Summary
Vi använde ett geologiskt (coring) provtagning protokoll för att skaffa när ben exemplar av enhetlig storlek för SRμCT experiment från den främre aspekten av mänskliga femora. Denna metod är minimalt destruktiv, effektiv, resulterar i cylindriska exemplar som minimerar bildartefakter från oregelbundna provformer och förbättrar mikroarchitectural visualisering och analys.
Abstract
Ben är en dynamisk och mekaniskt aktiv vävnad som förändras i struktur under människans livslängd. Produkterna från benrenoveringsprocessen har studerats väsentligt med hjälp av traditionella tvådimensionella tekniker. De senaste framstegen inom röntgenavbildningsteknik via stationär mikrodatortomografi (μCT) och synkrotronstrålning mikrodatortomografi (SRμCT) har gjort det möjligt att förvärva högupplösta tredimensionella (3D) skanningar av ett större synfält (FOV) än andra 3D-bildtekniker (t.ex. SEM) som ger en mer komplett bild av mikroskopiska strukturer inom humant kortben. Provet bör dock vara noggrant centrerat inom FOV för att begränsa utseendet på streak artefakter som är kända för att påverka dataanalys. Tidigare studier har rapporterat upphandling av oregelbundet formade rätlinjiga benblock som resulterar i bild artefakter på grund av ojämna kanter eller bild trunkering. Vi har tillämpat ett geologiskt provtagningsprotokoll (coring) för att skaffa konsekvent stora när benkärnprover för SRμCT experiment från den främre aspekten av mänskliga femora. Denna coring metod är effektiv och minimalt destruktiv för vävnad. Det skapar enhetliga cylindriska prover som minskar avbildningsartefakter genom att vara isometriska under rotation och ge en enhetlig banlängd för röntgenstrålar under hela skanningen. Bildbehandling av röntgentomografiska data av cored och oregelbundet formade prover bekräftar teknikens potential att förbättra visualisering och analys av när ben microarchitecture. Ett mål med detta protokoll är att leverera en tillförlitlig och repeterbar metod för extraktion av när benkärnor som kan anpassas för olika typer av högupplösta benavbildningsexperiment. Ett övergripande mål med arbetet är att skapa en standardiserad kortikal benanskaffning för SRμCT som är prisvärd, konsekvent och enkel. Detta förfarande kan vidare anpassas av forskare inom relaterade områden som vanligtvis utvärderar hårda sammansatta material som i biologisk antropologi, geovetenskap eller materialvetenskap.
Introduction
Med de senaste framstegen inom bildteknik är det nu möjligt att förvärva röntgenbilder med mycket hög upplösning. Stationära mikro-CT-system (μCT) är den aktuella standarden för avbildning av annullerande ben på grund av deras icke-destruktiva natur1. Vid avbildning av mikrostrukturella egenskaper hos närben har dock μCT-användningen varit mer begränsad. På grund av upplösningsbegränsningar kan stationära system inte uppnå den upplösning som krävs för att avbilda mikrostructurala funktioner som är mindre än när porer, såsom osteocyt-luckor. För denna applikation är SRμCT idealisk på grund av den högre upplösningen av dessa system1. Till exempel har experiment vid Canadian Light Source (CLS) på BMIT-strållinjerna (BioMedical Imaging and Therapy)2 producerat bilder med voxels så små som 0,9 μm. Tidigare studier1,3,4,5 har använt denna upplösning för att förvärva projektioner och efterföljande tredimensionella (3D) renderingar från närbensprover från mänskliga långa ben ( Figur1) för att kvantifiera osteocyt lacunar densitet4,6,7,8,9 och variation i lacunar form och storlek3 över människans livslängd och mellan könen. Ytterligare studier har visat förekomsten av osteonbanding hos människor10, ett fenomen som tidigare erkänts vara associerat med endast icke-mänskliga däggdjur i den rättsmedicinska antropologiska litteraturen.
För att uppnå exceptionell upplösning måste röntgenstrålen vara fint fokuserad inom synfältet (FOV), som ofta begränsar den maximala provstorleken till några millimeter i diameter. För närvarande har det inte funnits några omfattande, standardiserade förfaranden som beskrivs i litteraturen som beskriver benprovsupphandling som uppfyller dessa begränsningar. Centreringsprover i FOV är avgörande för att säkerställa att 1) provet förblir centrerat när det roterar 180° under avbildning, och 2) skanningsartefakter är begränsade eftersom det inte finns någon bild trunkering. Med andra ord stör inga delar av provet utanför FOV strålen som kommer in i dess brännpunkt inuti FOV. Om detta inträffar berövas rekonstruktionsalgoritmen några av de dämpningsdata som behövs för en helt korrekt rekonstruktion. Det är vidare värt att notera att 360° (full rotation) skanningar minimerar effekterna av strålhärdning men ökar artefakter som orsakas av feljustering och provrörelse under avbildning. Således, medan en 360 ° skanning vanligtvis kommer att generera renare data, fördubblas bildtiden och därför måste en kompromiss mellan experimentell kostnad och datakvalitet åtgärdas.
En viktig och ofta förbisedd aspekt av ben imaging experiment är den exakta och reproducerbara prov förberedelse teknik som utförs före skanning. Studier som införlivar SRμCT-metoder i sina experiment nämner kortfattat deras provtagningsprotokoll, men författarna ger föga eller ingen detalj om den särskilda metod som används för att samla in deras exemplar. Många sådana studier nämner skärning av rätlinlinja benblock av godtyckliga dimensioner, men ger i allmänhet ingen ytterligare information om verktygen eller inbäddningsmaterial somanvänds 3,4,10,11,12,13,14. Vissa forskare använder ofta handhållna roterande verktyg (t.ex. Dremel) för att ta bort rätlinjiga benblock från en region av intresse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Den här metoden resulterar i exempel av icke-uniformt storlek som kan vara större än FOV, vilket ökar sannolikheten för skanningsartefakter och bild trunkering. Sådana exemplar kräver ofta ytterligare raffinering med hjälp av en precisionsdiamantskiva (t.ex. Buehler Isomet). Att anskaffa prover med konsekventa dimensioner (till två hundradelar/mm) är avgörande för att säkerställa att de förvärvade datamängderna är av högsta kvalitet och att de efterföljande resultaten kan replikeras.
Den begränsade rapporteringen av urvalsanskaffningsmetoder lägger till ett extra skikt av svårigheter när man försöker använda och/eller validera metoder som utförts i en tidigare studie. För närvarande måste forskare kontakta författare direkt för mer information om sina provtagningsförfaranden. Protokollet som beskrivs här ger biomedicinska forskare en grundligt dokumenterad, reproducerbar och kostnadseffektiv provtagningsteknik. Det primära syftet med denna artikel är att tillhandahålla en omfattande handledning om hur man införskaffar konsekvent storlek när benkärnprover med hjälp av en kvarnborrpress och diamantkoring bit för korrekt visualisering och extraktion av mikroarchitectural data. Denna metod modifieras från procedurer som används för att rutinmässigt samla enhetliga cylindrar med liten diameter (1-5 mm) från block av hårda material i högtrycksstenmekanik15,16,17,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla exemplar kom från balsamerade kadaverdonatorer vid University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences och Northeast Ohio Medical University (NEOMED), med informerat samtycke från givaren själva eller donatorns anhöriga. University of Akron Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) ansåg att dessa exemplar var undantagna från fullständig IRB-granskning eftersom de inte upphandlades från levande individer. Demografisk information inklusive ålder, kön och dödsorsak fanns tillgänglig för alla givare. De utvalda individerna hade inte dokumenterade ben-påverkande villkor eller exponering för behandlingsregimer som kan ha påverkat ben ombyggnad vid tidpunkten för dödsfallet. När ben prover erhölls från femora av cadaveric moderna män och kvinnor med åldrar från 19 till 101 år (medelvärde = 73,9 år). Femorala midshaft har studerats omfattande inklusive undersökningar av variation i när porositet20,21,22,23,24 och materialtäthet avbenvävnad 25,26,27, och har därmed blivit en vanlig plats för mikrostrukturella analyser.
1. Vävnadsupphandling och maceration
- Använd en oscillerande såg utrustad med ett doppskärande hårdmetallblad (för kompositmaterial) för att skaffa ~ 7,5 cm benblock från mitten av diafyserna i vänster femora.
- Blötlägg lårbensblock i en ugnssäker glasform fylld med ett pulveriserat proteasenzym och kranvattenlösning i 1 timme i en inkubator inställd på 45 °C.
- Efter inkubation, ta försiktigt bort eventuella återstående mjuka vävnader och periosteum med trubbig dissekering eller tandverktyg.
OBS: Undvik användning av vassa verktyg (t.ex. skalpell) för att avlägsna mjuka vävnader. Sådana instrument kan orsaka skador på benet som kan detekteras vid μCT-skanningar, vilket påverkar provexemplars bevarande och skanningsdatakvalitet. - Ta bort skräp eller ocklusioner i medullary håligheten genom att placera benblock i en ultraljudsrengöringsmedel i 5-10 minuter med 20:1 delar kranvatten till rengöringslösning (se Materialförteckning)eller använda en handhållen vattenflosser (t.ex. Waterpik).
- Sänk ner benblocket i en provkopp och fyll med 70% etanol. Låt benet suga i minst 24 timmar för att ta bort lipider.
OBS: Xylenes kan också användas för att ta bort lipider. Förlängd blötläggning i xylener kan dock göra benet sprött eller kritigt eftersom det är en emulgeringsmedel. - Efter 24 timmar, ta bort benblock från etanol och låt lufttorka vid omgivningstemperatur i 24-48 timmar.
Protokollet kan pausas här.
2. Vävnadssektionering
- Placera en 75 x 25 mm glasmikroskopsrutschbana på en värmeplatta inställd på 140 °C. Smält en generös mängd termiskt epoxiharts (se Materialförteckningen)i mitten av diabilden.
- Vid beredning av ytterligare tunna sektioner för mikroskopi (<50 μm) kan benblocket behöva bäddas in i en tvådelad epoxi för att bevara trabeculae. Vid genomförandet av detta protokoll för ömtåliga exemplar (t.ex. diagenetiskt ben eller mycket trabekulerade exemplar) är det nödvändigt att bädda in exemplar i en epoxi.
OBS: Benprover som används i detta protokoll hämtades från balsamerade kadaver exemplar. Om färska prover samlas in vid obduktionen eller från ett kirurgiskt fall för att undersöka mjukvävnadsstrukturer (t.ex. vaskulatur) via SRμCT kan impregnering med epoxi orsaka skador på sådana vävnader. I dessa fall rekommenderas ett alternativt lim eller monteringsmedium (t.ex. dubbelsidig tejp, modelleringslera).
- Vid beredning av ytterligare tunna sektioner för mikroskopi (<50 μm) kan benblocket behöva bäddas in i en tvådelad epoxi för att bevara trabeculae. Vid genomförandet av detta protokoll för ömtåliga exemplar (t.ex. diagenetiskt ben eller mycket trabekulerade exemplar) är det nödvändigt att bädda in exemplar i en epoxi.
- Tryck in den underlägsna aspekten av benblocket i det termiska epoxihartset på mikroskopet, med längden på benet vinkelrätt mot bilden. Flytta provet fram och tillbaka för att täcka undersidan av benet och säkerställa säker vidhäftning till bilden.
- Låt det monterade provet vila på värmeplattan i ~5 min så att termisk epoxi kan veka i porer och/eller sprickor.
OBS: Epoxiet på bilden ska vara fritt från bubblor för bästa vidhäftning. Om du vill ta bort bubblor flyttar du exemplet fram och tillbaka i bilden. Bubblor bildas ofta på grund av vatten och/eller etanol som fastnat i benet och som läcker ut och avdunstar. - Ta bort bilden med det monterade provet från värmeplattan med trubbiga tång och låt svalna vid rumstemperatur i ~ 10 minuter. Ta bort epoxi från kanten av bilden med ett rakblad för att säkerställa att chucken greppar bilden på ett tillfredsställande sätt.
- Fäst diabilden med det påhäftade provet på en glasschuck och montera chucken på den svängbara armen på en långsam sektionssåg (se Materialförteckning, bild 2).
OBS: Medan en Buehler IsoMet-såg användes i detta protokoll, finns andra precisionssektionssågar tillgängliga som kan användas i stället för IsoMet (t.ex. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Justera svängarmen med hjälp av positioneringsratten för att säkerställa att klingkontakterna och transects provet. Placera provet så att ett tvärsnitt av benet skärs vinkelrätt mot dess längd.
- Lägg till vikter på den bortre sidan av skärarmen för att motverka armens vikt.
OBS: Om otillräcklig motvikt används kan provet bäras ner på bladet och leda till att bladet spricker. - Tillsätt skärvätska (20:1 delar vatten till skärvätska) i sågens vätskebehållare.
- Fäst diamantskivans blad ordentligt och se till att vätskenivån sänker skärdelen av bladet. Ställ in hastigheten på 200 varv/min och sänk långsamt provet på bladet (bild 3).
- Se till att bladet och chucken inte vibrerar och/eller studsar. Om överdriven rörelse noteras, stoppa omedelbart sågen och dra åt bladet och/eller chuckarmenheten innan du återupptar sågningen. Lägg till ytterligare motvikter om chucken aggressivt rör sig upp och ner. Överdriven rörelse inklusive synlig rörelse från sida till sida kan orsaka att bladet spricker.
- Den första tjocka delen är en "avfallsskärning" för att ge en väldefinierad yta parallellt med varje ytterligare skärning. Efter det första avfallsskuret, lyft den svängbara armen och flytta chucken mot bladet 5 mm med hjälp av positioneringsratten. Ytterligare tjocka sektioner (~ 1 mm) för mikroskopi kan vidare samlas in med denna metod.
OBS: För att spara värdefull vävnad kan avfallsskärningen utelämnas. Vid sektionering av ett prov med en ojämn kant är det dock viktigt att provexemplarets topp är tangentiellt uppradad mot kanten på coringborren.- Var noga med att ta hänsyn till bladets kerf vid sektionering. För att till exempel få en 5 mm sektion från ett blad som har en kerf på 0,5 mm, flytta provet och chucken 5,5 mm mot bladet.
- När sektionering är klar, placera glasrutschbanan med det monterade provet på en värmeplatta för att smälta den termiska epoxien. Detta möjliggör snabb borttagning av benblock från bilden.
Protokollet kan pausas här.
3. Provkorring
- Montera 5 mm bensektioner på botten av en grund aluminiumform (~8 cm i diameter) med hjälp av den termiska epoxibindningstekniken enligt beskrivningen i steg 2.2-2.4.
- Placera tennet på ett XY-maskinbord på kvarnborrpressen (se Materialförteckningen)och dra åt fixeringsklämmorna för hand (figur 4).
- Sätt in 2 mm ihålig axelsjuvelerares diamantspetsade rörborr (se Materialförteckningen)i kvarnborrchucken. Justera djupbegränsaren för att förhindra att du går igenom burken (bild 5).
- Justera den centrala främre aspekten av benprovet under borrkrona samtidigt som du undviker nära kontakt med antingen periosteum, endosteum eller mycket trabecularized områden.
OBS: Automatiserat urval av mid-anterior femorala cortices är inte genomförbart eftersom när tjocklek varierar mellan individer, särskilt med ökande ålder. - Fyll burken med destillerat vatten för att helt täcka provet. Detta förhindrar värmeuppbyggnad, förbränning av provet och/eller skador på borrkrona under coring.
OBS: För att bedöma risken för värmeskador orsakade av coring användes en infraröd termometer för att uppnå temperaturavläsningar från det destillerade vattnet när coringbiten först trängde in i benens yta. Temperaturen varierade med 1 °C, från 22,9 – 23,9 °C bland de tio prover som kärnades för denna provning. Således hävdar vi att värmeinducerad skada är försumbar. - För de första fallen av kontakt mellan kärnbiten och benet, applicera försiktigt tryck för att bära en ring på benets överlägsna yta. Detta förhindrar avböjning av borrkrona i början av coringprocessen och säkerställer korrekt placering av borrkrona.
- Lyft borrkron in och ut ur provet under coring samtidigt som borrspetsen under vattenytan behållits. Fortsätt denna teknik med några sekunders mellanrum för att spola ut instängt bendamm och se till att skräp inte ocklusudera borrkrona.
OBS: Om kärnan bildar en konisk form beror det sannolikt på 1) vilket ger otillräcklig tid att spola bendamm från coringbiten, och 2) coring sker för snabbt. Ökad hastighet kan bryta av stora bitar från provet och pulvrisera den överlägsna aspekten. - När coring är klar kan den resulterande benkärnan fastna i den ihåliga borrkronan (figur 6). Använd ett par finspetsade tångar eller en liten insexnyckel för att lossa kärnan från borret (bild 2).
- Förvara det korerade provet i ett märkt mikrocentrifugrör på en sval och torr plats fram till avbildningen.
4. Bildbehandlingsrutiner för utvärdering av benmikroarchitektiva parametrar från kortikala benkärnor
- Rekonstruktion av μCT-bilder
- Ladda ner och installera den senaste NRecon-versionen vid https://www.bruker.com/products/microtomography.html för rekonstruktion av SRμCT-projektionsbilderna.
- Välj NRecon-genvägen på skrivbordet så visas den associerade GPUReconServer.
- Öppna önskad datauppsättning i popup-fönstret. Om fönstret inte visas markerar du mappikonen i det övre vänstra hörnet i datavisningsfönstret.
- Välj den första prognosen från förvärvet av SRμCT. Ta bortvalen för använd ROI och Skalor PÅ under Utdata.
- Välj rekonstruktionsfilens mål. Välj Bläddra och skapa en ny mapp med namnet Recon. Det valda filformatet ska vara BMP(8).
- Kontrollera ersättning för feljustering.
OBS: Denna uppskattning är ofta nära att korrigeras. Den grova 3D-renderingen kan justeras manuellt genom att flytta pilarna uppåt och nedåt för att flytta de överlappande bilderna så att höger och vänster kanter justeras så nära som möjligt. - Under Inställningarväljer du önskade val för att tillämpa utjämnings-, strålhärdnings-, CS-rotations-, objekt-större än FOV- och Ring artifacts-algoritmer.
- Justera histogrammet under Utdata genom att välja Auto.
Obs: Den resulterande bilden kan vara svag. - Välj Börja bearbeta rekonstruktionen.
- Använd standard nomenklatur för kanal/osteocyt lacunar index28. Dessa kan inkludera: total VOI-vävnadsvolym (TV), kanalvolym (Ca.V), totalt antal kanaler (Ca.N), genomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm), kortikal porositet (Ca.V/TV), uttryckt i procent, totalt antal luckor (N.Lc) och genomsnittlig lakunär volym (Lc.V), bland andra. För att bestämma lacunar densitet per mm3 (N.Lc/BV) beräknas benvolymen (BV) som total volym minus kanalvolym (TV-Ca.V).
Protokollet kan pausas här.
- Insamling av mikroaritektiva data från rekonstruerade bilder
- Ladda ner och installera den senaste versionen av CTAnalyser på https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html för analys av mikroarchitectural parametrar.
OBS: Gratisversionen av CTAnalyser är begränsad i funktionalitet. Därför rekommenderas att köpa en fullständig licens för att utföra mer detaljerade analyser. - Under Bild | Egenskaper | Ändra pixelstorlek, se till att pixelstorleken matchar det tillämpade μCT-avbildningsprotokollet.
Obs: Om du redigerar bilder i ImageJ eller ett liknande program, observera att när du sparar kommer huvudet som är inbäddat i TIFF-filen att ändras och analysprogramvaran kommer att ändra pixelstorleken när datauppsättningen importeras. - Välj Anpassad bearbetning för att skapa en uppgiftslista (se Kompletterande material) för att analysera benmikroarchitecturen från skanningsdatauppsättningen. Ett allmänt protokoll för osteocyt lacunar nätverksparametrar med plugins proprietära till CTAnalyser följer här:
Listan över plugin-uppgifter fungerar bra för datamängder där exemplet är det enda ämne som visas i FOV. Om det tomma utrymmet omger provet krävs användning av en ROI. Annars kommer de värden som samlas in i 3D-analys och individuell objektanalys att minskas artificiellt.- Ladda om bilderna för att återställa och/eller justera eventuella ändringar (t.ex. från redigering i ImageJ eller liknande) innan menyn Anpassad bearbetning öppnas i analysprogramvaran.
- För att minska bruset i bilderna, applicera ett gaussiskt lågpassfilter i 3D-utrymme med en rund kärna och en radie på 2-3.
OBS: Dessa inställningar tillämpades på datamängder från de rapporterade SRμCT-experimenten genom försöks- och feltestning. Målet var att få de bästa kvalitetsrekonstruktionerna för data. Justera rekonstruktionsinställningarna så att de passar varje unik experimentell installation. - Tillämpa en global gråskaletröskel på bilderna genom att välja låga och höga värden för att markera kärlkanaler. De rekonstruerade skivorna som ses i figurerna 8B och 8D visar en exempeltröskel på 0-155.
OBS: I likhet med steg 4.2.3.2 valdes de tröskelvärden som tillämpades här genom omfattande försök och fel. Tröskelvärdet bör justeras för varje experimentellt bildsystem och μCT-bildsystem som används. - Despeckle (denoise) för att ta bort vita fläckar i 3D-utrymme som ligger inom det volymetriska pixel (voxel) storleksintervallet av osteocyt lakunae för att isolera kanaler endast.
OBS: För en SRμCT-skanning av humant kortikalt ben som tas vid 0,9 μm pixelstorlek är den nedre gränsen för osteocytlakunae 13 voxels. - Despeckle för att ta bort svarta fläckar i 2D-utrymme för att ta bort artefakter i kanalerna. Dessa kan vara ganska stora i 2D, vilket tar bort funktioner som är <15 000 pixlar.
- Vidga porerna i 3D-rymden med hjälp av den morfologiska funktionsfunktionen med en rund kärna på 2 eller 3 radie, beroende på bildernas kvalitet, för att isolera eventuella mjuka vävnader som är fångade i kanaler.
- Utför ytterligare en Despeckle-funktion med samma inställningar som steg 4.2.3.5. för att avlägsna isolerade mjukvävnader i kanaler.
- Erodera dilatationen från steg 4.2.3.6. med hjälp av en morfologisk funktion med hjälp av en rund kärna med antingen 2 eller 3 radie. Radien för det här steget skall överens följa den radie som används i procedur 4.2.3.6.
- Kör 3D-analys och välj vilka parametrar som ska beräknas för volymen av kärlkanaler. I allmänhet kommer de grundläggande värdena att ge tillräcklig information.
- Spara de bearbetade bilderna med Spara bitmappar i en anpassad undermapp i katalogen.
OBS: Om du skapar en 3D-rekonstruktionsbild från de bearbetade bilderna med ett program som Amira /Avizo, Dragonfly, Drishti, etc., rekommenderas att bilderna sparas som monokrom (1 bit). - Beräkna antalet kärlkanaler och beskriv deras storlek, form och orientering med hjälp av funktionen Individuell objektanalys.
- Upprepa steg 4.2.3.1 – 4.2.3.3. för att återställa bilden för osteocyt lacunar analys.
- Ta bort vita fläckar i 3D-utrymme med hjälp av Funktionen Despeckle, vilket säkerställer att sådana artefakter är mindre än den nedre gränsen för laktär storlek. Detta steg tar bort brus från skanningen som kan tyckas vara när porer, samtidigt bevara sant osteocyt luckor. För mänskliga SRμCT-skanningar på 0,9 μm pixelstorlek är denna nedre gräns 13 voxels.
- Despeckle ännu en gång för att ta bort vita fläckar som är större än den övre gränsen för lacunar storlek. För mänskliga SRμCT-datamängder med de inställningar som anges i steg 4.2.3.13 är denna gräns 2743 voxels.
- Utför 3D-analys för att extrahera mikrostructural information om osteocyt luckor specifikt.
- Välj Spara bitmappar för att spara de bearbetade bilderna för att isolera osteocyt-luckan.
- Utför individuell objektanalys för att beräkna antalet osteocyter i 3D inom den valda intressevolymen (VOI).
OBS: När uppgiftslistan har upprättats och testats har CTAnalyser en batch manager -funktion (BatMan) som kan användas för att påskynda datautvinning och säkerställa enhetlig bildbehandling. En uppgiftslista med exempelinställningar för procedur 4.2.3. finns i tilläggsmaterialet.
- Ladda ner och installera den senaste versionen av CTAnalyser på https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html för analys av mikroarchitectural parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna metoden för kärnprovtagning visade sig vara mycket effektiv och ändamålsenlig. Coringprover som använder detta protokoll är tillåtna för upphandling av >300 konsekvent stora prover för experiment på CLS BMIT-BM-strållinjen2, med en FOV på ~ 2 mm vid 1,49 μm voxelstorlek. För att validera konsistensen av kärndiametern gjordes tre mätningar längs längden (överst, mitten, botten) av en delmängd av mänskliga främre lårbenskärnor (n=69). Kärnornas genomsnittliga diameter var 1,96 ± 0,11 mm. och den genomsnittliga gallringen längs kärnans längd var 0,06 ± 0,06 mm/mm För att betona tillämpligheten på andra hårda kompositmaterial försökte vi denna metod på prover av dolomit (n=32) vilket resulterade i en genomsnittlig diameter på 1,06 ± 0,02 mm. Gallring längs kärnprovets längd registrerades som 0,01 ± 0,005 mm/mm. Representativa siffror som jämför arbetsflödet för bildbehandling av ett coredprov och ett som upphandlats med hjälp av ett roterande verktyg (t.ex. Dremel), enligt beskrivningen i steg 4.2.3, kan ses i figur 7. Provsnittet med hjälp av det gemensamma roterande verktyget uppvisade ett ökat antal kanaler (Ca.N) och luckor (Lc.N) och en minskad genomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm), kanalvolym (Ca.V) och kortikal porositet (Ca.V/TV) jämfört med kärnprovet. Även om vissa av dessa skillnader kan bero på benmikrostrukturell variation mellan individer, ökade sannolikt det högre antalet kanaler och luckor som extraherades från rotationsverktygsdatauppsättningen artificiellt på grund av skanningsartefakter och buller (figur 7). De porositetsdata som samlats in från steg 4.2.3.9 för varje prov finns i tabell 1. Det är värt att notera att även om coringprotokollet minskar artefakter som observerats i SRμCT-skanningar, representerar de lägre kvalitet, artefaktbelastade siffrorna från de rätlinlinjande benblocksexperimenten (figur 7A) en mångfacetterad fråga. Vissa artefakter (t.ex. faskontrastsignaler) kan ha orsakats av synkrotronanläggning eller strållinjespecifika problem. Skanningsparametrar för både representativa uppsättningar experiment och tillhörande siffror (figurerna 7A, 7B) finns i tilläggsmaterialet (tabellerna S1, S2).
Synchrotron micro-CT bilder samlade från cored prover framgångsrikt undertryckta skanning artefakter, som visas ovan, inklusive streak artefakter. Efterföljande bild bearbetning bekräftade potentialen i tekniken att förbättra visualisering av när ben microarchitecture. Till exempel observerades mineraliseringsskillnader, förbättrad avgränsning av osteonala gränser och konsekvent visualisering av mjuka vävnader inom kärlkanaler (figurerna 8C, 8D). Den senare är kritisk för bildbehandling eftersom partiell visualisering av mjuka vävnader i kanaler kan resultera i felaktiga beräkningar av procent porositet och portjocklek, eftersom porerna inte är helt fyllda. Gränserna för osteocyt lacunae förbättrades också på grund av minskad birefringence, vilket möjliggör kvantifiering av form parametrar. De potentiella fördelarna med den beskrivna coring tekniken inkluderar lätt att centrera provet i FOV, minskade analytiska krav och konsekvent visualisering av mjuka vävnader inom vaskulär kanaler.
Liknande förfaranden har använts framgångsrikt för att kärna av enstaka kristaller av ortopedoxen18,polykristallinmagnesit19 och andra geologiska material15,16,17 för högtrycksrockdeformationsexperiment. Dessa experiment kräver kärnor i specifika orienteringar i förhållande till kristallografiska axlar i enstakakristaller 18 eller justerade kristaller i polykristallinstenar19 för att bestämma orienteringsspecifika styrkor. De metoder som beskrivs ovan har använts för att först skapa orienterade plattor och därefter samla flera enhetliga, cylindriska kärnor för serie deformationsexperiment. Dessa metoder kan användas för att samla kärnor av alla hårda material, såsom ben, keramik eller glasögon. Ovanstående metodik skulle till exempel kunna tillämpas av biologiska antropologer för att utvärdera kärnor från specifika regioner inom närbenet och deras tillhörande biomekaniska (t.ex. spänning/komprimering) axlar.
Figur 1. Cylindrisk VOI från en vänster främre mänskliga mid-shaft lårben. En enda SRμCT rekonstruerad skiva av en hel kärna från en vänster främre mänskliga mellanaxel lårben (21-årig kvinna) (A) och 3D renderingar av en cylindrisk VOI från överlägsen (B) och främre vyer (C) visualiseras. Projektioner togs vid 0,9 μm, med vaskulär kanaler markerade i röda och osteocyt luckor i grått. Skalstänger betecknar 0,25 mm(A)och 0,02 mm(B,C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Ett lårbensprov i mellanaxeln (5 mm tjocklek) monterat på ett glasmikroskop glider med termisk epoxi (se Materialförteckning) och fastsatt på en glasschuck. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Glas skjutchucken med monterat prov fastsatt på svängarmen på en låghastighetssektionssåg (se Materialförteckning) före sektionering. Svängarmens sidoposition i förhållande till sågbladet och sektionshastigheten (RPM) visas på LCD-displayens övre respektive nedre rader. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. En 5 mm lårbenssektion monterad på en aluminiumform och fastsatt på ett XY-kvarnborrmaskinbord med fixeringsklämmor som förberedelse för coring. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Den fabriksborrpress som används i det utformade protokollet (A). Pilen identifierar djupbegränsaren, vilket förhindrar att borrkronan tränger djupt in i provet eller genom botten av tennet (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. Ett 5 mm femoralt ben tvärsnitt efter kärnupphandling från den främre aspekten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7. Enstaka SRμCT rekonstruerade skivor av den främre aspekten av vänster lårben från två individer. Provexemplar( A ) var sektionerade med hjälp av ett gemensamt roterandeverktyg och( B ) upphandlades med hjälp av den coring metod som beskrivs här. Varje segment jämförs med deras segmenterade motsvarighet (C och D). Observera hur lätt det är att isolera kortikal porositet i det kärnade provet(D)i motsats till provexemplaret som samlats in med rotationsverktyget (C). Detta bevisas ytterligare i 3D-renderingarna av kärlkanalerna i varje prov (E och F). Buller runt periferin av B är uppenbart och provet lämnar FOV, vilket båda resulterar i ökade utmaningar under bildbehandling. Skalstrecket i panel(D)betecknar 250 μm för paneler(A-D). Skalstängerna ipanelerna ( E och F) betecknar 700 respektive 600 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8. En representativ ROI från ett prov som anskaffats med ett roterande verktyg (A-C) och ett cored med den metod som presenteras här (D-F). Panelerna(A)och(D)representerar den angivna avkastningen från SRμCT-skanningarna. Panelerna( B) och ( E )representerardet bearbetningsstadium som används för att isolera och extrahera vaskulär kanalparametrar. Längst upp till höger på panelen (B) finns främmande föremål (pilar) som har klassificerats som kärlkanaler av bildbehandlingsprogram. PanelernaCoch Frepresenterardet bearbetningsstadium som används för att isolera och utvinna luckor. Skalstänger betecknar 0,1 mm för alla paneler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Vävnadsvolym (TV) | Kanalvolym (Ca.V) | Kanalyta (Ca.S) | Kortikal porositet (Ca.V/TV) | Kanalyta till vävnadsvolym (Ca.S/TV) | Genomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm) | Genomsnittlig kanalseparation (Ca.Sp) | Lol av kanaler (Ca.N) | Lol av Lacunae (Lc.N) | Portäthet (Porer/TV) | |
| Enheter | mm³ (mm³) | mm³ (mm³) | Mm² | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | porer/μm³ |
| Roterande snitt | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Denna metod) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Tabell 1. Representativa resultat för steg 4.2.3.9 av roterande verktyg och korsettprover visualiserade i figur 8. Observera det minskade Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, antal porer och portäthet för det roterande skurna provet samt det ökade antalet kärlkanaler och luckor. Skanning artefakter delvis framkallas av ojämnt skuren prov sannolikt bidragit till en konstgjord ökning av luckor och när porer.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner dessa material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har inte funnits något omfattande, standardiserat protokoll för införskaffande av enhetliga och cylindriska kortikala benkärnprover för högupplöst SRμCT-avbildning med begränsade FOV-inställningar. Protokollet som beskrivs här fyller det tomrummet genom att tillhandahålla en omfattande handledning om hur man införskaffar konsekvent stora kortikala benkärnprover för SRμCT-avbildning och efterföljande korrekt visualisering och extraktion av mikroarkitektiva data. Vi har visat att vårt protokoll ger en mer standardiserad och tillförlitlig metod för att anskaffa när benkärnor än tidigare beskrivningar av att dela rätlinlinja benblock av godtyckliga dimensioner. Forskare som har förlitat sig på handhållna roterande verktyg (t.ex. Dremel) för att ta bort oregelbundet stora benblock upplevde sannolikt mycket längre provtagningstider under avbildning och större fel i trösklar och kortikal porutvinning under analysen. Denna avvikelse belyser behovet och betydelsen av detta standardiserade protokoll med avseende på ben prov beredning, efterföljande visualisering och analys och tolkning resultat.
Förfarandet som beskrivs här kan vidare anpassas av forskare inom relaterade områden som vanligtvis utvärderar benvävnad som biologiska antropologer och arkeologer. Inga diagenetiska eller arkeologiska/historiska benprover var dock cored för det beskrivna forskningsprotokollet. Diagenes, i geologi, hänvisar till förändringar av ett material (t.ex. ben) efter nedfall och kan omfatta förändringar orsakade av fysiska, kemiska eller biologiska medel29,30. Grundvatten, svampar och annan mikrobiell infiltration kan alla fungera som diagenetiska medel och förändra benvävnadsmikromorfologi31. Sådana prover kan kräva ytterligare procedurmässiga steg före coring, såsom inbäddning i metylmetylmetylrylat (MMA) eller ett epoxiharts i två delar. Inbäddning av femorala block var inte nödvändigt för de beskrivna experimenten på grund av den täta karaktären av femorala när ben, och det faktum att cadaveric exemplar balsamerades kort efter döden. Vid utvärdering av ömtåliga skelettelement och deras trabekula (t.ex. revben) rekommenderar vi dock att du bäddar in hela benblocket före coring.
Alla benvävnader som utvärderades i denna studie balsamerades medan de var färska. Författarna hade inte tillgång till den specifika kombinationen av kemikalier som används under balsameringsprocessen, även om bevarandekemikalier ofta inkluderar formaldehyd, etanol, fenol, etylenglykol och glutaraldehyd. Rättsmedicinska antropologiska data som dokumenterar förändringar i mikrostrukturen av formaldehydmättade ben är begränsade, även om Freidlander32 visade att formaldehydfixering inte förändrar morfologin hos vissa funktioner inklusive haversiska kanaler och sekundära osteoner. Formaldehydmättnad har dock dokumenterade effekter på vissa mekaniska egenskaper och frakturegenskaper hos icke-mänskligt ben såsom slagstyrka och fraktur seghet33,34.
Vi har rapporterat en metod för coring när ben prover före avbildning med högupplösta röntgensystem (SRμCT). Denna metod är kostnadseffektiv på grund av att material och utrustning kan hämtas från lokala hårdvarulager, effektivt och säkerställer en enhetlig provstorlek mellan exemplaren. Vi hoppas att våra förslag kommer att minska förfrågningarna om hur prover ska upphandlas, kärnas och analyseras för SRμCT, eftersom den befintliga litteraturen fortfarande är sparsam och saknar kritiska detaljer kring beredning och efterföljande analys. Vårt primära mål är att motivera forskare att tillämpa detta coringprotokoll som standardiserat förfarande för högupplöst benavbildningsforskning. Vi hoppas vidare att de ovan nämnda svårigheterna med att utveckla denna teknik kommer att lindra vanliga frågor och ge vägledning för felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som beskrivs i detta dokument utfördes vid BMIT-anläggningen vid Canadian Light Source, som stöds av Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, Saskatchewans regering, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada och Canadian Institutes of Health Research. Författarna vill tacka beamline-forskarna vid Canadian Light Source, särskilt Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov och Ning Zu för hjälpen med att inrätta och felsöka SkyScan SRμCT och white beam mikroskopsystem. Vi vill också tacka Beth Dalzell från University of Toledo College of Medicine and Life Sciences och Dr. Jeffrey Wenstrup vid Northeast Ohio Medical University för tillgång till cadaveric prover för denna studie. JM Andronowski stöds genom start-up forskningsfonder från University of Akron och ett Nationellt institut för rättsforskning och utveckling inom rättsvetenskap för straffrättsliga ändamål (2018-DU-BX-0188). RA Davis stöds av en forskarassistent som tillhandahålls av University of Akron. Utrustning och förnödenheter som används för coring och sågning köptes av startfonder från University of Akron och NSF beviljar EAR-1624242 till CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J.
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al.
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J.
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S.
- Bone Hedges, R. E. M.
- Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
