Method Article

싱크로트론 마이크로 CT를 위한 고처리량 피질 뼈 샘플 조달 및 분석을 위한 단면, 코링 및 이미지 처리 가이드

DOI:

10.3791/61081

⸱

June 12th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 페모라의 전방 측면에서 SRμCT 실험을 위해 균일한 크기의 피질 뼈 표본을 조달하기 위해 지질학적(coring) 샘플링 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 최소한의 파괴적이고 효율적이며, 불규칙한 샘플 모양에서 이미징 아티팩트를 최소화하고 미세 건축 시각화 및 분석을 향상시키는 원통형 표본을 초래합니다.

Abstract

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뼈는 인간의 수명 동안 구조에 변화 하는 동적 및 기계적으로 활성 조직. 뼈 리모델링 과정의 제품은 기존의 2차원 기술을 사용하여 실질적으로 연구되었습니다. 데스크톱 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT) 및 싱크로트론 방사선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(SRμCT)을 통한 X선 이미징 기술의 최근 발전은 다른 3D 이미징 기술(예를 들어, SEM)보다 더 큰 시야(FOV)의 고해상도 3차원(3D) 스캔을 획득하여 인간 내 마이크로코픽 구조의 보다 완전한 그림을 제공한다. 그러나 표본은 FOV 내에서 정확하게 중심을 두어 데이터 분석에 영향을 미치는 것으로 알려진 줄무늬 아티팩트의 모양을 제한해야 합니다. 이전 연구는 고르지 못한 가장자리 또는 이미지 잘림으로 인해 이미징 아티팩트를 초래하는 불규칙한 모양의 직선 골 블록의 조달을 보고했습니다. 우리는 인간 페모라의 전방 양으로부터 SRμCT 실험을 위해 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 표본을 조달하기 위해 지질 학적 샘플링 프로토콜 (coring)을 적용했습니다. 이 코링 방법은 효율적이고 조직에 최소한의 파괴적입니다. 균일한 원통형 샘플을 생성하여 회전 시 동포메트릭이 되고 스캔 전반에 걸쳐 X선 빔에 대한 균일한 경로 길이를 제공하는 특성상 이미징 아티팩트를 감소시합니다. 코어및 불규칙한 모양의 샘플의 X선 지형 데이터의 이미지 처리는 피질 뼈 미세 아키텍처의 시각화 및 분석을 개선하는 기술의 잠재력을 확인합니다. 이 프로토콜의 목표는 다양한 유형의 고해상도 뼈 이미징 실험에 적응할 수 있는 피질 뼈 코어추출을 위한 신뢰할 수 있고 반복가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이 작업의 가장 중요한 목표는 저렴하고 일관되며 간단하며 SRμCT를 위한 표준화된 피질 뼈 조달을 만드는 것입니다. 이 절차는 생물학적 인류학, 지구과학 또는 물질 과학과 같은 단단한 복합 물질을 일반적으로 평가하는 관련 분야의 연구원에 의해 더 적응될 수 있습니다.

Introduction

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이미징 기술의 최근 발전으로, 지금 매우 높은 해상도의 X 선 이미징 데이터를 취득하는 것이 가능합니다. 데스크탑 마이크로 CT(μCT) 시스템은 비파괴적 특성1로인해 방수 골격을 이미징하는 현재 표준입니다. 그러나 피질 뼈의 미세 구조 적 특징을 이미징 할 때 μCT 사용은 더 제한적이었습니다. 해상도 제약으로 인해 데스크톱 시스템은 골세포 라쿠나에 같은 피질 모공보다 작은 미세 구조 적 특징을 이미지하는 데 필요한 해상도를 달성할 수 없습니다. 이 응용 프로그램의 경우 SRμCT는 이러한 시스템1의해상도가 커지므로 이상적입니다. 예를 들어, 생물 의학 이미징 및 치료 (BMIT) 빔 라인2에 캐나다 광원 (CLS)에서 실험은 0.9 μm만큼 작은 복셀이미지를 생산하고있다. 이전 연구1,3,4,5는 인간 긴 뼈(그림 1)에서피질 뼈 표본으로부....

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Protocol

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모든 표본은 Toledo 대학, 의학 생명 과학 대학 및 북동부 오하이오 의과 대학 (NEOMED)에서 방부 처리 된 cadaveric 기증자로부터 공급되었으며 기증자 자신 또는 기증자의 다음 친척의 정보에 입각한 동의를 받았습니다. 인간 과목보호를 위한 애크런 대학 기관 검토 위원회 (IRB)는 살아있는 개인에게서 조달되지 않았기 때문에 이 표본이 완전한 IRB 검토에서 면제되었다고 간주했습니다. 나이, 성별 및 사망 원인을 포함한 인구 통계 학적 정보는 모든 기부자에게 제공되었습니다. 선택된 개별은 죽음의 시간에 뼈 리모델링에 영향을 미칠 수 있는 처리 식이요법에 뼈 영향을 미치는 조건 또는 노출을 문서화하지 않았습니다. 피질 뼈 샘플은 19세에서 101세 사이의 연령대를 가진 카다브릭 현대 남성과 여성의 여성(평균 = 73.9세)에서 수득하였다. 대퇴엽은피질 다공성(20,21, 22,23,24) 및 골조직의물질밀도(25,

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Results

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설명된 코어 샘플링 방법은 매우 효과적이고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 코링 시편은 CLS BMIT-BM 빔라인2의실험을 위해 일관되게 크기의 샘플을 조달할 수 있었으며, FOV는 1.49 μm 복셀 크기로 ~2mm입니다. 코어 직경의 일관성을 검증하기 위해 인간 전방 대퇴코어(n=69)의 하위 집합의 길이(위,중간, 아래)를 따라 세 가지 측정을 수행하였다. 코어의 평균 직경은 1.96 ± 0.11mm였으며, 코어의 길이를 따라 평균 숱이 0.06 ± 0.06 mm/mm로 다른 단단한 복합 재료에 대한 적용성을 강조하기 위해돌로미테(n=32)의 샘플에서 이 방법을 시도하여 평균 직경이 1.06 ± 0.02mm였다. 코어 샘플의 길이를 따라 숱이 0.01 ± 0.005 mm/mm로 기록되었다. 4.2.3 단계에서 설명된 바와 같이, 코리 샘플의 이미지 처리 워크플로우와 로터리 툴(예를 들어, Dremel)을 사용하여 조달된 하나.......

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Discussion

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제한된 FOV 설정을 갖춘 고해상도 SRμCT 이미징을 위한 균일한 및 원통형 피질 뼈 코어 샘플을 조달하기 위한 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 없었습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 SRμCT 이미징에 대한 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 샘플을 조달하는 방법과 미세 건축 데이터의 후속 정확한 시각화 및 추출에 대한 포괄적인 자습서를 제공함으로써 무효화를 채웁니다. 당사의 프로토콜은 임의 차원의 직선 골격 블록을 절개하는 이전 설명보다 피질 뼈 코어를 조달하기 위한 보다 표준화되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 핸드헬드 로터리 도구(예를 들어, Dremel)에 의존하여 불규칙한 크기의 뼈 블록을 제거하는 연구자들은 분석 중에 이미징 중에 훨씬 더 긴 샘플 설정 시간을 경험하고 분석 중에 임계값 및 피질 모공 추출에 더 큰 오류를 경험할 수 있습니다. 이러한 불일치는 뼈 샘플 준비, 후속 시각화 및 분석 및 해석 결과와 관련하여 이 표준화된 프로토콜의 필요성과 중요성을 강조합니다.

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문에 설명된 연구는 캐나다 혁신, 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 서스 캐처 원 대학, 서스 캐처 원 정부, 서부 경제 다각화 캐나다, 캐나다 국립 연구위원회 및 캐나다 보건 연구소의 캐나다 혁신 재단이 지원하는 캐나다 광원의 BMIT 시설에서 수행되었습니다. 저자는 캐나다 광원의 빔 라인 과학자, 특히 아담 웹, 데니스 밀러, 세르게이 가질로프, 닝 주 스카이스캔 SRμCT 및 백색 빔 현미경 시스템의 설정 및 문제 해결에 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 대한 cadaveric 견본에 접근을 위한 Toledo 의과 대학의 대학 및 박사 제프리 웬스트루프에서 베스 달젤에게 감사드립니다. JM Andronowski는 애크런 대학과 형사 사법 목적 부여를위한 법의학 과학의 국립 사법 연구 개발 연구소 (2018-DU-BX-0188)에서 제공하는 창업 연구 기금을 통해 지원됩니다. RA 데이비스는 애크런 대학에서 제공하는 대학원 보조에 의해 지원됩니다. 코링 과 톱질에 사용되는 장비와 공급은 아크론 대학과 NSF가 CW 홀리오크에 EAR-1624242를 부여하는 스타트업 기금에 의해 구입되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
복합재용 1-1/8" 플런지 절단 카바이드Warrior6181228.6mm 플런지
70% 에탄올Fisher ScientificBP82015003.8
둔탁한 펜치Fisher Scientific10-300
원심분리기 튜브ThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 에폭시Ted Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
복합 재료용 다이아몬드 웨이퍼 톱날Buehler#11-4247
드릴 프레스제트 밀/드릴350017다운로드 및 설치모델 : JMD-15, 벤치 탑 드릴 프레스는 적절한 대체품이지만 일반적으로 드릴 스템 아래에 샘플을 배치하기위한 번역 가능한 기계 테이블이 없습니다
파인 팁 집게Fisher Scientific22-327379
밀 / 드릴 용 XY 기계 테이블 용 고정 클램프MSC Industrial Supply# 04804571
유리 현미경 슬라이드Ted Pella2600575x50mm 슬라이드, 1mm 두께
유리 슬라이드 척Buehler#11248875x50mm 유리 슬라이드를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽
140도에 도달할 수 있는 핫 플레이트; CThermoScientificHP88850105
인큐베이터NAPCO모델 4200
Isocut 유체Buehler111193032윤활제; 30mL
보석상의 다이아몬드 코어 링 드릴 비트Otto Frei# 119.0502mm 내경 중공 스템 코어 링 비트
NReconBruker microCTv.1.6.10.2https://www.bruker.com/products/microtomography.html
진동 톱Harbour Freight62866
오븐용 유리 접시Pyrex1117715Glass 식품 저장 용기
정밀 저속 톱(Isomet 1000)Buehler111280160
면도날Amazon25181
얕은 알루미늄 깡통아마존B01MRWLD0R~ 8cm 직경
표본 컵아마존616784425436 885334344729
Tergazyme 세제Alconox1304-11.8kg 상자
초음파 세척기MTI CorporationKJ201508006
리터 니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al.

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