Summary
Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.
Abstract
O osso é um tecido dinâmico e mecanicamente ativo que muda de estrutura ao longo da vida humana. Os produtos do processo de remodelação óssea foram estudados substancialmente utilizando técnicas bidimensionais tradicionais. Os recentes avanços na tecnologia de imagem de raios-X por meio da tomografia microcomputante de desktop (μCT) e da tomografia microcomputante de radiação síncrotron (SRμCT) permitiram a aquisição de varreduras tridimensionais de alta resolução (3D) de um campo de visão maior (FOV) do que outras técnicas de imagem 3D (por exemplo, SEM) fornecendo uma imagem mais completa de estruturas microscópicas dentro do osso cortical humano. A amostra deve ser centrada com precisão dentro do FOV, no entanto, para limitar o aparecimento de artefatos de raia conhecidos por impactar a análise de dados. Estudos anteriores relataram a aquisição de blocos ósseos retilineares de forma irregular que resultam em artefatos de imagem devido a bordas irregulares ou truncação de imagem. Aplicamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método de coring é eficiente e minimamente destrutivo para o tecido. Ele cria amostras cilíndricas uniformes que diminuem artefatos de imagem por natureza de ser isométrico durante a rotação e fornecendo um comprimento de caminho uniforme para raios-X durante a varredura. O processamento de imagens de dados tomográficos de raios-X de amostras cored e de forma irregular confirma o potencial da técnica para melhorar a visualização e análise da microarquitetura óssea cortical. Um objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável e repetível para a extração de núcleos ósseos corticais que são adaptáveis para vários tipos de experimentos de imagem óssea de alta resolução. Um objetivo abrangente do trabalho é criar uma aquisição padronizada de ossos cortical para SRμCT que seja acessível, consistente e simples. Esse procedimento pode ser adaptado ainda por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam materiais compostos duros, como na antropologia biológica, geociências ou ciências materiais.
Introduction
Com os recentes avanços na tecnologia de imagem, agora é viável adquirir dados de imagem de raios-X com resolução muito alta. Os sistemas de microcC (μCT) da área de trabalho são o padrão atual para imagens de osso cancelado devido à sua natureza não destrutiva1. Quando as características microestruturais de imagem do osso cortical, no entanto, o uso de μCT tem sido mais limitado. Devido a restrições de resolução, os sistemas de desktop não podem atingir a resolução necessária para a imagem de recursos microestruturais menores que os poros corticais, como a lacuna de osteociato. Para esta aplicação, o SRμCT é ideal devido à maior resolução desses sistemas1. Por exemplo, experimentos na Canadian Light Source (CLS) nas linhas de luz biomédicas de imagem e terapia2 produziram imagens com voxels de até 0,9 μm. Estudos anteriores1,3,4,5 utilizaram esta resolução para adquirir projeções e renderizações tridimensionais subsequentes (3D) de amostras de ossos cortical de ossos longos humanos(Figura 1) para quantificar a densidade do osteocito lacunar4,6,7,8,9 e variação na forma e tamanho3 em toda a vida humana e entre os sexos. Outros estudos demonstraram a presença de banda de osteon em humanos10, fenômeno anteriormente reconhecido como associado apenas a mamíferos não humanos na literatura antropológica forense.
Para alcançar uma resolução excepcional, o feixe de raios-X deve estar bem focado dentro do campo de visão (FOV), que muitas vezes limita o tamanho máximo da amostra a alguns milímetros de diâmetro. Atualmente, não há procedimentos abrangentes e padronizados descritos na literatura delineando a aquisição de amostras ósseas que atendam a essas restrições. O centro de amostras dentro do FOV é fundamental para garantir que 1) a amostra permaneça centrada à medida que gira 180° durante a imagem, e 2) artefatos de varredura sejam limitados, uma vez que não há truncação de imagem. Em outras palavras, nenhuma porção da amostra fora do FOV interfere com o feixe entrando em seu ponto focal dentro do FOV. Se isso ocorrer, o algoritmo de reconstrução é privado de alguns dos dados de atenuação necessários para uma reconstrução totalmente correta. Vale ressaltar ainda que os escaneamentos de 360° (rotação total) minimizam os efeitos do endurecimento do feixe, mas aumentam os artefatos causados pelo desalinhamento e movimento da amostra durante a imagem. Assim, enquanto uma varredura de 360° normalmente gera dados mais limpos, o tempo de imagem é dobrado e, portanto, um compromisso entre custo experimental e qualidade de dados deve ser abordado.
Um aspecto importante e muitas vezes negligenciado dos experimentos de imagem óssea é a técnica precisa e replicável de preparação de amostras realizada antes da varredura. Estudos que incorporam métodos SRμCT em seus experimentos mencionam brevemente seu protocolo amostral, mas os autores fornecem pouco ou nenhum detalhe sobre a metodologia específica usada para coletar seus espécimes. Muitos desses estudos mencionam o corte de blocos ósseos retilícleos de dimensões arbitrárias, mas geralmente não fornecem mais informações sobre as ferramentas ou materiais de incorporação utilizados3,4,10,11,12,13,14. Alguns pesquisadores geralmente usam ferramentas rotativas portáteis (por exemplo, Dremel) para remover blocos retilineares do osso de uma região de interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método resulta em amostras de tamanho não uniforme que podem ser maiores que o FOV, aumentando a probabilidade de artefatos de varredura e truncação de imagem. Tais espécimes muitas vezes requerem mais refinação usando uma serra de bola de diamante de precisão (por exemplo, Buehler Isomet). A aquisição de amostras com dimensões consistentes (até os dois centésimos/mm) é fundamental para garantir que os conjuntos de dados adquiridos sejam da mais alta qualidade e os resultados subsequentes sejam replicáveis.
O relatório limitado da metodologia de aquisição de amostras adiciona uma camada extra de dificuldade ao tentar empregar e/ou validar métodos realizados em um estudo anterior. Atualmente, os pesquisadores devem entrar em contato diretamente com os autores para obter mais detalhes sobre seus procedimentos de amostragem. O protocolo aqui detalhado fornece aos pesquisadores biomédicos uma técnica de amostragem completamente documentada, replicável e econômica. O objetivo principal deste artigo é fornecer um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente usando uma prensa de perfuração de moinho e coring de diamante para a visualização precisa e extração de dados microarquitecturais. Este método é modificado a partir de procedimentos utilizados para coletar rotineiramente cilindros uniformes de pequeno diâmetro (1-5 mm) de blocos de materiais duros em mecânica de rocha de alta pressão15,16,17,18,19.
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Protocol
Todos os espécimes foram provenientes de doadores cadavéricos embalsamados na Universidade de Toledo, Faculdade de Medicina e Ciências da Vida e na Universidade Médica do Nordeste de Ohio (NEOMED), com o consentimento informado do próprio doador ou dos parentes mais próximos do doador. O Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Akron para a Proteção dos Sujeitos Humanos (IRB) considerou esses espécimes isentos de revisão completa do IRB, pois não foram adquiridos de indivíduos vivos. Informações demográficas, incluindo idade, sexo e causa da morte estavam disponíveis para todos os doadores. Os indivíduos selecionados não apresentaram condições de afetação óssea documentadas nem exposição a regimes de tratamento que possam ter afetado a remodelação óssea no momento da morte. Amostras ósseas corticais foram obtidas a partir de femora de machos e fêmeas cadavéricos modernos com idades entre 19 e 101 anos de idade (média = 73,9 anos). O meio-eixo femoral tem sido estudado extensivamente incluindo exames de variação na porosidade cortical20,21,22,23,24 e densidade material do tecido ósseo25,26,27, e tornou-se, assim, um local comumente utilizado para análises microestruturais.
1. Aquisição de tecidos e Maceração
- Use uma serra oscilante equipada com uma lâmina de carboneto de corte de mergulho (para materiais compostos) para obter ~7,5 cm blocos ósseos das diafísicas médias da femora esquerda.
- Mergulhe os blocos femorais em um prato de vidro seguro para forno recheado com uma enzima de protease em pó e solução de água da torneira por 1 h em uma incubadora a 45 °C.
- Após a incubação, remova cuidadosamente quaisquer tecidos moles e periósteos restantes usando dissecção sem cortes ou ferramentas dentárias.
NOTA: Evite o uso de ferramentas afiadas (por exemplo, bisturi) para remover tecidos moles. Tais instrumentos podem causar danos ao osso detectável em escaneamentos μCT, afetando a preservação da amostra e a qualidade dos dados de varredura. - Remova detritos ou oclusãos na cavidade medular colocando blocos ósseos em um limpador ultrassônico por 5-10 minutos com 20:1 partes de água da torneira para solução de limpeza (ver Tabela de Materiais) ou usando um fio dental de água portátil (por exemplo, Waterpik).
- Mergulhe o bloco ósseo em um copo de espécime e encha com 70% de etanol. Deixe o osso de molho por pelo menos 24 horas para remover lipídios.
NOTA: Os xilenos também podem ser usados para remover lipídios. A imersão prolongada em xileno, no entanto, pode tornar o osso frágil ou calcário, pois é um emulsificante. - Após 24 horas, remova os blocos ósseos do etanol e deixe secar ao ar à temperatura ambiente por 24-48 horas.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Secção tecidual
- Coloque um deslizamento de microscópio de vidro de 75 x 25 mm em uma placa quente definida para 140 °C. Derreta uma quantidade generosa de resina térmica epóxi (ver Tabela de Materiais) no centro do slide.
- Se preparar seções finas adicionais para microscopia (<50 μm), o bloco ósseo pode precisar ser incorporado em uma epóxi de duas partes para preservar a trabecula. Além disso, ao implementar este protocolo para espécimes frágeis (por exemplo, osso diagenético ou espécimes altamente trabecularizados) é necessário incorporar espécimes em um epóxi.
NOTA: As amostras ósseas utilizadas neste protocolo foram recuperadas de amostras cadavéricas embalsamadas. Se amostras novas forem coletadas na autópsia ou em um caso cirúrgico para examinar estruturas de tecidos moles (por exemplo, vasculatura) via SRμCT, a impregnação com epóxi pode induzir danos a tais tecidos. Nestes casos, recomenda-se um meio adesivo alternativo ou de montagem (por exemplo, fita dupla face, argila de modelagem).
- Se preparar seções finas adicionais para microscopia (<50 μm), o bloco ósseo pode precisar ser incorporado em uma epóxi de duas partes para preservar a trabecula. Além disso, ao implementar este protocolo para espécimes frágeis (por exemplo, osso diagenético ou espécimes altamente trabecularizados) é necessário incorporar espécimes em um epóxi.
- Pressione o aspecto inferior do bloco ósseo na resina epóxi térmica na lâmina do microscópio, com o comprimento do osso perpendicular ao slide. Deslocar a amostra para frente e para trás, a fim de revestir a parte inferior do osso e garantir a adesão segura ao slide.
- Deixe o espécime montado descansar sobre a placa quente por ~5 minutos para permitir que o epóxi térmico se mete em poros e/ou rachaduras.
NOTA: O epóxi no slide deve estar livre de bolhas para melhor adesão. Para remover bolhas, mude a amostra para frente e para trás no slide. Bolhas geralmente se formam devido à água e/ou etanol preso dentro do osso escapando e evaporando. - Remova o slide com a amostra montada da placa quente usando fórceps sem cortes e deixe esfriar à temperatura ambiente por ~10 minutos. Remova qualquer epóxi da borda do slide usando uma lâmina de barbear para garantir que o mandril segure adequadamente o slide.
- Conecte o slide com a amostra aderida a um mandril de deslizamento de vidro e monte o mandril no braço giratório de uma serra de seção de velocidade lenta (ver Tabela de Materiais, Figura 2).
NOTA: Enquanto uma serra Buehler IsoMet foi empregada neste protocolo, outras serras de seção de precisão estão disponíveis que poderiam ser usadas no lugar do IsoMet (por exemplo, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Ajuste o braço giratório usando o mostrador de posicionamento para garantir os contatos da lâmina e transcecte a amostra. Posicione a amostra de tal forma que uma seção transversal do osso será cortada perpendicular ao seu comprimento.
- Adicione pesos ao outro lado do braço de corte para combater o peso do braço.
NOTA: Se for utilizado o contrapeso insuficiente, a amostra pode suportar a lâmina e causar a fratura da lâmina. - Adicione fluido de corte (20:1 partes de água ao fluido de corte) ao recipiente fluido da serra.
- Segure firmemente a lâmina do wafer de diamante e certifique-se de que o nível do fluido submerge a porção de corte da lâmina. Ajuste a velocidade para 200 RPM e baixe lentamente a amostra na lâmina(Figura 3).
- Certifique-se de que a lâmina e o mandril não estão balançando e/ou saltando. Se for observado movimento excessivo, pare imediatamente a serra e aperte a lâmina e/ou o conjunto do braço de mandril antes de retomar o corte. Adicione contrapesos adicionais se o mandril estiver se movendo agressivamente para cima e para baixo. O movimento excessivo, incluindo o movimento visível lado a lado, pode causar a fratura da lâmina.
- A primeira seção grossa é um "corte de resíduos" para fornecer uma superfície bem definida paralela a cada corte adicional. Após o corte inicial do resíduo, levante o braço giratório e mova o mandril em direção à lâmina 5 mm usando o mostrador de posicionamento. Seções mais grossas (~1 mm) para microscopia podem ser coletadas com este método.
NOTA: Para economizar tecidos valiosos, o corte de resíduos pode ser omitido. Ao seccionar uma amostra com uma borda desigual, no entanto, é fundamental que o pico do espécime seja alinhado tangencialmente até a borda da broca de coring.- Certifique-se de explicar o meio-fio da lâmina ao seção. Por exemplo, para obter uma seção de 5 mm de uma lâmina que tem um kerf de 0,5 mm, mova a amostra e jogue 5,5 mm em direção à lâmina.
- Após a secção completa, coloque o deslizamento de vidro com o espécime montado em uma placa quente para derreter o epóxi térmico. Isso permite a remoção rápida de blocos ósseos do slide.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Coring de amostra
- Monte seções ósseas de 5 mm até o fundo de uma lata de alumínio rasa (~8 cm de diâmetro) utilizando a técnica de ligação térmica epóxi, conforme descrito nas etapas 2.2-2.4.
- Coloque estanho em uma mesa de máquina XY da prensa de broca de moinho (ver Tabela de Materiais) e grampos de fixação de aperto de mão(Figura 4).
- Insira 2 mm de coring de coring de poço oco de 2 mm de diâmetro interno (ver Tabela de Materiais) ao mandril de broca de moinho. Ajuste o limitador de profundidade para evitar a coring através da lata(Figura 5).
- Alinhe o aspecto anterior central da amostra óssea abaixo da broca, evitando contato próximo com o periosteum, endosteum ou áreas altamente trabecularizadas.
NOTA: A seleção automatizada de cortices femorais médias anteriores não é viável, pois a espessura cortical varia entre os indivíduos, especialmente com o aumento da idade. - Encha a lata com água destilada para cobrir completamente a amostra. Isso evita o acúmulo de calor, queima da amostra e/ou danos na broca durante a perfuração.
NOTA: Para avaliar a possibilidade de danos térmicos causados pelo coring, um termômetro infravermelho foi usado para obter leituras de temperatura da água destilada, pois o trecho penetrou pela primeira vez na superfície dos ossos. A temperatura variou 1 °C, de 22,9 a 23,9 °C entre as dez amostras para este teste. Assim, argumentamos que o dano induzido pelo calor é insignificante. - Para as primeiras instâncias de contato entre o pedaço do núcleo e o osso, aplique pressão suave para usar um anel na superfície superior do osso. Isso evita a deflexão da broca no início do processo de coring e garante a correta colocação da broca.
- Durante o coring, levante a broca dentro e fora da amostra, mantendo a ponta da broca sob a superfície da água. Continue esta técnica a cada poucos segundos para liberar o pó ósseo preso e garantir que os detritos não estejam ocluindo a broca.
NOTA: Se o núcleo estiver formando uma forma cônica, é provável que seja devido a 1) permitindo tempo insuficiente para retirar o pó ósseo da broca de coring, e 2) o coring está ocorrendo muito rapidamente. O aumento da velocidade pode quebrar grandes pedaços da amostra e pulverizar o aspecto superior. - Após a conclusão do coring, o núcleo ósseo resultante pode ficar alojado na broca de haseada oca(Figura 6). Use um par de fórceps finos ou uma pequena chave Allen para desalojar o núcleo da broca(Figura 2).
- Armazene a amostra de cored em um tubo de microcentrifuuge rotulado em um local frio e seco até a imagem.
4. Rotinas de processamento de imagem para avaliação de parâmetros microarquiteturais ósseos a partir de núcleos ósseos corticais
- Reconstrução de imagens μCT
- Baixe e instale a versão mais recente do NRecon em https://www.bruker.com/products/microtomography.html para reconstrução das imagens de projeção SRμCT.
- Selecione o atalho NRecon no Desktop e o GPUReconServer associado aparecerá.
- Abra o conjunto de dados desejado na janela pop-up. Se a janela não aparecer, selecione o ícone da pasta no canto superior esquerdo da janela dataviewer.
- Selecione a primeira projeção da aquisição do SRμCT. Em Saída,remova as seleções para Usar ROI e Escalas ON.
- Escolha o destino do arquivo de reconstrução. Selecione Procurar e criar uma nova pasta chamada Recon. O formato de arquivo selecionado deve ser BMP(8).
- Verificar compensação de desalinhamento.
NOTA: Esta estimativa é muitas vezes próxima da correta. A renderização 3D áspera pode ser ajustada manualmente movendo as setas para cima e para baixo para deslocar as imagens sobrepostas para que as bordas direita e esquerda se alinhem o mais próximo possível. - Em Configurações,escolha seleções desejadas para aplicar suavizar, endurecer o feixe, rotação CS, objeto maior que os algoritmos FOV e Ring Artifacts.
- Ajuste o histograma em Saída selecionando Auto.
NOTA: A imagem resultante pode ser fraca. - Selecione Iniciar o processamento da reconstrução.
- Use nomenclatura padrão para os índices lacunar de canal/osteocito28. Estes podem incluir: volume total de tecido VOI (TV), volume do canal (Ca.V), número total de canais (Ca.N), diâmetro médio do canal (Ca.Dm), porosidade cortical (Ca.V/TV), dado como porcentagem, número total de lacunas (N.Lc) e volume médio de lacunas (Lc.V), entre outros. Para determinar a densidade do lacunar por mm3 (N.Lc/BV), o volume ósseo (VB) é calculado como volume total menos volume do canal (TV-Ca.V).
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
- Coleta de Dados Microarquitecturais a partir de imagens reconstruídas
- Baixe e instale a versão mais recente do CTAnalyser em https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para análise de parâmetros microarquiteturais.
NOTA: A versão gratuita do CTAnalyser é limitada em funcionalidade. Portanto, recomenda-se a compra de uma licença completa para realizar análises mais detalhadas. - Sob | de Imagem propriedades | Alterar o tamanho do Pixel,certifique-se de que o tamanho do pixel corresponda ao do protocolo de imagem μCT aplicado.
NOTA: Se a edição de imagens no ImageJ ou em um programa semelhante, observe que, ao salvar, o cabeçalho incorporado no arquivo TIFF será modificado e o software de análise alterará o tamanho do pixel ao importar o conjunto de dados. - Selecione Processamento personalizado a fim de criar uma lista de tarefas (ver Materiais Suplementares), para analisar a microarquitetura óssea a partir do conjunto de dados da varredura. Um protocolo geral para parâmetros de rede de osteocitos usando plugins proprietários do CTAnalyser segue aqui:
NOTA: A lista de tarefas do plugin funciona bem para conjuntos de dados onde a amostra é o único assunto visível no FOV. Se o espaço vazio cercar o espécime, a aplicação de um ROI é necessária. Caso contrário, os valores reunidos em Análise 3D e Análise individual de objetos serão artificialmente reduzidos.- Recarregue as imagens para redefinir e/ou ajustar quaisquer modificações (por exemplo, de edição no ImageJ ou similar) antes de abrir o menu de Processamento Personalizado no software de análise.
- Para reduzir o ruído nas imagens, aplique um filtro gaussiano de baixa passagem em espaço 3D com um kernel redondo e um raio de 2-3.
NOTA: Essas configurações foram aplicadas aos conjuntos de dados dos experimentos SRμCT relatados através de testes de tentativa e erro. O objetivo era obter as melhores reconstruções de qualidade para os dados. Ajuste as configurações de reconstrução para se adequar a cada configuração experimental única. - Aplique um limiar global de escala de cinza às imagens selecionando valores baixos e altos para destacar canais vasculares. As fatias reconstruídas vistas nas Figuras 8B e 8D retratam um limiar de exemplo de 0-155.
NOTA: Semelhante ao passo 4.2.3.2, as configurações de limiar aplicadas aqui foram escolhidas através de tentativa e erro extensos. O limiar deve ser ajustado para cada configuração experimental e sistema de imagem μCT utilizado. - Despeckle (denoise) para remover manchas brancas em espaço 3D que estão dentro da faixa de tamanho de pixel volutrico (voxel) de osteocito lacunae, a fim de isolar apenas canais.
NOTA: Para uma varredura SRμCT de osso cortical humano tomado a 0,9 μm de tamanho de pixel, o limite inferior para lacunas de osteocito é de 13 voxels. - Despeckle para remover quaisquer manchas pretas no espaço 2D para remover artefatos nos canais. Estes podem ser bastante grandes em 2D, assim remova recursos que são <15.000 pixels.
- Dilatar os poros em espaço 3D usando a função de operação morfológica com um núcleo redondo de 2 ou 3 raios, dependendo da qualidade das imagens, a fim de isolar quaisquer tecidos moles presos nos canais.
- Execute uma função Despeckle adicional usando as mesmas configurações da etapa 4.2.3.5. a fim de remover tecidos moles isolados dentro dos canais.
- Corroer a dilatação do passo 4.2.3.6. usando uma função de operação morfológica usando um kernel redondo com raio de 2 ou 3. O raio desta etapa deve corresponder ao raio utilizado no Procedimento 4.2.3.6.
- Execute a análise 3D e selecione quais parâmetros calcular para o volume de canais vasculares. Geralmente, os valores básicos fornecerão informações suficientes.
- Salve as imagens processadas com Save Bitmaps em uma subpasta personalizada no diretório.
NOTA: Se for recomendado criar uma imagem de reconstrução 3D a partir das imagens processadas usando um programa como Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti, etc., salvar as imagens como monocromática (1 bit) é recomendado. - Calcule o número de canais vasculares e descreva seu tamanho, forma e orientação usando a função Análise de Objetos Individuais.
- Repetição passos 4.2.3.1 – 4.2.3.3. para redefinir a imagem para análise de osteocito lacunar.
- Remova as manchas brancas no espaço 3D usando a função Despeckle, garantindo que tais artefatos sejam menores do que o limite inferior do tamanho do lacunar. Esta etapa remove o ruído da varredura que pode parecer ser poros cortical, preservando a verdadeira lacuna de osteociato. Para varreduras humanas de SRμCT de tamanho de pixel de 0,9 μm, este limite inferior é de 13 voxels.
- Despeckle mais uma vez para remover manchas brancas que são maiores do que o limite superior do tamanho do lacunar. Para conjuntos de dados SRμCT humanos com as configurações listadas na etapa 4.2.3.13, este limite é de 2743 voxels.
- Realize análise 3D para extrair informações microestruturais relativas especificamente à lacuna de osteociato.
- Selecione Salvar bitmaps para salvar as imagens processadas, a fim de isolar a lacuna de osteocito.
- Realize a Análise individual de objetos para calcular o número de osteocitos em 3D dentro do Volume de Interesse (VOI) selecionado.
NOTA: Uma vez que a lista de tarefas tenha sido estabelecida e testada, a CTAnalyser possui uma função de gerenciador de lotes (BatMan) que pode ser empregada para acelerar a extração de dados e garantir o processamento uniforme de imagem. Uma lista de tarefas com configurações de exemplo para o Procedimento 4.2.3. podem ser encontrados nos Materiais Suplementares.
- Baixe e instale a versão mais recente do CTAnalyser em https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para análise de parâmetros microarquiteturais.
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Representative Results
O método descrito de amostragem do núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Os espécimes de coring usando este protocolo permitiram a aquisição de amostras de >300 consistentemente dimensionadas para experimentos na linha de feixe CLS BMIT-BM2, com um FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamanho voxel. Para validar a consistência do diâmetro do núcleo, foram realizadas três medidas ao longo do comprimento (superior, médio, inferior) de um subconjunto de núcleos femorais anteriores humanos (n=69). O diâmetro médio dos núcleos foi de 1,96 ± 0,11 mm, e o afinamento médio ao longo do comprimento do núcleo foi de 0,06 ± 0,06 mm/mm Para enfatizar a aplicabilidade a outros materiais compostos duros, tentamos este método em amostras de dolomite (n=32) resultando em um diâmetro médio de 1,06 ± 0,02 mm. O afinamento ao longo do comprimento da amostra do núcleo foi registrado como 0,01 ± 0,005 mm/mm. Figuras representativas comparando o fluxo de trabalho de processamento de imagem de uma amostra de cored e uma obtida usando uma ferramenta rotativa (por exemplo, Dremel), conforme descrito na etapa 4.2.3, podem ser visualizadas na Figura 7. O corte amostral utilizando a ferramenta rotativa comum apresentou um aumento do número de canais (Ca.N) e lacunae (Lc.N), e uma diminuição do diâmetro médio do canal (Ca.Dm), volume do canal (Ca.V) e porosidade cortical (Ca.V/TV) quando comparado com a amostra de cored. Embora algumas dessas diferenças possam ser decorrentes da variação microestrutural óssea entre os indivíduos, o maior número de canais e lacunas extraídos do conjunto de dados da ferramenta rotativa provavelmente aumentou artificialmente devido a artefatos de varredura e ruído(Figura 7). Os dados de porosidade coletados da etapa 4.2.3.9 para cada amostra estão localizados na Tabela 1. Vale ressaltar que, embora o protocolo de coring diminua os artefatos observados nas varreduras SRμCT, as figuras de baixa qualidade e carregadas de artefatos dos experimentos de blocos ósseos retilineares(Figura 7A) representam um problema multifacetado. Certos artefatos (por exemplo, sinais de contraste de fase) podem ter sido causados por problemas síncrotrons ou específicos da linha de trave. Os parâmetros de varredura para ambos os conjuntos representativos de experimentos e as figuras associadas (Figuras 7A, 7B) podem ser encontrados nos Materiais Suplementares (Tabelas S1, S2).
Imagens micro-CT síncrotrons coletadas a partir de amostras de cored suprimiram com sucesso artefatos de varredura, como demonstrado acima, incluindo artefatos de listras. O processamento subsequente de imagens confirmou o potencial da técnica para melhorar a visualização da microarquitetura óssea cortical. Por exemplo, foram observadas diferenças de mineralização, melhor delineamento das fronteiras osteonais e visualização consistente de tecidos moles dentro dos canais vasculares (Figuras 8C, 8D). Este último é fundamental para o processamento de imagens, pois a visualização parcial de tecidos moles dentro dos canais pode resultar em cálculos imprecisos de por cento de porosidade e espessura dos poros, uma vez que os poros não estão totalmente preenchidos. Os limites da lacuna de osteociato também foram melhorados devido à diminuição da birefringência, permitindo a quantificação dos parâmetros de forma. As vantagens potenciais da técnica de coring descrita incluem facilidade de centralização da amostra no FOV, redução dos requisitos analíticos e visualização consistente de tecidos moles dentro de canais vasculares.
Procedimentos semelhantes têm sido usados com sucesso para núcleo de cristais únicos de ortoxiroxeno18,magnésite policristalino19 e outros materiais geológicos15,16,17 para experimentos de deformação de rochas de alta pressão. Esses experimentos requerem núcleos em orientações específicas relativas a eixos cristalográficos em cristais únicos18 ou cristais alinhados em rochas policristalinas19, a fim de determinar pontos fortes específicos da orientação. As abordagens descritas acima têm sido usadas para criar primeiramente lajes orientadas e, posteriormente, coletar múltiplos núcleos uniformes e cilíndricos para séries de experimentos de deformação. Esses métodos podem ser usados para coletar núcleos de qualquer material duro, como osso, cerâmica ou óculos. Por exemplo, a metodologia acima poderia ser aplicada por antropólogos biológicos para avaliar núcleos de regiões específicas dentro do osso cortical e seus eixos biomecânicos associados (por exemplo, tensão/compressão).
Figura 1. VOI cilíndrico de um fêmur médio humano anterior esquerdo. Uma única fatia reconstruída de SRμCT de um núcleo inteiro a partir de um fêmur médio humano anterior esquerdo (mulher de 21 anos)(A),e renderizações 3D de um VOI cilíndrico de vistas superiores (B) e anterior(C) são visualizadas. As projeções foram tomadas a 0,9 μm, com canais vasculares destacados em vermelho e osteocito lacunae em cinza. As barras de escala denotam 0,25 mm(A)e 0,02 mm(B,C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma amostra femoral de eixo médio (5 mm de espessura) montada em um slide de microscópio de vidro com epóxi térmico (ver Tabela de Materiais) e presa a um mandril de lâmina de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Manto de lâmina de vidro com espécime montado preso ao braço giratório de uma serra de secção de baixa velocidade (ver Tabela de Materiais) antes da secção. A posição lateral do braço giratório em relação à lâmina da serra e à velocidade de secção (RPM) são exibidas nas linhas superior e inferior do display LCD, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Uma seção femoral de 5 mm montada em uma lata de alumínio e presa a uma mesa de máquina de prensa de broca de moinho XY usando grampos de fixação na preparação para o coring. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A prensa de perfuração de moinhos empregada no protocolo elaborado (A). A seta identifica o limitador de profundidade, o que impede que a broca penetrásse profundamente na amostra ou através da parte inferior da lata(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Uma seção transversal de osso femoral de 5 mm após a aquisição do núcleo do aspecto anterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Única SRμCT reconstruiu fatias do aspecto anterior do fêmur esquerdo de dois indivíduos. A amostra(A)foi seccionada utilizando uma ferramenta rotativa comum e (B) foi adquirida utilizando o método de coring descrito aqui. Cada fatia é comparada com sua contraparte segmentada (C e D). Note-se a facilidade de isolamento da porosidade cortical na amostra de cored(D)em oposição ao espécime recolhido com a ferramenta rotativa (C). Isso é evidenciado ainda nas renderizações 3D dos canais vasculares de cada amostra(E e F). O ruído ao redor da periferia de B é evidente e o espécime deixa o FOV, o que resulta em desafios maiores durante o processamento da imagem. A barra de escala no painel(D)denota 250 μm para painéis(A-D). As barras de escala nos painéis(E e F) denotam 700 e 600 μm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Um ROI representativo de uma amostra adquirida com uma ferramenta rotativa (A-C) e um cored utilizando o método aqui apresentado (D-F). Os painéis (A) e(D) representam o ROI designado das varreduras SRμCT. Os painéis (B) e(E) representam o estágio de processamento utilizado para isolar e extrair parâmetros do canal vascular. No canto superior direito do painel (B) há objetos estranhos (setas) que foram classificados como canais vasculares por software de processamento de imagem. Os painéis (C) e(F) representam a etapa de processamento utilizada para isolar e extrair lacunas. Barras de escala denotam 0,1 mm para todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume de tecido (TV) | Volume do canal (Ca.V) | Superfície do Canal (Ca.S) | Porosidade Cortical (Ca.V/TV) | Canal Surface to Tissue Volume (Ca.S/TV) | Diâmetro médio do canal (Ca.Dm) | Separação média do canal (Ca.Sp) | Não. de Canais (Ca.N) | Não. de Lacunae (Lc.N) | Densidade de poros (Poros/TV) | |
| Unidades | mm³ | mm³ | mm² | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | poros/μm³ |
| Corte Rotativo | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Este método) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Mesa 1. Resultados representativos para a etapa 4.2.3.9 da ferramenta rotativa e amostras de cored visualizadas na Figura 8. Observe a diminuição de Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, número de poros e densidade de poros para a amostra de corte rotativo, bem como o aumento do número de canais vasculares e lacunas. Os artefatos de varredura parcialmente induzidos pela amostra de corte irregular provavelmente contribuíram para um aumento artificial de lacunas e poros cortical.
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Discussion
Não houve nenhum protocolo abrangente e padronizado para a aquisição de amostras de núcleo ósseo cortical uniforme e cilíndrico para imagens SRμCT de alta resolução com configurações fov limitadas. O protocolo aqui detalhado preenche esse vazio fornecendo um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para imagens SRμCT e a visualização e extração precisa subsequente de dados microarquiteturais. Mostramos que nosso protocolo fornece um método mais padronizado e confiável para a aquisição de núcleos ósseos corticais do que descrições anteriores de blocos ósseos retilineares de dimensões arbitrárias. Assim, pesquisadores que se basearam em ferramentas rotativas portáteis (por exemplo, Dremel) para remover blocos de tamanho irregular de osso provavelmente experimentaram tempos de configuração amostral muito mais longos durante a imagem e maiores erros no limiar e extração de poros cortical durante a análise. Essa discrepância destaca a necessidade e significância deste protocolo padronizado no que diz respeito à preparação da amostra óssea, posterior visualização e análise e interpretação dos resultados.
O procedimento aqui descrito pode ser adaptado por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam tecidos ósseos, como antropólogos biológicos e arqueólogos. No entanto, não foram cored para o protocolo de pesquisa descrito. A diagênese, na geologia, refere-se a alterações de um material (por exemplo, osso) após a deposição e pode abranger alterações causadas por meios físicos, químicos ou biológicos29,30. Água subterrânea, fungos e outras infiltrações microbianas podem atuar como agentes diagenéticos e alterar a micromorfologia do tecido ósseo31. Esses espécimes podem exigir etapas processuais adicionais antes do coring, como a incorporação em metacrilato de metila (MMA) ou uma resina epóxi em duas partes. A incorporação dos blocos femorais não era necessária para os experimentos descritos devido à natureza densa do osso cortical femoral, e o fato de que espécimes cadavéricos foram embalsamados logo após a morte. Se avaliar elementos esqueléticos frágeis e suas trabeculas (por exemplo, costelas), no entanto, recomendamos incorporar todo o bloco ósseo antes do coring.
Todos os tecidos ósseos avaliados neste estudo foram embalsamados enquanto frescos. Os autores não tiveram acesso à combinação específica de produtos químicos utilizados durante o processo de embalsamamento, embora os produtos químicos de preservação comumente incluam formaldeído, etanol, fenol, etileno glicol e glutaraldeído. Os dados antropológicos forenses que documentam mudanças na microestrutura de ossos saturados de formaldeído são limitados, embora Freidlander32 tenha demonstrado que a fixação do formaldeído não altera a morfologia de certas características, incluindo canais haversianos e osteons secundários. A saturação do formaldeído, no entanto, tem efeitos documentados em certas propriedades mecânicas e características de fratura de osso não humano, como resistência ao impacto e resistência à fratura33,34.
Relatamos um método para coring amostras de ossos cortical antes da imagem com sistemas de raios-X de alta resolução (SRμCT). Este método é econômico, devido ao fato de que materiais e equipamentos podem ser provenientes de lojas de hardware locais, eficientes e garantem um tamanho uniforme de amostra entre os espécimes. Esperamos que nossas sugestões reduzam as consultas relativas à forma como as amostras devem ser adquiridas, cored e analisadas para o SRμCT, uma vez que a literatura existente permanece escassa e carece de detalhes críticos sobre a preparação e análise subsequente. Nosso objetivo principal é motivar os pesquisadores a aplicar este protocolo de coring como procedimento padronizado para pesquisa de imagem óssea de alta resolução. Esperamos ainda que as dificuldades supracitadas que experimentamos no desenvolvimento dessa técnica aliviem questões comuns e forneçam orientações para a solução de problemas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa descrita neste artigo foi realizada na instalação do BMIT na Canadian Light Source, que é apoiada pela Fundação canadense para Inovação, Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá, universidade de Saskatchewan, governo de Saskatchewan, Diversificação Econômica Ocidental do Canadá, Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer aos cientistas de linha de luz canadenses na Canadian Light Source, particularmente Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu pela assistência na configuração e solução de problemas dos sistemas de microscópio SkyScan SRμCT e feixe branco. Também queremos agradecer a Beth Dalzell, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida da Universidade de Toledo, e ao Dr. Jeffrey Wenstrup, da Universidade Médica do Nordeste de Ohio, pelo acesso a amostras cadavéricas para este estudo. JM Andronowski é apoiado por meio de fundos de pesquisa de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e uma bolsa do Instituto Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Justiça em Ciência Forense para Fins de Justiça Criminal (2018-DU-BX-0188). RA Davis é apoiado por uma assistente de pós-graduação fornecida pela Universidade de Akron. Equipamentos e suprimentos utilizados para coring e serragem foram comprados por fundos de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e NSF concedem EAR-1624242 à CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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