Summary
Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.
Abstract
Son yıllarda serebral perisitler vasküler biyoloji ve patoloji alanında kapsamlı araştırmaların odak noktası haline gelmiştir. Perisitlerin kan beyin bariyeri oluşumu ve fizyolojisi açısından önemi gösterilmiştir ancak moleküler temeli büyük ölçüde bilinmemektedir. Serebral perisitlerin nörolojik bozukluklardaki patofizyolojik rolü ilgi çekici ve büyük önem emareolduğundan, in vitro modeller sadece yeterince uygun olmakla kalmamış, aynı zamanda bu çalışmalariçin farklı teknikler de dahil edilebilebilir. Serebral perisitlerin çıkarılması için in vitro modeller olarak çeşitli yöntemler önerilmiştir, ancak yüksek çıkışlı antibiyotiksiz bir protokol arzu edilir. En önemlisi, çıkarma başına çıktı artmış bir yöntem daha fazla hayvan kullanımını azaltır.
Burada, yeterince yüksek çıktı ile serebral perisit ayıklamak için basit ve etkili bir yöntem öneriyoruz. Fare beyin dokusu homogenate doku enkaz ve mikrovasküler pelet ayrılması için bir BSA-dextran çözeltisi ile karıştırılır. Biz bir mikrodamar zengin filtrasyon elde etmek için filtrasyon ardından üç adımlı bir ayrım öneriyoruz. Bu yöntemle, 10 fareden elde edilen mikrovasküler parça miktarı, 6 kuyuluk bir tabakadan 9 kuyu (9,6 cm2) tohumlamak için yeterlidir. En ilginci bu protokol ile kullanıcı 2.pasajda 27 perisit zengin kuyu (9,6 cm2) elde edebilir. Perisit kültürlerinin saflığı klasik perisit belirteçlerinin ekspresyonu ile doğrulanır: NG2, PDGFR-β ve CD146. Bu yöntem perisitler üzerinde fizyolojik ve patofizyolojik çalışmalar için etkili ve uygulanabilir bir in vitro aracı göstermektedir.
Introduction
Serebral perisitler nörovasküler birimin (NVU) önemli bir bileşenidir, kan beyin bariyerinin serebral endotel hücreleri ile fonksiyonel bir birim oluşturan (BBB), glial hücreler, hücre dışı matriks ve nöronlar. Perisitler, moleküler ve hücresel bilgi alışverişi için arayüzlerden biri olarak hizmet verdikleri için merkezi sinir sisteminin (CNS) düzenli işleyişinde hayati bir parçasıdır.
Serebral perisitler beyin mikrodamarlarının abluminal tarafına gömülür ve1'in kurulması ve2 BBB fizyolojisinin korunması için gereklidir. Birkaç yeni çalışmalar da anjiyogenezserebral perisitlerin rolü vurgulanmıştır 3 ve damar olgunlaşma4, endotel morfoz ezme5 ve sağkalım6, ve beyin kolesterol metabolizmasını kontrol7. Daha da önemlisi, bu süreçlerin herhangi birinde disregülasyon nörodejeneratif hastalıkların etiyolojik özellikleridir.
Gerçekten de, perisitler normal BBB işleyişi ve çeşitli nörolojik hastalıkların ilerlemesine karşı korunması için fonksiyonel bir gerekliliktir. Dejeneratif fizyolojive perisit kaybı Alzheimer hastalığının ilerlemesinde ortak paydalar8, beyaz madde disfonksiyonu sırasında nöronal kayıp9, multipl skleroz10, septik ensefalopati11, akut faz iskemik inme12 ve diğer nörolojik bozukluklar. Perisitler de tümör metastazında enstrümental13. İlginçtir, perisitler de nörolojik travma ve bozukluklar sonra kurtarma rolü sergilemek için gösterilmiştir:beyinderemiyelinasyon 1 , iskemik inme, omurilik yaralanması14 ve anjiyogenez teşvik15. Perisitlerin nörolojik travma ve bozuklukların patofizyolojik bulgularını güçlendirmek için duyarlılığı onları potansiyel bir terapötik hedef yapar16.
BBB'deki perisitlerin in vitro araştırma modelleri kapsamlı çalışmalar yapmak için önemli araçlardır. Bu modeller BBB ve daha fazla çalışma modelleri temsil ederek daha ayrıntılı çalışmalar için bir platform sağlar. Örneğin, bu modeller perisitler içinde hücresel fizyolojiyi anlamak için ve NVU diğer hücre türleri arasında kullanılabilir. Ayrıca, in vitro modeller perisitler üzerinde yeni ilaç ve moleküllerin farmakolojik etkisini test etmek için ilk elden araştırma araçlarıdır. Bu modeller de nörolojik bozukluklar ile ilgili olarak perisitlerin patofizyolojik rolünü anlamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, in vitro modellerin geliştirilmesi deneysel özgürlük sağlamak için artan çıkış gerektirir. Bu modeller kolay ve hızlı olmalı ve kullanılan deneysel hayvanların sayısını azaltmak. Buna ek olarak, çift ve üçlü hücre kültürü modelleri içine bu tür modeller geliştirmek için yeteneği arzu edilir.
Geliştirilmiş birçok protokol vardır. Tigges ve ark.17, Chen ve ark.18, Thomsen ve ark.19, Yamazaki ve ark.20ve Crouch ve Doetsch21 tarafından önerilen protokoller, gerekliliklerin çoğunu karşılayan övgüye değer yaklaşımlardır. Tüm bu yöntemler etkili sonuçlar verir, ancak çok sayıda deneysel hayvana olan bağımlılık bu protokoller için ortak bir payda olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, mümkün olan en yüksek verimlilikile perisitleri izole edip arındırabilen yüksek çıkış yöntemi geliştirmek zorunlu hale gelir. Bu protokolde, ikinci bir geçişten sonra elde edilen hücrelerin saflığı birkaç perisit belirteçleri ile doğrulanır. Perisit17'ninklasik belirteci olarak kullanılan Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü Reseptör-β(PDGFR- β) ve perisit aracılı vasküler morfogenez22 ve vaskülarizasyon23'ünbir belirteci olan NG2 (nöron-glial antijen 2) olup olmadığını kontrol ettik. Ayrıca perisit17,18ifade moleküllerinden biri olarak bildirilmiştir diferansiyasyon 146 (CD 146) küme için kontrol etti.
Burada, farelerden birincil perisitlerin (yabani tip veya transgenik) çıkarılması için, yukarıda belirtilen tüm gereksinimleri yüksek verim ile karşılayacak bir protokol sıyoruz. Biz birincil serebral perisitler için proliferasyon bir antibiyotik ve immünpanning ücretsiz seçim tabanlı yöntem istihdam, hangi in vitro çalışmalar yürütmek için etkili bir model kendini kanıtlayacaktır.
Protocol
Tüm deneyler, Enstitü'nün hayvan kullanımı ve kullanımı yla ilgili yönergelerine uygun olarak yapılmıştır. Fransız mevzuatı uyarınca, Artois Üniversitesi'ndeki hayvan tesisi yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (kaynak: B62-498-5). Avrupa Birliği Mevzuatı (Direktif 2010/63/EU) uyarınca, tüm prosedürler yerel hayvan bakım ve kullanım komitesi (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, referans: C2EA 75) ve Fransa Araştırma Bakanlığı (referans: 201509015412152) tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümlerin hazırlanması
- Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS) 500 mL Yıkama Tamponu A (WBA): 10 mM HEPES çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 500 mL Yıkama Tampon B (WBB): HBSS'de 10 mM HEPES çözeltisi ile %0,1 Büyükbaş Serum Albumin (BSA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Çözeltiyi oda sıcaklığında bir gecede karıştırarak WBA'da 300 mL%30 dekstran çözeltihazırlayın. Çözeltiyi kullanmadan önce 30 dk boyunca 110 °C'de otomatik klavlayın. Otoklavlamadan sonra çözelti2-3 saat oda sıcaklığında dinlendirin.
- Soğuk dekstran çözeltisinde 100 mL %0,1 BSA çözeltisi hazırlayın. 3-4 dakika boyunca şiddetle çalkalayın ve 4 °C'de saklayın.
- %20 buzağı serumu, 2 mM glutamin, 50 μg/mL gentamisin, %1 vitamin, %2 amino asit Bazal Orta Kartal (BME) eriterek Tam Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) kültür ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce 1 ng/mL Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin.
- Perisit kültür bazal ortamve 4 °C'de depolamaperisit büyüme takviyeleri (perisit media ile birlikte sağlanan) ve% 20 Fetal Buzağı Serum (FCS) ekleyerek tam perisit medya hazırlayın.
2. Beyin dokusu kurtarma ve menenjlerin çıkarılması
- Tutarlılık için, her çıkarma partisinde benzer yaş ve aynı cinsiyetteki fareleri kullanın. Patojen içermeyen bir hayvan barınağı kullanın ve suya reklam libitum erişimi sağlayın. Hayvanların verimliliğini ve minimum kullanımını sağlamak için doku materyali kaybını önleyebilirsiniz.
- Ötenazi C57BL/6J, 4-6 haftalık, erkek fareler (Janvier laboratuvarları, Le Genest-Saint-Isle, Fransa).
- Hızlı bir şekilde steril koşullarda beyin dokusu çıkarmak, doku herhangi bir hasar önlemek. Dokuyu 40 mL soğuk fosfat tamponlu saline (PBS) dikkatlice yerleştirin.
- Soğuk PBS'deki beyin dokusunu petri kabına (100 mm x 15 mm) aktarın.
- Steril kuru tiftiksiz bir silme ve kavisli uç forceps ile beyin dokusu yerleştirin, beyincik kaldırmak, striatum ve oksipital sinirler.
- Bir pamuklu bez ile tüm görünür menenjler çıkarın. Beyin dokusunu ters yerleştirin ve dışa ışık vuruşlarını kullanarak lobları pamuklu bir bezle açın. Tüm görünür kan damarlarını çıkarın.
- Menenjler serbest beyin dokusunu 15 mL soğuk WBB ile petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin.
3. Homojenizasyon
- Bir Dounce doku öğütücü harç tüpü doku aktarın ve forceps ile WBB 3-4 mL ekleyin.
- Bir 'gevşek' pestle ile doku kıyma 55 kez. WBB ile 'gevşek' haşere durula. Şimdi bir "sıkı" havaneli ile bulamaç kıyma 25 kez.
- Bulamacı eşit olarak iki 50 mL tüpe bölün ve 1,5 x hacim soğuk %30 BSA-dextran ekleyin ve bulamacı karıştırmak için tüpleri şiddetle sallayın.
4. Vasküler fraksiyonun izolasyonu
- Tüpleri şiddetle salladıktan sonra, tüpleri 3.000 x g ve 4 °C'de 25 dakika santrifüj edin.
- Supernatant'ı (üst miyelin tabakası ile birlikte) 2 yeni tüpe aktarın ve tüpleri 3.000 x g ve 4 °C'de 25 dakika santrifüj edin. 3 mL soğuk WBB ekleyerek ilk santrifüjden peletleri koruyun (peleti 4 °C'de tutun).
- 4.2 adımını tekrarlayın ve peletleri2.
- Adım 4.3 tüplerdoku enkaz ile dextran ve miyelin atın. Peletleri soğuk WBB'de koruyun.
- 4.1 numaralı basamaktan tüp 1 ve tüp 2'nin içeriğini birleştirin ve soğuk WBB ile 10 mL'lik son hacmi ni tamamlayın.
- Adım 4.2 ve adım 4.3'ten tüpler için bu adımı tekrarlayın.
NOT: Son olarak, 3 santrifüjden 3 tüp vardır. - Peletin görünür kümeleri kalana kadar 10 mL'lik pipet kullanarak 6 yukarı ve aşağı vuruşla peleti ayırın.
- Vakum filtresi montajı ve naylon örgü filtresi yardımıyla, her tüpün hücre süspansiyonlarını filtreleyin.
NOT: Bu filtrasyon adımı, kafes filtresi ile daha uzun/büyük kapların temizlenmesi için önemlidir. - Oda sıcaklığında WBB'de düz uçlu bir uç veya kazıyıcı yardımıyla filtreyi kazıyarak kılcal damarları kurtarın ve yeniden askıya alın. Daha fazla kılcal damarı kurtarmak için süspansiyonu taze bir filtreyle filtreleyin
- 1.000 x g ve RT'de 7 dk için iki tüp ve santrifüj içine eşit filtrasyon bölün.
NOT: Bu santrifüj adımında enzimatik çözeltiyi hazırlayın. Kullanılan hayvan sayısına göre gerekli WBB hacmini belirleyin (bkz. Malzemeler Tablosu). WBB'ye 1 x DNase 1 ve 1x tosyl-L-lysyl-klorotan hidroklorür (TLCK) ekleyin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 37 °C'ye önceden ısıtın. - Adım 4.10'dan gelen peletleri enzimlerle önceden ısıtılmış WBB ile bir tüpte toplayın. Önceden ısıtılmış 1x kollajenaz / dispase ekleyin. Tüpü tam olarak 33 dakika boyunca 37 °C'de sallayarak masa su banyosuna yerleştirin.
- 30 mL soğuk WBB ekleyerek enzim reaksiyonu durdurun. 1.000 x g ve RT 7 dakika için süspansiyon santrifüj.
- Supernatant'ı dikkatlice atın ve 10 mL'lik pipet kullanarak WBB'deki peleti 6 yukarı ve aşağı vuruşla ayırın. Bu adım daha az titiz ve nispeten daha hızlı olmalıdır.
- 1.000 x g ve RT 7 dakika için süspansiyon santrifüj.
NOT: Bu adımda, kaplamayı kültür yemeklerinden çıkarın ve oda sıcaklığında DMEM ile bir kez durulayın. Rt en az 1 saat için Coat hücre kültürü yemekleri. - 4.14 adımda elde edilen tüpten süpernatant atın ve yeni tam DMEM ortamlarında peleti ayırın, hücreleri (Gün 0, P0) 6 kuyulu 9 kuyuda (1 kuyu 9,6 cm2'şer) plakalayın.
5. Serebral perisitlerin çoğalması
- Hücre kültürlerini steril bir kuluçka makinesinde 37 °C ve %5 CO2'de koruyun. 24 saat (gün 1) sonra dikkatle enkaz kaldırarak hücreleri kaplama kültür ortamı değiştirin. 1. günden sonra, her 48 saat kültür medyasını değiştirin.
- Hücre kültürünü en az 7-8 gün gözlemleyin. Bu zamana kadar, endotel tek katmanlı üstünde hücresel büyümeler gözlemlenebilir olmalıdır.
- Perisit kültür ortamında 8-10 gün (birleşimine bağlı olarak) jelatin kaplı kültür plakaları üzerinde 1 (P1) pasajı hücreleri geçit. Her 2 günde bir kültür medyasını değiştirin. 6-7 gün boyunca hücreleri gözlemleyin. Hücreler 17.
NOT: Hücreler yaklaşık %80-90'lık bir birleşmeyle deneylere/gözleme hazır olacaktır.
Representative Results
Bu protokol (Şekil 1) P0'da tohumlama sırasında 9 kuyuyu (6 kuyulu plakalar) verimli bir şekilde verir(Şekil 2A (P0: Gün 1)).
P0'dan P2'ye kadar endotel hücrelerinin (beyaz oklarla gösterilir) ve perisitlerde (siyah oklarla gösterilir) kademeli olarak artış gözlenebilir belirli morfolojik özellikleri vardır. P0'da, mikrodamarlardan gelişen uzamış endotel hücreleri bolluk içindedir(Şekil 2A, P0: Gün 3), bu kadar uzatılmış hücrelerin bolluğu P1'de azalır ve P2'de yoktur. Tam tersine, perisitler P2'de bol bulunan dörtlü hücreler olarak ortaya çıkarlar(Şekil 2A, P2: Gün 18).
P2'deki perisit kültürünün saflığını doğrulamak için, sayısal PCR (Şekil 2B), immünositokimya ( Şekil 2C) ve batı lekelerini kullanarak PERIsit belirteçleri olarak NG2, CD146 ve PDGFR-beta ekspresyonunu kontrol ettik (Şekil 3). P2'deki perisitler, total fare beyni (Bayan Br) ekstresindeki ifadeye kıyasla daha yüksek CD146, NG2 ve PDGFR-β düzeylerini ifade eder. Kontrol olarak, endotel belirteçlerinin ekspresyonu Oklüdin ve CD31, astrosit belirteci Glial Fibrillary Asidik Protein (GFAP) ve mikroglia marker CD11b de P2'de bulunmadı.
Şekil 1: Protokolün özeti. Bu anahat dekstran ve filtrasyon 3 adım ayırma ardından cam ve gözenek öğütücü ile doku parçalanması ile başlayan perisit ekstraksiyon için kritik adımları temsil eder. Bu protokol de 33 dk enzim sindirim adımı uygular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre morfolojisi ve belirteçler ifade. (A) P0, P1 ve P2 proliferasyon aşamalarında perisitlerin faz kontrast görüntüleri. P0 bol endotel hücreleri beyaz oklar ile gösterilir. Sayıları P1'de azaldı ve P2'de kayboldular. Perisitler siyah oklarla gösterilir. (B) P1 ve fare beyin (Ms Br) örneklerinde perisitler ile P2'de perisitlerde PCR ile CD146, NG2 ve PDGFR-β ekspresyonunun analizi. (C) Cd146, PDGFR-β ve NG2 pozitif immünoleme gösteren P2'deki perisitlerin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu: 50 μm (20x büyütme) ve 20 μm (40x büyütme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre kültürlerinin temsili saflığı. P2 ve fare beyni (Ms Br) örneklerinde perisitlerde batı lekeleme ile CD146, PDGFR-β, NG2, Oklüdin, GFAP, CD31, CD11b ve Tubulin ekspresyonu analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Doku parçalanması, arınması, zenginleştirilmesi ve enzimatik sindirim için farklı yöntemlerin temsili karşılaştırılması. Yayınlanan her protokol, her protokol için kullanılan hayvan sayısına ilişkin endikasyonlarla özetlenir. Tohumlama üzerine elde edilen kuyu sayısına göre çıktılar da belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Serebral perisitler NVU'nun ayrılmaz bir parçasıdır ve BBB24'ünindüksiyon ve bakımında aktif rol oynarlar. Benzer şekilde, farklı nörodejeneratif bozukluklar ve vasküler patolojilerde bu hücrelerin rolü ilgi çekicidir. Bu nedenle, verimli bir yüksek çıkış birincil perisit hücre modeli in vitro çalışmalar için verimli bir platform sağlayacaktır.
Birincil perisitlerin izolasyonu için önerilen çeşitli protokoller vardır (Şekil 4). Tigges ve ark.17 menenjler ile kortikal doku içeren bir yöntem önerdi. Bu yaklaşım, 6 fareden (papain/DNase enzimleri ile 37 °C, 70 dk sindirim) doku ların 21 G ve 18 G iğneler ile parçalanma adımı ile hassaslaştırılmasıdır. Bu protokol, en az 2 kollajen I kaplı kuyuları 6 kuyuya veren tek adımlı bir ayırma (%22 BSA/PBS çözeltisinde santrifüj) önerir. Hücreler, perisit proliferasyonlarını teşvik etmek için passaging hücreleri için 3 ve daha sonra perisit büyüme ortamı (PGM) kadar endotel hücre büyüme orta (ECGM) korunur. Başka bir benzer yaklaşımda, Chen ve ark.18 sterilize jilet ve 37 °C 90 dakika kollajenaz / DNase ile doku sindirim ile doku doğranarak doku dissosilasyon önerdi. Hücrelerin tek adımlık ayrılmasından sonra (%22 BSA'da santrifüj) miyelin tabakası çıkarılır ve pelet ECGM'de iki kez yıkanır. Mikrokaplar, 6 kuyulu tabakları kaplettiğim bir kollajen in 3 kuyuya kaplanır. Birleştiğinde hücreler iki kez geçilir ve daha sonra PGM'de muhafaza edilir. Sonunda, hücreler 3 oranında geçirilirse, protokolün başında sadece 10 farenin kullanımıyla 6 kuyulu 27 kuyu elde edebiliriz.
Thomsen ve ark., yazarlar iki adımlı enzim sindirim yoluyla serebral perisitizolasyon öneririz19. Menenjler ve beyaz madde çıkarılır ve beyin örnekleri küçük parçalara ayrılır. Doku parçaları kollajenaz/DNase I'de 37 °C'de 75 dakika boyunca ilk enzim reaksiyonuna uğrarlar ve %20 BSA'da bir ayrışma adımı nı takiben. Pelet toplanır ve 37 °C'de 50 dakika boyunca kollajenaz/dispase/DNase I'de daha fazla sindirilir. Bu adımı %33 Percoll gradient'inde mikrodamar ayırması takip edilir ve bir kez daha yıkanır. Mikrokaplar kollajen IV/fibronektin kaplı 35 mm tabaklarda tohumlanır. Perisitlerin proliferasyonu 10 gün boyunca DMEM'de %10 FCS ve gentamisin sülfat tarafından tercih edilir. Başka bir iki aşamalı enzim sindirim yaklaşımında, Yamazaki ve ark. soğuk DMEM20eksintise doku miskasyon öneririz. İlk enzim reaksiyonunda numuneler 37 °C'de 75 dk için kollajenaz/DNase I ile tedavi edilir. Bir adım santrifüjden sonra pelet tekrar bir kez yıkanır ve 37 °C'de 60 dakika kollajenaz/dispase'de ikinci bir enzim reaksiyonu başlatılır. Tek adımlı bir ayrışma sonrasında pelet %22 BSA çözeltisinde yeniden askıya alınır ve santrifüj edilir. Son olarak, mikrovasküler pelet resuspended ve 6-well plaka içinde plakalı. 5 fare beyni için, 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu kaplanabilir. Perisitleri elde etmek için, endotel kültürleri fare beyin endotel hücresi (mBEC) orta II korunurken üç kez geçirilir. Crouch ve Doetsch20 FACS tarafından perisit arıtma yöntemi öneririz. Fare beyninin korteks ve ventriküler-subventriküler bölgesinden alınan doku örnekleri mikro-kesitlenir ve neşterle iyice doğratılır. 37 °C'de 30 dakika kollajenaz/dispase enzim inkübasyonu ndan sonra sindirilmiş doku miyelinden ayrılır ve enkaz %22 v/v Percoll çözeltisi içinde santrifüj edilir. Hücre süspansiyonu daha sonra FACS analizi ve sıralama için floresan konjuge antikorlar inkübe edilir. Sıralanmış hücreler 24 kuyu plakakollajen kaplı kuyularda kaplanır. Bir korteksin 24 kuyulu plakanın 1 kuyuda bir kaplama için yeterli hücre verimi olduğu ileri sürültürülmesinde bulunur.
Üretken olsa bile, bu yöntemler, tek parti yalıtımı için yüksek sayıda hayvanın kullanımından çok sınırlı bir çıktı miktarına kadar çeşitli sınırlamalarla birlikte gelir.
Bu önerilen protokolün geliştirilmesi sırasında, yüksek verim elde etmede başarılı olduk: 10 fareden 9 kuyu 6 kuyuluk. Bu amaçla, menenjlerin çıkarılması dokudan büyük damarların bir adım çıkarılmasını sağlar. Dounce doku öğütücü beyin gibi yumuşak dokular için daha uygundur. Ayrıca gevşek havaneli ile numune azaltma sağlar, sıkı havaneli ile homojenizasyon, ve gereksiz hücresel hasarı önler. Birincil hücre kültürü protokollerinde ana amaçlardan biri doku minimal atık ve serebral vaskülatür uzun alma. Sunulan protokolde, bu dekstran-BSA infüzyon doku homojenate tekrarlayan santrifüj ile elde edilir. Üç aşamalı bir santrifüj yaklaşımı, homojen dokudan büyük miktarlarda vaskülatür kurtarmaya yardımcı olur. Bu mikrodamarların 3x geliştirilmiş kurtarma sağlar. Ayırma sonra, filtrasyon bir sonraki temel adımdır, hangi düz kas hücresi ilişkili büyük damarların dışlanması lehine. Farklı enzimlerin bir arada enzimler daha önce belirtildiği gibi enzimetik sindirim için önerilmiştir. DNase ve kollajenaz/dispase hücre kümelerini azaltmak ve tek hücreleri izole etmek için kullanılırken, böyle bir invaziv ortamda hücre ölümünü önlemek çok önemlidir ve bu da TLCK ile önlenir ve böylece nihai verimi artırır. Başlangıçta, ilk geçiş daha sonra tek katmanlı bağlı perisitlerin büyümesini destekleyen bir endotel monolayer büyümeye izin verilir. Primer endotel hücrelerinin hayatta kalma passaging üzerine azalır yana, perisit alma olasılığını artırır. Ayrıca, bu protokol endotel hücre kontaminasyonundan kaçınmayı sağlayan başka bir geçiş kullanır. P2'den daha fazla sayıda hücre ile hücrelerin daha fazla geçişbağımlılığıazalır unutulmamalıdır. Buna ek olarak, perisit büyüme çok daha yüksek oranda çoğalır düz kas hücreleri tarafından üstlenilen olasılığını azaltır.
Daha yüksek bir çıktı elde etmek için, kritik ve sıcaklık ve zaman açısından doğru şekilde yapılması gereken birkaç adım vardır. Doku homojenin BSA-dextran içine karışması hızlı olmalıdır. Santrifüj adımlarını takiben pelet bölünmesi hücre ölümünü önlemek için hızlı olmalıdır. Ayrıca 33 dk enzimatik sindirim hassasiyet ve özenle yapılmalıdır. Bu protokolün sınırlamalarından biri, endotel tek katilinin büyümesine ve perisitlerin büyümesini daha da kolaylaştırmasına izin verilen 7-8 günlük süredir. Belli ki, mikrodamarların izolasyon btter, tek katmanlı büyüme daha hızlı, ve bu nedenle perisit lerin artan sayıda vardır. Perisit büyümesini daha da desteklemek için yeterli sayıda mikrovasküler fraksiyonsağlamak için her ekstraksiyonda 10'dan az fare kullanılmaması önerilir. Yukarıda belirtilen noktalar dikkatle takip edilirse, serebral perisit kültürü için istenilen hücre yoğunluğu kolayca elde edilebilir.
In vitro modeller, nörolojik bozukluklar sırasında NVU'nun diğer hücreleri arasında patofizyolojik alaka ve iletişim hakkında daha fazla bilgi edinmek için türev modellerin geliştirilmesi için uygun bir platform sağlar. İzole perisitler iki hücreli kültür (endotel veya glial hücrelerle) ve üç hücreli kültür (endotel ve glial hücreler) modellerine dahil edilebilir. Bu modellerin gelişimi burada tartışılmamamıştır. Sonuç olarak, bu protokol, primer hücrelerin daha yüksek çıktıya sahip izolasyonu için bir yaklaşım ve serebral perisit biyolojisi ile ilgili in vitro araştırmalar için daha iyi bir platform sağlar.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
LT ve FG, Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR, ANR-JPWG-0010) tarafından AB Ortak Programı – Nörodejeneratif Hastalık Araştırması (JPND) çerçevesinde SNOWBALL projesi için verildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
