Summary
Abbiamo utilizzato un protocollo di campionamento geologico (coring) per procurare campioni ossei corticali di dimensioni uniformi per esperimenti SRμCT dall'aspetto anteriore della femora umana. Questo metodo è minimamente distruttivo, efficiente, si traduce in campioni cilindrici che riducono al minimo gli artefatti di imaging da forme campione irregolari e migliorano la visualizzazione e l'analisi microarchitettonica.
Abstract
L'osso è un tessuto dinamico e meccanicamente attivo che cambia struttura nel corso della vita umana. I prodotti del processo di rimodellamento osseo sono stati studiati sostanzialmente utilizzando tecniche bidimensionali tradizionali. I recenti progressi nella tecnologia di imaging a raggi X attraverso la tomografia micro-computerizzata desktop (μCT) e la tomografia micro-computerizzata a radiazione di sincrotrone (SRμCT) hanno permesso l'acquisizione di scansioni tridimensionali (3D) ad alta risoluzione di un campo visivo più ampio (FOV) rispetto ad altre tecniche di imaging 3D (ad esempio, SEM) fornendo un quadro più completo delle strutture microscopiche all'interno dell'osso corticale umano. Il campione deve essere centrato accuratamente all'interno del FOV, tuttavia, per limitare la comparsa di artefatti striati noti per influire sull'analisi dei dati. Studi precedenti hanno riportato l'approvvigionamento di blocchi ossei rettilinei di forma irregolare che si traducono in artefatti di imaging dovuti a bordi irregolari o troncamento dell'immagine. Abbiamo applicato un protocollo di campionamento geologico (coring) per procurare campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti per esperimenti SRμCT dall'aspetto anteriore della femora umana. Questo metodo di coring è efficiente e minimamente distruttivo per i tessuti. Crea campioni cilindrici uniformi che riducono gli artefatti di imaging per natura di essere isometrici durante la rotazione e forniscono una lunghezza uniforme del percorso per i raggi X durante la scansione. L'elaborazione delle immagini dei dati tomografici a raggi X di campioni cored e di forma irregolare conferma il potenziale della tecnica per migliorare la visualizzazione e l'analisi della microarchitettura ossea corticale. Un obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo affidabile e ripetibile per l'estrazione di nuclei ossei corticali adattabili per vari tipi di esperimenti di imaging osseo ad alta risoluzione. Un obiettivo generale del lavoro è quello di creare un approvvigionamento osseo corticale standardizzato per SRμCT che sia conveniente, coerente e diretto. Questa procedura può essere ulteriormente adattata dai ricercatori in campi correlati che comunemente valutano materiali compositi duri come in antropologia biologica, geoscienze o scienze dei materiali.
Introduction
Con i recenti progressi nella tecnologia di imaging, è ora possibile acquisire dati di imaging a raggi X con una risoluzione molto elevata. I sistemi micro-CT desktop (μCT) sono lo standard attuale per l'imaging dell'osso cancello a causa della loro natura non distruttiva1. Quando si imagingno caratteristiche microstrutturali dell'osso corticale, tuttavia, l'uso di μCT è stato più limitato. A causa di vincoli di risoluzione, i sistemi desktop non possono raggiungere la risoluzione richiesta per l'immagine di caratteristiche microstrutturali più piccole dei pori corticali, come le lacune osteocite. Per questa applicazione, SRμCT è ideale grazie alla maggiore risoluzione di questi sistemi1. Ad esempio, esperimenti presso la Canadian Light Source (CLS) sulle linee di fascio BMIT (BioMedical Imaging and Therapy)2 hanno prodotto immagini con voxel di dimensioni fino a 0,9 μm. Studi precedenti1,3,4,5 hanno utilizzato questa risoluzione per acquisire proiezioni e successivi rendering tridimensionali (3D) da campioni ossei corticali da ossa lunghe umane ( Figura1) per quantificare la densità lacunare degli osteociti4,6,7,8,9 e la variazione della forma lacunare e della dimensione3 nella durata della vita umana e tra i sessi. Ulteriori studi hanno dimostrato la presenza di bande osteoniche nell'uomo10, un fenomeno precedentemente riconosciuto come associato solo a mammiferi non umani nella letteratura antropologica forense.
Per ottenere una risoluzione eccezionale, il fascio di raggi X deve essere finemente focalizzato all'interno del campo visivo (FOV), che spesso limita la dimensione massima del campione a pochi millimetri di diametro. Attualmente, non ci sono state procedure complete e standardizzate descritte nella letteratura che delineano l'approvvigionamento di campioni ossei che soddisfano queste restrizioni. Centrare i campioni all'interno del FOV è fondamentale per garantire che 1) il campione rimanga centrato mentre ruota di 180 ° durante l'imaging e 2) gli artefatti di scansione siano limitati poiché non vi è troncamento dell'immagine. In altre parole, nessuna porzione del campione al di fuori del FOV interferisce con il fascio che entra nel suo punto focale all'interno del FOV. In questo caso, l'algoritmo di ricostruzione viene privato di alcuni dei dati di attenuazione necessari per una ricostruzione completamente corretta. Vale inoltre la pena notare che le scansioni a 360° (rotazione completa) riducono al minimo gli effetti dell'indurimento del fascio ma aumentano gli artefatti causati dal disallineamento e dal movimento del campione durante l'imaging. Pertanto, mentre una scansione a 360 ° genererà in genere dati più puliti, il tempo di imaging viene raddoppiato e quindi è necessario affrontare un compromesso tra costi sperimentali e qualità dei dati.
Un aspetto importante e spesso trascurato degli esperimenti di imaging osseo è la tecnica accurata e replicabile di preparazione dei campioni eseguita prima della scansione. Gli studi che incorporano metodi SRμCT nei loro esperimenti menzionano brevemente il loro protocollo di campionamento, ma gli autori forniscono pochi o nessun dettaglio riguardo alla particolare metodologia utilizzata per raccogliere i loro campioni. Molti di questi studi menzionano il taglio di blocchi ossei rettilinei di dimensioni arbitrarie, ma generalmente non forniscono ulteriori informazioni sugli utensili o sui materiali di incorporamentoutilizzati 3,4,10,11,12,13,14. Alcuni ricercatori usano comunemente strumenti rotativi portatili (ad esempio, Dremel) per rimuovere blocchi rettilinei di osso da una regione di interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Questo metodo si traduce in campioni di dimensioni non uniforme che possono essere più grandi del FOV, aumentando la probabilità di artefatti di scansione e troncamento delle immagini. Tali campioni spesso richiedono un'ulteriore raffinazione utilizzando una sega a wafer di diamante di precisione (ad esempio, Buehler Isomet). L'approvvigionamento di campioni con dimensioni coerenti (fino ai due centesimi/mm) è fondamentale per garantire che i set di dati acquisiti siano della massima qualità e che i risultati successivi siano replicabili.
La segnalazione limitata della metodologia di approvvigionamento del campione aggiunge un ulteriore livello di difficoltà quando si tenta di utilizzare e/o convalidare metodi eseguiti in uno studio precedente. Attualmente, i ricercatori devono contattare direttamente gli autori per ulteriori dettagli sulle loro procedure di campionamento. Il protocollo qui dettagliato fornisce ai ricercatori biomedici una tecnica di campionamento accuratamente documentata, replicabile ed economica. L'obiettivo principale di questo articolo è quello di fornire un tutorial completo su come procurarsi campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti utilizzando una pressa per fresatura e una punta di coring a diamante per la visualizzazione accurata e l'estrazione di dati microarchitettotechi. Questo metodo viene modificato dalle procedure utilizzate per raccogliere regolarmente cilindri uniformi di piccolo diametro (1-5 mm) da blocchi di materiali duri in meccanica delle rocce adalta pressione 15,16,17,18,19.
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Protocol
Tutti gli esemplari provengono da donatori cadaverici imbalsamato presso l'Università di Toledo, il College of Medicine and Life Sciences e la Northeast Ohio Medical University (NEOMED), con il consenso informato del donatore stesso o dei parenti prossimi del donatore. L'University of Akron Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) ha ritenuto questi esemplari esenti dalla revisione completa dell'IRB in quanto non sono stati acquistati da individui viventi. Informazioni demografiche tra cui età, sesso e causa di morte erano disponibili per tutti i donatori. Gli individui selezionati non hanno documentato condizioni che influiscono sulle ossa né esposizione a regimi di trattamento che potrebbero aver influito sul rimodellamento osseo al momento del decesso. Campioni ossei corticali sono stati ottenuti da femora di maschi e femmine moderni cadaverici con età compresa tra 19 e 101 anni (media = 73,9 anni). L'albero medio femorale è stato ampiamente studiato includendo esami di variazione della porosità corticale20,21,22,23,24 e densità del materiale del tessutoosseo 25,26,27, ed è quindi diventato un sito comunemente usato per le analisi microstrutturali.
1. Approvvigionamento e macerazione dei tessuti
- Utilizzare una sega oscillante dotata di una lama in carburo da taglio a tuffo (per materiali compositi) per procurarsi blocchi ossei di ~ 7,5 cm dalle diafisi medie della femora sinistra.
- Immergere i blocchi femorali in un piatto di vetro sicuro per il forno riempito con un enzima proteasi in polvere e una soluzione di acqua del rubinetto per 1 h in un'incubatrice impostata a 45 °C.
- Dopo l'incubazione, rimuovere con cura tutti i tessuti molli rimanenti e il periostio utilizzando dissezione smussata o strumenti dentali.
NOTA: Evitare l'uso di strumenti affilati (ad esempio bisturi) per rimuovere i tessuti molli. Tali strumenti possono causare danni all'osso rilevabili nelle scansioni μCT, influenzando la conservazione del campione e la qualità dei dati di scansione. - Rimuovere detriti o occlusione nella cavità midollare posizionando i blocchi ossei in un pulitore ad ultrasuoni per 5-10 minuti con acqua del rubinetto a 20:1 parti per la soluzione di pulizia (vedi Tabella dei materiali)o utilizzando un filo interdentale portatile (ad esempio, Waterpik).
- Immergere il blocco osseo in una tazza di campione e riempire con il 70% di etanolo. Lasciare in ammollo l'osso per almeno 24 ore per rimuovere i lipidi.
NOTA: Gli xileni possono anche essere usati per rimuovere i lipidi. L'immersione prolungata negli xileni, tuttavia, può rendere l'osso fragile o gessoso in quanto è un emulsionante. - Dopo 24 ore, rimuovere i blocchi ossei dall'etanolo e lasciare asciugare all'aria a temperatura ambiente per 24-48 ore.
NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui.
2. Sessatura dei tessuti
- Posizionare uno scivolo al microscopio in vetro da 75 x 25 mm su una piastra calda impostata su 140 °C. Sciogliere una generosa quantità di resina epossidica termica (vedi Tabella dei materiali)al centro dello scivolo.
- Se si preparano sezioni sottili aggiuntive per la microscopia (<50 μm), potrebbe essere necessario che il blocco osseo sia incorporato in un epossidico in due parti per preservare le trabecole. Inoltre, quando si implementa questo protocollo per campioni fragili (ad esempio, ossa diagenetiche o campioni altamente trabecolari) è necessario incorporare campioni in un epossidico.
NOTA: I campioni ossei utilizzati in questo protocollo sono stati recuperati da campioni cadaverici imbalsami. Se campioni freschi vengono raccolti all'autopsia o da un caso chirurgico per esaminare le strutture dei tessuti molli (ad esempio, la vascucolatura) tramite SRμCT, l'impregnazione con epossidico può indurre danni a tali tessuti. In questi casi, si consiglia un adesivo alternativo o un mezzo di montaggio (ad esempio, nastro a doppia parte, argilla modellante).
- Se si preparano sezioni sottili aggiuntive per la microscopia (<50 μm), potrebbe essere necessario che il blocco osseo sia incorporato in un epossidico in due parti per preservare le trabecole. Inoltre, quando si implementa questo protocollo per campioni fragili (ad esempio, ossa diagenetiche o campioni altamente trabecolari) è necessario incorporare campioni in un epossidico.
- Premere l'aspetto inferiore del blocco osseo nella resina epossidica termica sullo scivolo del microscopio, con la lunghezza dell'osso perpendicolare allo scivolo. Spostare il campione avanti e indietro per rivestire la parte inferiore dell'osso e garantire un'adesione sicura allo scivolo.
- Lasciare riposare il campione montato sulla piastra calda per ~ 5 minuti per consentire all'epossidico termico di assorbirsi in pori e / o crepe.
NOTA: L'epossidico sullo scivolo deve essere privo di bolle per la migliore adesione. Per rimuovere le bolle, spostate il campione avanti e indietro nella diapositiva. Le bolle si formano spesso a causa dell'acqua e/o dell'etanolo intrappolati all'interno dell'osso che fuorievengono ed evaporano. - Rimuovere lo scivolo con il campione montato dalla piastra calda utilizzando forcette smussate e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per ~ 10 minuti. Rimuovere eventuali epossidici dal bordo dello scivolo utilizzando una lama di rasoio per assicurarsi che il mandrino afferra adeguatamente lo scivolo.
- Attaccare lo scivolo con il campione aderente a un mandrino scorrevole di vetro e montare il mandrino sul braccio girevole di una sega segheria a bassa velocità (vedere Tabella dei materiali, Figura 2).
NOTA: Mentre una sega Buehler IsoMet è stata utilizzata in questo protocollo, sono disponibili altre seghe di sesatura di precisione che potrebbero essere utilizzate al posto dell'IsoMet (ad esempio, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Regolare il braccio girevole utilizzando il quadrante di posizionamento per assicurarsi che la lama contatti e trasmetta il campione. Posizionare il campione in modo che una sezione trasversale dell'osso venga tagliata perpendicolarmente alla sua lunghezza.
- Aggiungere pesi sul lato opposto del braccio di taglio per contrastare il peso del braccio.
NOTA: Se viene utilizzato un contrappeso insufficiente, il campione può cadere sulla lama e causare la frattura della lama. - Aggiungere il fluido di taglio (20:1 parti di acqua al fluido da taglio) al contenitore del fluido della sega.
- Fissare saldamente la lama del wafer di diamante e assicurarsi che il livello del fluido sommergi la porzione di taglio della lama. Impostare la velocità su 200 RPM e abbassare lentamente il campione sulla lama (Figura 3).
- Assicurarsi che la lama e il mandrino non traballino e/o rimbalzino. Se si nota un movimento eccessivo, arrestare immediatamente la sega e stringere la lama e/o il gruppo del braccio del mandrino prima di riprendere il taglio. Aggiungere contrappesi aggiuntivi se il mandrino si muove aggressivamente su e giù. Un movimento eccessivo, incluso il movimento visibile da un lato all'altro, può causare la frattura della lama.
- La prima sezione spessa è un "taglio dei rifiuti" per fornire una superficie ben definita parallela ad ogni taglio aggiuntivo. Dopo il taglio iniziale dei rifiuti, sollevare il braccio girevole e spostare il mandrino verso la lama di 5 mm utilizzando il quadrante di posizionamento. Ulteriori sezioni spesse (~1 mm) per microscopia possono essere ulteriormente raccolte con questo metodo.
NOTA: Per risparmiare tessuto prezioso, il taglio dei rifiuti può essere omesso. Quando si sessetta un campione con uno spigolo irregolare, tuttavia, è fondamentale che il picco del campione sia allineato tangenzialmente allo spigolo della punta del trapano di coring.- Assicurarsi di tenere conto del kerf della lama durante la sessatura. Ad esempio, per ottenere una sezione di 5 mm da una lama con un kerf di 0,5 mm, spostare il campione e mandare di 5,5 mm verso la lama.
- Al termine della sessatura, posizionare lo scivolo di vetro con il campione montato su una piastra calda per sciogliere l'epossidico termico. Ciò consente una rapida rimozione dei blocchi ossei dallo scivolo.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Coring del campione
- Montare sezioni ossee da 5 mm sul fondo di uno stagno di alluminio poco profondo (~8 cm di diametro) utilizzando la tecnica di incollaggio epossidico termico come descritto nei passaggi 2.2-2.4.
- Posizionare lo stagno su un tavolo macchina XY della pressa per fresatura (vedere Tabella dei materiali) e stringere a mano i morsetti di fissaggio ( Figura4).
- Inserire la punta di perforazione a punta di diamante del gioielliere ad albero cavo di 2 mm di diametro interno (vedere Tabella dei materiali)nel mandrino del trapano del mulino. Regolare il limitatore di profondità per evitare di coring attraverso lo stagno (Figura 5).
- Allineare l'aspetto anteriore centrale del campione osseo sotto la punta del trapano evitando uno stretto contatto con il periostio, l'endosteo o le aree altamente trabecolari.
NOTA: La selezione automatizzata delle cortici femorali medio-anteriori non è fattibile in quanto lo spessore corticale varia tra gli individui, specialmente con l'aumentare dell'età. - Riempire lo stagno con acqua distillata per coprire completamente il campione. Ciò impedisce l'accumulo di calore, la combustione del campione e/o danni alla punta del trapano durante la coring.
NOTA: Per valutare la possibilità di danni da calore causati dalla coring, è stato utilizzato un termometro a infrarossi per ottenere letture della temperatura dall'acqua distillata mentre la parte di coring penetrava per la prima volta nella superficie delle ossa. La temperatura variava di 1 °C, da 22,9 a 23,9 °C tra i dieci campioni cored per questo test. Pertanto, sosteniamo che i danni indotti dal calore sono trascurabili. - Per i primi casi di contatto tra la parte del nucleo e l'osso, applicare una pressione delicata per indossare un anello sulla superficie superiore dell'osso. Ciò impedisce la deflessione della punta di perforazione all'inizio del processo di coring e garantisce il corretto posizionamento del bit.
- Durante il coring, sollevare la punta del trapano in uscita dal campione mantenendo la punta del bit sotto la superficie dell'acqua. Continuare questa tecnica ogni pochi secondi per eliminare la polvere ossea intrappolata e assicurarsi che i detriti non occluso la punta del trapano.
NOTA: Se il nucleo sta formando una forma conica, è probabile che sia dovuto a 1) che non consente tempo sufficiente per sciacquare la polvere ossea dalla parte di coring e 2) il coring si sta verificando troppo rapidamente. L'aumento della velocità può spezzare pezzi di grandi dimensioni dal campione e polverizzare l'aspetto superiore. - Una volta completata la coring, il nucleo osseo risultante può essere depositato nella punta di perforazione a gambo cavo (Figura 6). Utilizzare una coppia di flessione a punta fine o una piccola chiave Allen per spodesare il nucleo dal bit (Figura 2).
- Conservare il campione cored in un tubo di microcentrifugo marcato in un luogo fresco e asciutto fino all'imaging.
4. Routine di elaborazione delle immagini per la valutazione dei parametri microarchitettotechi ossei da nuclei ossei corticali
- Ricostruzione delle immagini μCT
- Scaricare e installare l'ultima versione di NRecon https://www.bruker.com/products/microtomography.html per la ricostruzione delle immagini di proiezione SRμCT.
- Selezionare il collegamento NRecon sul desktop e verrà visualizzato il GPUReconServer associato.
- Aprire il set di dati desiderato nella finestra popup. Se la finestra non viene visualizzata, selezionare l'icona della cartella nell'angolo superiore sinistro della finestra del visualizzatore dati.
- Selezionate la prima proiezione dall'acquisizione di SRμCT. In Outputrimuovere le selezioni per Use ROI e Scales ON.
- Scegliere la destinazione del file di ricostruzione. Selezionare Sfoglia e creare una nuova cartella denominata Ricognitore. Il formato di file selezionato deve essere BMP(8).
- Controllare la compensazione del disallineamento.
NOTA: Questa stima è spesso vicina alla correzione. Il rendering 3D approssimativo può essere regolato manualmente spostando le frecce su e giù per spostare le immagini sovrapposte in modo che i bordi destro e sinistro si allineino il più vicino possibile. - In Impostazioniscegliere le selezioni desiderate per applicare gli algoritmi Smoothing, Beam Hardening, CS Rotation, Object Larger than FOVe Ring Artifacts .
- Regolare l'istogramma in Output selezionando Auto.
NOTA: l'immagine risultante potrebbe essere fioca. - Selezionare Avvia per iniziare l'elaborazione della ricostruzione.
- Utilizzare la nomenclatura standard per gli indici lacunari canali/osteociti28. Questi possono includere: volume totale di tessuto VOI (TV), volume del canale (Ca.V), numero totale di canali (Ca.N), diametro medio del canale (Ca.Dm), porosità corticale (Ca.V/TV), dato in percentuale, numero totale di lacune (N.Lc) e volume lacunare medio (Lc.V), tra gli altri. Per determinare la densità lacunare per mm3 (N.Lc/BV), il volume osseo (BV) è calcolato come volume totale meno il volume del canale (TV-Ca.V).
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Raccolta di dati microarchitettotechi da immagini ricostruite
- Scaricare e installare l'ultima versione di CTAnalyser presso https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html per l'analisi dei parametri microarchitettonali.
NOTA: la versione gratuita di CTAnalyser è limitata nella funzionalità. Pertanto, si consiglia di acquistare una licenza completa per eseguire analisi più dettagliate. - In Immagine | Proprietà | Modificare le dimensionidei pixel , assicurarsi che la dimensione dei pixel corrisponda a quella del protocollo di imaging μCT applicato.
NOTA: se si modificano immagini in ImageJ o in un programma simile, si noti che al momento del salvataggio, l'intestazione incorporata nel file TIFF verrà modificata e il software di analisi modificherà le dimensioni dei pixel durante l'importazione del set di dati. - Selezionare Elaborazione personalizzata Per creare un elenco attività (vedere Materiali supplementari) per analizzare la microarchitettura ossea dal set di dati di scansione. Un protocollo generale per i parametri di rete lacunari osteociti che utilizzano plugin proprietari di CTAnalyser segue qui:
NOTA: l'elenco delle attività del plug-in funziona bene per i set di dati in cui l'esempio è l'unico soggetto visibile nel FOV. Se lo spazio vuoto circonda il campione, è necessaria l'applicazione di un ROI. In caso contrario, i valori raccolti nell'analisi 3D e nell'analisi dei singoli oggetti verranno ridotti artificialmente.- Ricaricare le immagini per reimpostare e/o regolare eventuali modifiche (ad esempio, dalla modifica in ImageJ o simili) prima di aprire il menu Elaborazione personalizzata nel software di analisi.
- Per ridurre il rumore nelle immagini, applicate un filtro passa-basso gaussiano nello spazio 3D con un kernel rotondo e un raggio di 2-3.
NOTA: Queste impostazioni sono state applicate ai set di dati degli esperimenti SRμCT segnalati attraverso test di tentativi ed errori. L'obiettivo era quello di ottenere ricostruzioni della migliore qualità per i dati. Regola le impostazioni di ricostruzione in base a ogni configurazione sperimentale unica. - Applicare una soglia globale in scala di grigi alle immagini selezionando valori bassi e alti per evidenziare i canali vascolari. Le sezioni ricostruite viste nelle figure 8B e 8D rappresentano una soglia di esempio di 0-155.
NOTA: Analogamente al passaggio 4.2.3.2, le impostazioni di soglia applicate qui sono state scelte tramite tentativi ed errori estesi. La soglia deve essere regolata per ogni set-up sperimentale e per ogni sistema di imaging μCT utilizzato. - Despeckle (denoise) per rimuovere le macchie bianche nello spazio 3D che si trovano all'interno dell'intervallo di dimensioni dei pixel volumetrici (voxel) delle lacune osteociti al fine di isolare solo i canali.
NOTA: Per una scansione SRμCT dell'osso corticale umano presa a 0,9 μm di dimensione in pixel, il limite inferiore per le lacune osteociti è di 13 voxel. - Despeckle per rimuovere eventuali macchie nere nello spazio 2D per rimuovere gli artefatti nei canali. Questi possono essere abbastanza grandi in 2D, quindi rimuovere le funzionalità che sono <15.000 pixel.
- Dilatare i pori nello spazio 3D utilizzando la funzione di funzionamento morfologico con un nucleo rotondo di raggio 2 o 3, a seconda della qualità delle immagini, al fine di isolare eventuali tessuti molli intrappolati nei canali.
- Eseguire una funzione Despeckle aggiuntiva utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 4.2.3.5. al fine di rimuovere i tessuti molli isolati all'interno dei canali.
- Erodere la dilatazione dal passo 4.2.3.6. utilizzando una funzione di funzionamento morfologico usando un kernel rotondo con raggio 2 o 3. Il raggio per questo passaggio deve corrispondere al raggio utilizzato nella procedura 4.2.3.6.
- Eseguire analisi 3D e selezionare i parametri da calcolare per il volume dei canali vascolari. In generale, i valori di base forniranno informazioni sufficienti.
- Salvare le immagini elaborate con Salva bitmap in una sottocartella personalizzata nella directory.
NOTA: Se si crea un'immagine di ricostruzione 3D dalle immagini elaborate utilizzando un programma come Amira / Avizo, Dragonfly, Drishti, ecc., si consiglia di salvare le immagini in bianco e nero (1 bit). - Calcolare il numero di canali vascolari e descriverne le dimensioni, la forma e l'orientamento utilizzando la funzione Analisi singoli oggetti.
- Ripetere i passaggi da 4.2.3.1 a 4.2.3.3. per resettare l'immagine per l'analisi lacunare degli osteociti.
- Rimuovere le macchie bianche nello spazio 3D utilizzando la funzione Despeckle, assicurando che tali artefatti siano più piccoli del limite inferiore delle dimensioni lacunari. Questo passaggio rimuove il rumore dalla scansione che può sembrare pori corticali, preservando al contempo le vere lacune osteocitiche. Per scansioni umane SRμCT di dimensioni di 0,9 μm pixel, questo limite inferiore è di 13 voxel.
- Despeckle ancora una volta per rimuovere le macchie bianche che sono più grandi del limite superiore di dimensione lacunare. Per i set di dati SRμCT umani con le impostazioni elencate nel passaggio 4.2.3.13, questo limite è di 2743 voxel.
- Eseguire analisi 3D per estrarre informazioni microstrutturali relative specificamente alle lacune osteociti.
- Selezionare Salva bitmap per salvare le immagini elaborate per isolare le lacune dell'osteocita.
- Eseguire l'analisi dei singoli oggetti per calcolare il numero di osteociti in 3D all'interno del Volume di interesse (VOI) selezionato.
NOTA: Una volta che l'elenco delle attività è stato stabilito e testato, CTAnalyser ha una funzione di batch manager (BatMan) che può essere utilizzata per accelerare l'estrazione dei dati e garantire un'elaborazione uniforme delle immagini. Elenco attività con impostazioni di esempio per la procedura 4.2.3. può essere trovato nei materiali supplementari.
- Scaricare e installare l'ultima versione di CTAnalyser presso https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html per l'analisi dei parametri microarchitettonali.
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Representative Results
Il metodo descritto di campionamento di base si è rivelato altamente efficace ed efficiente. I campioni di coring che utilizzano questo protocollo hanno permesso l'approvvigionamento di campioni di dimensioni costanti >300 per esperimenti sulla beamline CLS BMIT-BM2, con un FOV di ~ 2 mm a 1,49 μm di dimensione voxel. Per convalidare la consistenza del diametro del nucleo, sono state effettuate tre misurazioni lungo la lunghezza (superiore, centrale, inferiore) di un sottoinsieme di nuclei femorali anteriori umani (n=69). Il diametro medio dei nuclei era di 1,96 ± 0,11 mm, e il diradamento medio lungo la lunghezza del nocciolo è stato di 0,06 ± 0,06 mm/mm Per sottolineare l'applicabilità ad altri materiali compositi duri, abbiamo tentato questo metodo su campioni di dolomite (n=32) con un diametro medio di 1,06 ± 0,02 mm. Il diradamento lungo la lunghezza del campione di nocciolo è stato registrato come 0,01 ± 0,005 mm/mm. Le cifre rappresentative che confrontano il flusso di lavoro di elaborazione delle immagini di un campione cored e di un campione acquistato utilizzando uno strumento rotativo (ad esempio, Dremel), come descritto al passaggio 4.2.3, possono essere visualizzate nella figura 7. Il taglio del campione utilizzando il comune strumento rotativo presentava un numero maggiore di canali (Ca.N) e lacune (Lc.N), e una diminuzione del diametro medio del canale (Ca.Dm), del volume del canale (Ca.V) e della porosità corticale (Ca.V/TV) rispetto al campione cored. Mentre alcune di queste differenze possono essere dovute alla variazione microstrutturale ossea tra individui, il maggior numero di canali e lacune estratte dal set di dati degli utensili rotanti è stato probabilmente aumentato artificialmente a causa di artefatti di scansione erumore (Figura 7). I dati sulla porosità raccolti dal passaggio 4.2.3.9 per ciascun campione si trovano nella tabella 1. Vale la pena notare che sebbene il protocollo di coring diminuisca gli artefatti osservati nelle scansioni SRμCT, le figure di qualità inferiore cariche di artefatti degli esperimenti di blocchi ossei rettilinei (Figura 7A) rappresentano un problema sfaccettato. Alcuni artefatti (ad esempio, segnali di contrasto di fase) potrebbero essere stati causati da una struttura di sincrotrone o da problemi specifici della linea di fascio. I parametri di scansione sia per le serie rappresentative di esperimenti che per le cifre associate(figure 7A, 7B)sono disponibili nei materiali supplementari (tabelle S1, S2).
Le immagini micro-CT del sincrotrone raccolte da campioni cored hanno soppresso correttamente gli artefatti della scansione, come dimostrato sopra, inclusi gli artefatti della striscia. La successiva elaborazione delle immagini ha confermato il potenziale della tecnica per migliorare la visualizzazione della microarchitettura ossea corticale. Ad esempio, sono state osservate differenze di mineralizzazione, una migliore delimitazione dei confini osteonali e una visualizzazione coerente dei tessuti molli all'interno dei canali vascolari(figure 8C, 8D). Quest'ultimo è fondamentale per l'elaborazione delle immagini in quanto la visualizzazione parziale dei tessuti molli all'interno dei canali può comportare calcoli imprecisi della porosità percentuale e dello spessore dei pori, poiché i pori non sono completamente riempiti. Anche i confini delle lacune osteociti sono stati migliorati a causa della diminuzione della birifrangenza, consentendo la quantificazione dei parametri di forma. I potenziali vantaggi della tecnica di coring descritta includono facilità di centraggio del campione nel FOV, requisiti analitici ridotti e visualizzazione coerente dei tessuti molli all'interno dei canali vascolari.
Procedure simili sono state utilizzate con successo per il nucleo di singoli cristalli di ortopirosseno18, magnesite policcristallina19 e altri materialigeologici 15,16,17 per esperimenti di deformazione delle rocce ad alta pressione. Questi esperimenti richiedono nuclei con orientamenti specifici relativi agli assi cristallografici in singoli cristalli18 o cristalli allineati nelle rocce policristalline19 al fine di determinare i punti di forza specifici dell'orientamento. Gli approcci sopra descritti sono stati utilizzati per creare prima lastre orientate e, successivamente, raccogliere più nuclei cilindrici uniformi per una serie di esperimenti di deformazione. Questi metodi possono essere utilizzati per raccogliere nuclei di qualsiasi materiale duro, come ossa, ceramiche o occhiali. Ad esempio, la metodologia di cui sopra potrebbe essere applicata dagli antropologi biologici per valutare i nuclei di regioni specifiche all'interno dell'osso corticale e i loro assi biomeccanici associati (ad esempio, tensione /compressione).
Figura 1. VOI cilindrico di un femore anteriore sinistro dell'albero medio umano. Vengono visualizzati una singola fetta ricostruita SRμCT di un intero nucleo da un femore anteriore sinistro dell'albero medio umano(femminadi 21 anni) ( A ) e rendering 3D di un VOI cilindrico da viste superiori (B) e anteriori (C). Le proiezioni sono state prese a 0,9 μm, con canali vascolari evidenziati in rosso e lacune osteocite in grigio. Le barre di scala denotano 0,25 mm (A) e 0,02 mm (B,C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Un campione femorale ad albero medio (spessore di 5 mm) montato su un vetrino da microscopio in vetro con epossidico termico (vedi Tabella dei materiali) e fissato a un mandrino scorrevole in vetro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Mandrino scorrevole in vetro con campione montato fissato al braccio girevole di una sega seghettatrice a bassa velocità (vedi Tabella dei materiali) prima della sessatura. La posizione laterale del braccio girevole rispetto alla lama della sega e la velocità di sessatura (RPM) vengono visualizzate rispettivamente sulle file superiore e inferiore del display LCD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Una sezione femorale da 5 mm montata su uno stagno di alluminio e fissata a un tavolo della pressa per fresatura XY utilizzando morsetti di fissaggio in preparazione per la coring. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. La pressa per fresatura utilizzata nel protocollo ideato (A). La freccia identifica il limitatore di profondità, che impedisce alla punta del trapano di penetrare in profondità nel campione o attraverso il fondo dello stagno (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Una sezione ossea femorale da 5 mm che segue l'approvvigionamento del nucleo dall'aspetto anteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Singole fette ricostruite SRμCT dell'aspetto anteriore del femore sinistro da due individui. Il campione (A) è stato sessato utilizzando uno strumento rotativo comune e (B) è stato acquistato utilizzando il metodo di coring qui descritto. Ogni fetta viene confrontata con la controparte segmentata (C e D). Si noti la facilità di isolamento della porosità corticale nel campione cored (D) rispetto al campione raccolto con l'utensile rotante (C). Ciò è ulteriormente evidenziato nei rendering 3D dei canali vascolari di ciascun campione (E e F). Il rumore intorno alla periferia di B è evidente e il campione lascia il FOV, che si traducono entrambi in maggiori sfide durante l'elaborazione delle immagini. La barra di scala nel pannello(D)indica 250 μm per i pannelli (A-D). Le barre di scala nei pannelli (E e F) denotano rispettivamente 700 e 600 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Un ROI rappresentativo da un campione acquistato con uno strumento rotativo (A-C) e uno cored utilizzando il metodo qui presentato (D-F). I pannelli( A) e (D) rappresentano il ROI designato dalle scansioni SRμCT. I pannelli (B) e (E) rappresentano lo stadio di lavorazione utilizzato per isolare ed estrarre i parametri del canale vascolare. In alto a destra del pannello (B) ci sono oggetti estranei (frecce) che sono stati classificati come canali vascolari dal software di elaborazione delle immagini. I pannelli (C) e (F) rappresentano la fase di lavorazione utilizzata per isolare ed estrarre le lacune. Le barre di scala denotano 0,1 mm per tutti i pannelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Volume tessuto (TV) | Volume canale (Ca.V) | Superficie del canale (Ca.S) | Porosità Corticale (Ca.V/TV) | Volume da superficie del canale a tessuto (Ca.S/TV) | Diametro medio canale (Ca.Dm) | Separazione media canale (Ca.Sp) | No. dei Canali (Ca.N) | No. di Lacunae (Lc.N) | Densità pori (Pori/TV) | |
| Unità | mm³ | mm³ | Omp | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | pori/μm³ |
| Taglio rotativo | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Questo metodo) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
La tabella 1. Risultati rappresentativi per la fase 4.2.3.9 dell'utensile rotante e dei provini cored visualizzati nella figura 8. Si noti la diminuzione di Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, numero di pori e densità dei pori per il campione di taglio rotante, nonché l'aumento del numero di canali vascolari e lacune. Gli artefatti di scansione parzialmente indotti dal campione tagliato in modo non uniforme hanno probabilmente contribuito ad un aumento artificiale delle lacune e dei pori corticali.
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Discussion
Non esiste un protocollo completo e standardizzato per l'acquisto di campioni di nucleo osseo corticale uniforme e cilindrico per l'imaging SRμCT ad alta risoluzione con configurazioni FOV limitate. Il protocollo qui dettagliato riempie quel vuoto fornendo un tutorial completo su come procurarsi campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti per l'imaging SRμCT e la successiva visualizzazione accurata e l'estrazione di dati microarchitettotechi. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo fornisce un metodo più standardizzato e affidabile per l'approvvigionamento di nuclei ossei corticali rispetto alle precedenti descrizioni di sezionare blocchi ossei rettilinei di dimensioni arbitrarie. Pertanto, i ricercatori che si sono affidati a strumenti rotativi portatili (ad esempio, Dremel) per rimuovere blocchi di osso di dimensioni irregolari hanno probabilmente sperimentato tempi di set-up del campione molto più lunghi durante l'imaging e maggiori errori nella soglia e nell'estrazione dei pori corticali durante l'analisi. Questa discrepanza evidenzia la necessità e il significato di questo protocollo standardizzato per quanto riguarda la preparazione del campione osseo, la successiva visualizzazione e analisi e l'interpretazione dei risultati.
La procedura qui delineata può essere ulteriormente adattata dai ricercatori in campi correlati che comunemente valutano il tessuto osseo come antropologi biologici e archeologi. Nessun esemplare osseo diagenetico né archeologico/storico, tuttavia, è stato cored per il protocollo di ricerca descritto. La diagenesi, in geologia, si riferisce alle alterazioni di un materiale (ad esempio, l'osso) dopo la deposizione e può comprendere cambiamenti causati da mezzi fisici, chimici o biologici29,30. Le acque sotterranee, i funghi e altre infiltrazioni microbiche possono agire tutti come agenti diagenetici e alterare la micromorfologia del tessutoosseo 31. Tali campioni possono richiedere ulteriori fasi procedurali prima del coring, come l'incorporazione nel metacrilato metile (MMA) o in una resina epossidica in due parti. Incorporare i blocchi femorali non era necessario per gli esperimenti descritti a causa della natura densa dell'osso corticale femorale, e del fatto che gli esemplari cadaverici furono imbalsamiti poco dopo la morte. Se si valutano elementi scheletrici fragili e le loro trabecole (ad esempio, costole), tuttavia, si consiglia di incorporare l'intero blocco osseo prima di coring.
Tutti i tessuti ossei valutati in questo studio sono stati imbalsamiati mentre erano freschi. Gli autori non hanno avuto accesso alla combinazione specifica di sostanze chimiche utilizzate durante il processo di imbalsamazione, sebbene le sostanze chimiche di conservazione includano comunemente formaldeide, etanolo, fenolo, glicole etilenico e glutaraldeide. I dati antropologici forensi che documentano i cambiamenti nella microstruttura delle ossa sature di formaldeide sono limitati, sebbene Freidlander32 abbia dimostrato che la fissazione della formaldeide non altera la morfologia di alcune caratteristiche tra cui i canali haversiani e gli osteoni secondari. La saturazione della formaldeide, tuttavia, ha effetti documentati su alcune proprietà meccaniche e caratteristiche di frattura dell'osso non umano come la resistenza all'impatto e latenacità alla frattura 33,34.
Abbiamo segnalato un metodo per coring campioni ossei corticali prima dell'imaging con sistemi a raggi X ad alta risoluzione (SRμCT). Questo metodo è conveniente, a causa del fatto che materiali e attrezzature possono essere provenienti da negozi di ferramenta locali, efficienti e garantiscono una dimensione uniforme del campione tra i campioni. Speriamo che i nostri suggerimenti riducano le richieste relative a come i campioni dovrebbero essere acquistati, cored e analizzati per SRμCT, poiché la letteratura esistente rimane scarsa e manca di dettagli critici per quanto riguarda la preparazione e l'analisi successiva. Il nostro obiettivo primario è motivare i ricercatori ad applicare questo protocollo di coring come procedura standardizzata per la ricerca sull'imaging osseo ad alta risoluzione. Speriamo inoltre che le suddette difficoltà che abbiamo incontrato nello sviluppo di questa tecnica alleviano le domande comuni e forniscano indicazioni per la risoluzione dei problemi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca descritta in questo documento è stata eseguita presso la struttura BMIT presso la Canadian Light Source, che è supportata dal Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dall'Università del Saskatchewan, dal Governo del Saskatchewan, dalla Western Economic Diversification Canada, dal National Research Council Canada e dal Canadian Institutes of Health Research. Gli autori ringraziano gli scienziati beamline presso la Canadian Light Source, in particolare Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu per l'assistenza nella configurazione e risoluzione dei problemi dei sistemi di microscopio SkyScan SRμCT e white beam. Desideriamo anche ringraziare Beth Dalzell dell'University of Toledo College of Medicine and Life Sciences e il Dr. Jeffrey Wenstrup della Northeast Ohio Medical University per l'accesso a campioni cadaverici per questo studio. JM Andronowski è supportato attraverso fondi di ricerca di start-up forniti dall'Università di Akron e da una sovvenzione del National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes (2018-DU-BX-0188). RA Davis è supportato da un assistente di laurea fornito dall'Università di Akron. Le attrezzature e le forniture utilizzate per il coring e la segatura sono state acquistate con fondi di start-up forniti dall'Università di Akron e la sovvenzione NSF EAR-1624242 a CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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