de interfaces voor de uitwisseling van moleculaire en cellulaire informatie.
Cerebrale pericytes zijn ingebed in de abluminale kant van de micro vaten van de hersenen, en zijn essentieel voor het vestigen van1 en het handhaven van2 de BBB fysiologie. Verschillende recente werken hebben ook de rol van cerebrale pericytes in angiogenese3 en het vat maturatie4, endotheliale morphogenesis5 en Survival6benadrukt, en bij het beheersen van de hersenen cholesterol metabolisme7. Belangrijk, de disregulatie in een van deze processen zijn etiologische kenmerken van neurodegeneratieve ziekten.
Inderdaad, pericytes is een functionele noodzaak voor normale BBB-werking en de bescherming tegen de progressie van verschillende neurologische aandoeningen. Degenererende fysiologie en verlies van pericytes zijn gemeenschappelijke noemers in de progressie van de ziekte van Alzheimer8, neuronale verlies tijdens witte stof dysfunctie9, multiple sclerose10, septische encefalopathie11, acute fase ischemische beroerte12 en in andere neurologische aandoeningen. Pericytes zijn ook instrumentaal in tumor metastasen13. Belangwekkend, pericytes is ook aangetoond dat het vertonen van een reddings functie na neurologische trauma en aandoeningen: in remyelinisatie in hersenen1, ischemische beroerte, ruggenmergletsel14 en bevordering van angiogenese15. De gevoeligheid van pericytes ter versterking van de pathofysiologische manifestatie van neurologische trauma en aandoeningen maakt hen een potentieel therapeutisch doel16.
In vitro onderzoek modellen van pericytes in de BBB zijn belangrijke instrumenten om uitgebreide studies uit te voeren. Deze modellen bieden een platform voor meer uitgebreide studies door het vertegenwoordigen van Werkmodellen van de BBB en meer. Deze modellen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de cellulaire fysiologie binnen pericytes en onder andere celtypen van de NVU te begrijpen. Ook, in vitro modellen zijn uit de eerste hand onderzoek tools voor het testen van de farmacologische invloed van nieuwe drugs en moleculen op pericytes. Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om te begrijpen van de pathofysiologische rol van pericytes in verband met neurologische aandoeningen. Niettemin, de ontwikkeling van in vitro modellen vereist een verhoogde output om experimentele vrijheid mogelijk te maken. Deze modellen moeten gemakkelijk en snel zijn en het aantal gebruikte proefdieren verminderen. Bovendien is de mogelijkheid om dergelijke modellen te ontwikkelen tot een dubbele en drievoudige celkweek modellen wenselijk.
Er zijn veel protocollen die zijn ontwikkeld. De protocollen die door Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20en Crouch en DOETSCH21 zijn voorgesteld, zijn prijzenswaardige benaderingen die voldoen aan de meeste benodigdheden. Al deze methoden opleveren effectieve resultaten, maar de afhankelijkheid van een groot aantal proefdieren blijft een gemeenschappelijke noemer voor deze protocollen. Daarom wordt het verplicht om een hoge uitgangs methode te ontwikkelen die pericytes met maximaal mogelijke efficiëntie kan isoleren en zuiveren. In dit protocol wordt de zuiverheid van de cellen die na een tweede passage zijn verkregen, geverifieerd met verschillende pericytes markers. We checkten op bloedplaatjes-afgeleide groei factor receptor-β (PDGFR-β), die wordt gebruikt als een klassieke marker van pericytes17, en voor ng2 (neuron-glial antigeen 2), wat is een marker van pericyte gemedieerde vasculaire morphogenesis22 en vascularisatie23. We hebben ook gecontroleerd op cluster van differentiatie 146 (cd 146), dat is gerapporteerd als een van de moleculen uitgedrukt in de pericytes17,18.
Hier presenteren we een protocol voor de extractie van primaire pericytes aan muizen (wild type of transgenics) dat voldoet aan alle bovengenoemde eisen met een hoog vermogen. We hanteren een antibioticum en immunopanning Vrije selectie-gebaseerde methode van proliferatie voor de primaire cerebrale pericytes, die zichzelf een efficiënt model zal bewijzen voor het uitvoeren van in vitro studies.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Instituut voor het gebruik en de hantering van dieren. In overeenstemming met de Franse wetgeving is de dieren faciliteit aan de Universiteit van Artesië goedgekeurd door de lokale autoriteiten (Referentie: B62-498-5). In overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie (richtlijn 2010/63/EU) werden alle procedures goedgekeurd door de plaatselijke Dierenzorg-en gebruiks Commissie (Comité d'Ethique en expérimentation animale du Nord-Pas-de-Calais, referentie: C2EA 75) en het Franse Ministerie van onderzoek (Referentie: 2015090115412152).
1. voorbereiding van de oplossingen
- Bereid 500 mL Wasbuffer A (WBA): 10 mM HEPES-oplossing in de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS). Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 500 mL Wasbuffer B (WBB): 0,1% boviene serum albumine (BSA) met 10 mM HEPES-oplossing in HBSS. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 300 mL 30% dextran oplossing in WBA door de oplossing 's nachts op kamertemperatuur te mengen. Autoclaaf de oplossing bij 110 °C gedurende 30 minuten voor gebruik. Na autoclaven, laat de oplossing rusten op kamertemperatuur voor 2-3 h. Bewaar de oplossing bij 4 °C.
- Bereid 100 mL 0,1% BSA oplossing in koude dextran oplossing. Schud krachtig gedurende 3-4 min en bewaar op 4 °C.
- Bereid complete Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) cultuur media voor door het oplossen van 20% kalf serum, 2 mM glutamine, 50 μg/mL gentamycine, 1% vitaminen, 2% aminozuren basale medium Eagle (BME) in basale DMEM media en bewaren bij 4 °C. Voeg 1 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF) toe vóór gebruik.
- Bereid complete pericyte media voor door toevoeging van pericyte groei supplementen (voorzien van de pericyte media) en 20% foetaal kalf serum (FCS) in pericyte cultuur basale media en bewaren bij 4 °C.
2. herstel van hersenweefsel en verwijdering van hersenvliezen
- Voor consistentie, gebruik van muizen van dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht in elke batch van extractie. Gebruik een pathogeen-vrij dierenasiel en geef ad libitum toegang tot water. Voorkom verlies van weefsel materiaal om de efficiëntie en het minimale gebruik van dieren te garanderen.
- Euthanize C57BL/6J, 4-6 weken oud, mannelijke muizen (janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankrijk).
- Snel accijns het hersenweefsel in steriele omstandigheden, Vermijd beschadiging van het weefsel. Plaats het weefsel voorzichtig in 40 mL koudfosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Breng het hersenweefsel in koude PBS over naar een Petri schaaltje (100 mm x 15 mm).
- Plaats het hersenweefsel op een steriel droog pluisvrij doekje en met gebogen punt Tang, verwijder het cerebellum, het striatum en de occipitale zenuwen.
- Verwijder alle zichtbare hersenvliezen met een wattenstaafje. Plaats het hersenweefsel ondersteboven en open de lobben met een wattenstaafje met behulp van lichtlijnen die naar buiten gaan. Verwijder alle zichtbare bloedvaten.
- Plaats de hersenvliezen in een Petri schaaltje (100 mm x 15 mm) met 15 mL koude WBB.
3. homogenisatie
- Overdracht van het weefsel naar een Dounce weefsel Grinder mortel buis en voeg 3-4 mL WBB met Tang.
- Mince het weefsel met een ' losse ' stamper 55 keer. Spoel de ' losse ' stamper met WBB. Nu gehakt de slurry met een "strakke" stamper 25 keer.
- Verdeel de slurry gelijkmatig in 2 50 mL buizen en voeg 1,5 x volume koude 30% BSA-dextran toe, schud de buizen krachtig om de slurry te mengen.
4. isolatie van de vasculaire Fractie
- Na krachtig schudden van de buizen, centrifugeer de buizen 25 min bij 3.000 x g en 4 °c.
- Breng de supernatant (samen met de bovenste myeline-laag) over naar 2 nieuwe buisjes en centrifugeer de buizen 25 minuten bij 3.000 x g en 4 °c. Bewaar de pellets van de eerste centrifugeren door 3 mL koude WBB toe te voegen (Houd de pellet bij 4 °C).
- Herhaal stap 4,2 en bewaar de pellets voorzichtig van 2ND centrifugeren.
- Gooi de dextran en de myeline weg met weefselresten uit de buizen van stap 4,3. Bewaar de pellets in koude WBB.
- Zwembad de inhoud van buis 1 en buis 2 van stap 4,1 en maak tot het laatste volume van 10 mL met koude WBB.
- Herhaal deze stap voor buizen uit stap 4,2 en stap 4,3.
Opmerking: ten slotte zijn er 3 buizen van 3 centrifugaties. - Dissocieren van de pellet met 6 omhoog en omlaag slagen met behulp van een 10 mL Pipet, totdat er geen zichtbare klontjes van de pellets overgebleven.
- Met behulp van een vacuüm filter assemblage en de nylon mesh filter, filter de celsuspensies van elke buis.
Let op: deze filtratie stap is belangrijk om langere/grotere vaten te verwijderen via het mesh filter. - Herstel en rebreng de capillairen door het filter te schrapen met behulp van een platte punt Tang of een schraper in WBB bij kamertemperatuur. Filter de suspensie met een nieuw filter om meer capillairen te herstellen
- Verdeel het filtraat gelijkmatig in twee buisjes en Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 1.000 x g en RT.
Let op: tijdens deze centrifugeren stap bereidt u de enzymatische oplossing voor. Bepaal het volume van WBB dat nodig is volgens het aantal gebruikte dieren (Zie tabel met materialen). Voeg 1x DNase 1 en 1x Tosyl-L-lysyl-chlooromethinehydrochloride (TLCK) toe (Zie tabel met materialen) in WBB en pre-warm tot 37 °c. - Verzamel de pellets van stap 4,10 in één buis met voorverwarmde WBB met enzymen. Voeg pre-warmed 1x Collagenase/dispase toe. Plaats de buis in het schud bare waterbad op 37 °C voor precies 33 min.
- Stop de enzym reactie door 30 mL koude WBB toe te voegen. Centrifugeer de suspensie gedurende 7 minuten bij 1.000 x g en RT.
- Gooi het supernatant voorzichtig weg en dissocieren de pellet in WBB met 6 omhoog en omlaag slagen met een 10 mL pipet. Deze stap moet minder streng en relatief sneller zijn.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 7 minuten bij 1.000 x g en RT.
Opmerking: Gooi tijdens deze stap de coating van de kweek gerechten weg en spoel ze één keer met DMEM bij kamertemperatuur. Coat celkweek gerechten voor ten minste 1 uur bij RT. - Gooi de supernatant uit de buis verkregen bij stap 4,14, en dissocieren de pellet in nieuwe volledige DMEM media, plaat de cellen (dag 0, P0) in 9 putjes van 6-Wells platen (1 put van 9,6 cm2 elk).
5. proliferatie van cerebrale pericytes
- Houd de celculturen bij 37 °C en 5% CO2 in een steriele incubator. Vervang de kweekmedia na 24 uur (dag 1) van het beplating van de cellen door het vuil voorzichtig te verwijderen. Na dag 1, verander de cultuur media in elke 48 h.
- Observeer ten minste 7-8 dagen de celcultuur. Tegen deze tijd, cellulaire gezwellen op de top van endotheliale unilayer moet observeerbaar.
- Passage van de cellen op dag 8-10 (afhankelijk van de confluentie) in pericyte cultuurmedium naar passage 1 (P1) op gelatine gecoate cultuur platen. Verander de kweekmedia in elke 2 dagen. Observeer de cellen gedurende 6-7 dagen. Cellen worden opeenvolgend opnieuw gesplitst naar passage 2 (P2) op dag 17 [en passage 3 (P3) op dag 24 alleen indien nodig], gekweekt in pericyte medium in gelatine gecoate platen.
Opmerking: cellen moeten klaar zijn voor experimenten/observatie bij bijna 80-90% confluentie.
Representative Results
Dit protocol (Figuur 1) levert op efficiënte wijze 9 putjes (van 6-Wells platen) op het moment van zaaien bij P0 (Figuur 2A (P0: dag 1)).
Van P0 tot P2 zijn er specifieke morfologische kenmerken waarmee endotheel cellen (aangeduid met witte pijlen) en s geleidelijke toename van pericytes (aangeduid met zwarte pijlen) kunnen worden waargenomen. In P0 zijn de langwerpige endotheel cellen die zich ontwikkelen van micro vaten in overvloed (Figuur 2A, P0: dag 3), terwijl de overvloed van dergelijke langwerpige cellen wordt verlaagd in P1 en afwezig in P2. Integendeel, de pericytes verschijnen als vierhoek cellen die overvloedig zijn in P2 (Figuur 2A, P2: dag 18).
Om de zuiverheid van de pericyte cultuur in P2 te bevestigen, controleerden we de uitdrukking van ng2, CD146 en pdgfr-Beta als pericyte markers met behulp van kwantitatieve PCR (Figuur 2B), immunocytochemie (Figuur 2C) en Western Blot (Figuur 3). Pericytes in P2 Express hogere niveaus van CD146, NG2 en PDGFR-β in vergelijking met de uitdrukking in totale muis hersenen (MS BR) extract. Als controle werden ook de expressie van endotheliale markers Occludin en CD31, astrocyten marker glial Fibrillair zuur eiwit (GFAP) en Microglia marker CD11b waargenomen afwezig bij P2.
Figuur 1: samenvatting van het protocol. Dit schema vertegenwoordigt kritische stappen voor pericyte extractie die begint met weefsel desintegratie met glazen stamper Grinder gevolgd door 3-stappen scheiding in dextran en filtratie. Dit protocol maakt gebruik van een 33 min enzym spijsvertering stap. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: cellen morfologie en markers expressie. A) fase contrast beelden van pericytes in P0, P1 en P2 stadia van proliferatie. Overvloedige endotheel cellen in P0 worden aangegeven door witte pijlen. Hun aantal daalde in P1 en ze zijn verdwenen in P2. Pericytes worden aangeduid met zwarte pijlen. B) analyse van de CD146-, ng2-en PDGFR-β-expressie door PCR in Pericytes in P2 met Pericytes in P1 en muizenhersenen (MS BR) monsters. C) representatieve beelden van pericytes in P2 die positieve immunokleuring vertonen van CD146, PDGFR-β en ng2. Schaal: 50 μm (vergroting van 20x) en 20 μm (40x vergroting). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve zuiverheid van de celculturen. Analyse van CD146, PDGFR-β, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b en Tubulin expressie door Western blotting in pericytes in P2 en muis hersenen (MS BR) monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve vergelijking van verschillende methoden van weefsel desintegratie, zuivering, verrijking en enzymatische spijsvertering. Elk gepubliceerd protocol wordt samengevat met indicaties over het aantal dieren dat voor elk protocol wordt gebruikt. Uitgangen worden ook aangegeven met betrekking tot het aantal putten dat is verkregen bij het zaaien. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Cerebrale pericytes zijn een integraal onderdeel van de NVU en spelen een actieve rol bij de inductie en het onderhoud van de BBB24. Evenzo is de rol van deze cellen in de verschillende neurodegeneratieve aandoeningen en vasculaire pathologieën intrigerend. Vandaar dat een efficiënt hoog uitgangs primair pericyte celmodel een efficiënt platform biedt voor in vitro studies.
Er zijn verschillende protocollen die zijn voorgesteld voor de isolatie van primaire pericytes (Figuur 4). Tigges et al.17 stelde een methode voor met inbegrip van corticale weefsel met hersenvliezen. Deze aanpak is de maling van weefsel van 6 muizen (een 37 ° c, 70 min spijsvertering met papain/DNase enzymen) gevolgd door een desintegratie stap via 21 G en 18 G naalden. Dit protocol suggereert een scheiding van één stap (centrifugeren in 22% BSA/PBS-oplossing) die ten minste 2 collageen I gecoate putten van een 6-Wells plaat oplevert. De cellen worden gehandhaafd in endotheliale celgroei medium (ECGM) tot passage 3 en later in pericyte groeimedium (PGM) voor het doorvoeren van cellen om de proliferatie van pericyt te bevorderen. In een andere soortgelijke benadering, Chen et al.18 voorgesteld weefsel dissociatie door het weefsel te dicteren met een gesteriliseerd scheermesje en weefsel spijsvertering met collagenase/DNase voor 90 min bij 37 °c. Na één-stap scheiding (centrifugeren in 22% BSA) van de cellen, wordt de myeline-laag verwijderd en wordt de pellet tweemaal in ECGM gewassen. De micro vaten zijn verguld in 3 putjes van een collageen I gecoat 6-well platen. Na het bereiken van samenvloeiing worden de cellen twee keer door de gang en later onderhouden in PGM. Uiteindelijk, als cellen worden doorgegeven in verhouding van 3, we kunnen verkrijgen 27 putten van 6-Wells platen alleen bij het gebruik van 10 muizen in het begin van het protocol.
In Thomsen et al., de auteurs suggereren isolatie van cerebrale pericytes via een tweestapsenzym vertering19. Hersenvliezen en witte stof worden verwijderd en de hersenen monsters worden in kleine stukjes gesneden. De weefsel stukken ondergaan de eerste enzym reactie in Collagenase/DNase I voor 75 min bij 37 °C, na één stap van afscheiding in 20% BSA. De pellet wordt verzameld en verder verteerd in Collagenase/dispase/DNase I voor 50 min bij 37 °C. Deze stap wordt gevolgd door de scheiding van micro vaten in een 33% Percoll gradiënt en daarna eenmaal gewassen. De micro vaten worden gesekt op collageen IV/fibronectin gecoat 35 mm gerechten. De proliferatie van pericytes wordt begunstigd door 10% FCS en gentamicine sulfaat in DMEM gedurende 10 dagen. In een andere tweestapsenzym verterings benadering suggereren Yamazaki et al. het hakken van het bekraste weefsel in koude DMEM20. In de eerste enzym reactie worden monsters behandeld met collagenase/DNase I voor 75 min bij 37 °C. Na één stap centrifugeren wordt de pellet weer eenmaal gewassen en wordt een tweede enzym reactie gestart in Collagenase/dispase voor 60 min bij 37 °C. Na een scheiding in één stap wordt de pellet geresuspendeerd en gecentrifugeerd in 22% BSA-oplossing. Ten slotte wordt de microvasculaire pellet geresuspendeerd en verguld in een 6-well plaat. Voor 5 muizenhersenen kan 1 put van een 6-well plaat worden verguld. Voor het verkrijgen van de pericytes, endotheelculturen worden doorgangen driemaal terwijl onderhouden in muis hersenen endotheliale cel (mBEC) medium II. Crouch en DOETSCH20 suggereren pericyte zuiveringsmethode door FACS. Weefselmonsters van cortex en ventriculaire – subventriculaire zone van muizenhersenen zijn micro-ontleed en grondig fijngehakt met een scalpel. Na inincubatie van Collagenase/dispase voor 30 minuten bij 37 °C wordt het verteerde weefsel gescheiden van myeline en puin gecentrifugeerd in een 22% v/v Percoll-oplossing. De celsuspensie wordt vervolgens geïnfiltreerd in fluorescently geconjugeerde antilichamen voor FACS analyse en sortering. De gesorteerde cellen worden geplateerd in met collageen gecoate putjes van 24 putplaat. Er wordt gesuggereerd dat een cortex voldoende cellen oplevert voor één plating in 1 put van 24-well plate.
Zelfs als productief, deze methoden worden geleverd met verschillende beperkingen, van het gebruik van een groot aantal dieren voor één batch-isolatie tot een zeer beperkte hoeveelheid uitvoer.
Tijdens de ontwikkeling van dit voorgestelde protocol waren we succesvol in het verkrijgen van een hoog vermogen: 9 putten van een 6-Wells plaat van slechts 10 muizen. Om dit te doen, de verwijdering van hersenvliezen zorgt voor de één stap verwijderen van grote vaten uit het weefsel. De Dounce weefsel slijper is geschikter voor zachte weefsels zoals de hersenen. Het zorgt ook voor monster reductie met de losse stamper, homogenisatie met de strakke stamper, en voorkomt onnodige cellulaire schade. Een van de belangrijkste doelstellingen in de primaire celcultuur protocollen is de minimale verspilling van weefsel en uitgebreide ophalen van cerebrale vasculatuur. In het gepresenteerde protocol wordt dit bereikt door herhaalde centrifugeren van het dextran-BSA-geïnfundeerd weefsel homogenaat. Een driestappen centrifugeren aanpak helpt om grote hoeveelheden vasculatuur uit het weefsel homogenaat. Dit biedt een 3x verbeterd herstel van micro schepen. Na scheiding is filtratie de volgende essentiële stap, die de uitsluiting van de met gladde spiercellen geassocieerde grote schepen bevordert. Zoals eerder vermeld, is een combinatie van verschillende enzymen voorgesteld voor enzymatische spijsvertering. Hoewel DNase en Collagenase/dispase worden gebruikt om er klontjes van cellen te verminderen en afzonderlijke cellen te isoleren, is het erg belangrijk om de celdood in zo'n invasieve omgeving te voorkomen en dit wordt voorkomen door tlck, waardoor het uiteindelijke rendement toeneemt. In eerste instantie is de eerste passage toegestaan om een endotheliale monolayer, die later de groei van bijgevoegde pericytes op de unilayer ondersteunt groeien. Aangezien het voortbestaan van primaire endotheel cellen wordt verminderd bij het doorvoeren, verhoogt het de kans op het ophalen van pericyte. Bovendien maakt dit protocol gebruik van een andere passage die ervoor zorgt dat de besmetting van de endotheel cellen wordt vermeden. Opgemerkt moet worden dat met een hoger aantal cellen van P2, de afhankelijkheid van verdere passage van de cellen wordt verminderd. Bovendien, het vermindert de mogelijkheid van pericyt groei wordt ingehaald door gladde spiercellen, die prolifereren op veel hoger tarief.
Om een hogere output te bereiken, zijn er verschillende stappen die kritisch zijn en nauwkeurig moeten worden uitgevoerd met betrekking tot temperatuur en tijd. Het mengen van weefsel homogenaat in BSA-dextran moet snel zijn. De pellet dissociatie na de centrifugeren stappen moet snel te voorkomen dat de celdood. Bovendien, 33 min van enzymatische spijsvertering moet worden gedaan met precisie en zorg. Een van de beperkingen voor dit protocol is de duur van de 7-8 dag dat endotheliale unilayer mag groeien en verdere vergemakkelijking van de groei van pericytes. Blijkbaar, de isolatie van micro vaten is btter, de groei van unilayer is sneller, en daarom zijn er een toegenomen aantal pericytes. Het wordt aanbevolen om niet minder dan 10 muizen in elke extractie te gebruiken om te zorgen voor een voldoende aantal microvasculaire fracties om de groei van pericyt verder te ondersteunen. Als de bovengenoemde punten zorgvuldig worden opgevolgd, kan de gewenste celdichtheid voor cerebrale pericyt cultuur gemakkelijk worden bereikt.
In vitro modellen bieden een haalbaar platform voor de ontwikkeling van afgeleide modellen om meer informatie te verkrijgen over de pathofysiologische relevantie en de communicatie tussen de andere cellen van de NVU tijdens neurologische aandoeningen. Geïsoleerde pericytes kunnen worden opgenomen in een bi-cellulaire cultuur (met endotheel-of gliacellen) en Tri-cellulaire cultuur (endotheliale en gliale cellen) modellen. De ontwikkeling van deze modellen is hier niet besproken. Tot slot, dit protocol biedt een aanpak voor de isolatie van primaire cellen met een hogere output en een beter platform voor in vitro onderzoek met betrekking tot de cerebrale pericyte biologie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LT en FG werden verleend door Agence nationale de la recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) in het kader van het gemeenschappelijk programma van de EU – Neurodegeneratief ziekte onderzoek (JPND) voor project SNOWBALL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
