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Biology

सिंक्रोट्रॉन माइक्रो-सीटी के लिए हाई-थ्रूपुट कॉर्टिकल बोन सैंपल प्रोक्योरमेंट और एनालिसिस के लिए एक सेक्शनिंग, कोरिंग और इमेज प्रोसेसिंग गाइड

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61081
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

Summary

हमने मानव फेमोरा के पूर्वकाल पहलू से एसआरसीटी प्रयोगों के लिए समान आकार के कॉर्टिकल हड्डी नमूनों की खरीद के लिए एक भूवैज्ञानिक (स्कोरिंग) नमूना प्रोटोकॉल नियोजित किया। यह विधि न्यूनतम विनाशकारी, कुशल है, जिसके परिणामस्वरूप बेलनाकार नमूने होते हैं जो अनियमित नमूना आकार से इमेजिंग कलाकृतियों को कम करते हैं और माइक्रोआर्किटक्चुरल विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण में सुधार करते हैं।

Abstract

हड्डी एक गतिशील और यांत्रिक रूप से सक्रिय ऊतक है जो मानव जीवन काल में संरचना में परिवर्तन करता है। पारंपरिक दो आयामी तकनीकों का उपयोग करके हड्डी रीमॉडलिंग प्रक्रिया के उत्पादों का काफी अध्ययन किया गया है। डेस्कटॉप माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) और सिंक्रोट्रॉन विकिरण माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (SRμCT) के माध्यम से एक्स-रे इमेजिंग तकनीक में हाल की प्रगति ने अन्य 3डी इमेजिंग तकनीकों (जैसे, एसईएम) की तुलना में एक बड़े क्षेत्र (एफओवी) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी (3 डी) स्कैन के अधिग्रहण के लिए अनुमति दी है जो मानव कॉर्टिकल बोनिकल के भीतर माइक्रोस्कोपिक संरचनाओं की अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान करता है। नमूना सही FOV के भीतर केंद्रित किया जाना चाहिए, हालांकि, लकीर डेटा विश्लेषण को प्रभावित करने के लिए जाना जाता कलाकृतियों की उपस्थिति को सीमित करने के लिए । पिछले अध्ययनों ने अनियमित आकार के रेक्टिलियर बोन ब्लॉकों की खरीद की सूचना दी है जिसके परिणामस्वरूप असमान किनारों या छवि ट्रंकेशन के कारण इमेजिंग कलाकृतियों में परिणाम होता है। हमने मानव फेमोरा के पूर्वकाल पहलू से SRμCT प्रयोगों के लिए लगातार आकार के कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के लिए एक भूवैज्ञानिक नमूना प्रोटोकॉल (स्कोरिंग) लागू किया है। यह स्कोरिंग विधि ऊतक के लिए कुशल और न्यूनतम विनाशकारी है। यह एक समान बेलनाकार नमूने बनाता है जो रोटेशन के दौरान आइसोमेट्रिक होने की प्रकृति से इमेजिंग कलाकृतियों को कम करता है और स्कैनिंग के दौरान एक्स-रे बीम के लिए एक समान पथ लंबाई प्रदान करता है। कॉर्डिनेट और अनियमित आकार के नमूनों के एक्स-रे टोमोग्राफिक डेटा की छवि प्रसंस्करण कॉर्टिकल बोन माइक्रोआर्किटेचर के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण में सुधार करने के लिए तकनीक की क्षमता की पुष्टि करता है। इस प्रोटोकॉल का एक लक्ष्य कॉर्टिकल बोन कोर के निष्कर्षण के लिए एक विश्वसनीय और दोहराने योग्य विधि प्रदान करना है जो विभिन्न प्रकार के उच्च-रिज़ॉल्यूशन बोन इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलनीय है। काम का एक व्यापक लक्ष्य SRμCT के लिए एक मानकीकृत कॉर्टिकल बोन प्रोक्योरमेंट बनाना है जो सस्ती, सुसंगत और सीधा है। इस प्रक्रिया को संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं द्वारा आगे अनुकूलित किया जा सकता है जो आमतौर पर जैविक मानव विज्ञान, भूविज्ञान या भौतिक विज्ञान जैसे कठिन समग्र सामग्रियों का मूल्यांकन करते हैं।

Introduction

इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हाल ही में प्रगति के साथ, अब बहुत उच्च संकल्प के साथ एक्स-रे इमेजिंग डेटा प्राप्त करना संभव है। डेस्कटॉप माइक्रो-सीटी (μCT) सिस्टम उनके गैर विनाशकारी प्रकृति1के कारण रद्द हड्डी इमेजिंग के लिए वर्तमान मानक हैं । कॉर्टिकल हड्डी की माइक्रोस्ट्रक्चरल विशेषताओं को इमेजिंग करते समय, हालांकि, μCT का उपयोग अधिक सीमित किया गया है। संकल्प की बाधाओं के कारण, डेस्कटॉप सिस्टम कॉर्टिकल छिद्रों की तुलना में छोटे माइक्रोस्ट्रक्चरल सुविधाओं की छवि के लिए आवश्यक संकल्प प्राप्त नहीं कर सकते हैं, जैसे ऑस्टियोसाइट कमियां। इस आवेदन के लिए, एसआरसीटी इन प्रणालियों के अधिक से अधिक समाधान के कारण आदर्श है1। उदाहरण के लिए, बायोमेडिकल इमेजिंग एंड थेरेपी (बीएमआईटी) बीमलाइंस2 पर कनाडा के लाइट सोर्स (सील्स) में प्रयोगों ने 0.9 माइक्रोन के रूप में छोटे स्वरों के साथ छवियों का उत्पादन किया है। पिछले अध्ययन1,3, 4,5 ने इस संकल्प का उपयोग मानव लंबी हड्डियों(चित्र 1)से कॉर्टिकल हड्डी के नमूनों से अनुमानों और बाद के त्रि-आयामी (3 डी) प्राप्त करने के लिए किया है, जो ऑस्टियोसाइट कम्पत्य घनत्व4,6,7,8,9 और मानव जीवन के पार और सेक्स के बीच कम आकार और आकार3 में भिन्नता की मात्रा निर्धारित करता है। इसके अलावा के अध्ययनों ने मानव10में ऑस्टियोन बैंडिंग की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है, जो पहले फोरेंसिक मानवविज्ञान साहित्य में केवल अमानवीय स्तनधारियों के साथ जुड़े होने के लिए मान्यता प्राप्त है।

असाधारण संकल्प प्राप्त करने के लिए, एक्स-रे बीम को देखने के क्षेत्र (एफओवी) के भीतर बारीक ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए, जो अक्सर अधिकतम नमूना आकार को व्यास में कुछ मिलीमीटर तक सीमित करता है। वर्तमान में, इन प्रतिबंधों को पूरा करने वाली अस्थि नमूना खरीद की रूपरेखा वाले साहित्य में वर्णित कोई व्यापक, मानकीकृत प्रक्रियाएं नहीं की गई हैं । एफओवी के भीतर केंद्रित नमूने यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि 1) नमूना केंद्रित रहता है क्योंकि यह इमेजिंग के दौरान 180 डिग्री घूमता है, और 2) स्कैन कलाकृतियों सीमित हैं क्योंकि कोई छवि ट्रंकेशन नहीं है। दूसरे शब्दों में, FOV के बाहर नमूने का कोई हिस्सा एफओवी के अंदर अपने केंद्र बिंदु में प्रवेश करने वाली बीम में हस्तक्षेप नहीं करता है। यदि ऐसा होता है, तो पुनर्निर्माण एल्गोरिदम पूरी तरह से सही पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक कुछ क्षीणन डेटा से वंचित है। यह आगे देखने लायक है कि 360 ° (पूर्ण रोटेशन) स्कैन बीम सख्त के प्रभाव को कम लेकिन इमेजिंग के दौरान गलत संरेखण और नमूना आंदोलन की वजह से कलाकृतियों में वृद्धि। इस प्रकार, जबकि एक 360 ° स्कैन आम तौर पर क्लीनर डेटा उत्पन्न करेगा, इमेजिंग समय दोगुना हो गया है और इसलिए प्रयोगात्मक लागत और डेटा की गुणवत्ता के बीच एक समझौता संबोधित किया जाना चाहिए।

हड्डी इमेजिंग प्रयोगों का एक महत्वपूर्ण और अक्सर अनदेखा पहलू स्कैनिंग से पहले किया गया सटीक और प्रतिकृति नमूना तैयारी तकनीक है। अध्ययन है कि उनके प्रयोगों में SRμCT तरीकों को शामिल संक्षेप में उनके नमूना प्रोटोकॉल का उल्लेख है, लेकिन लेखकों को विशेष पद्धति उनके नमूनों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल के बारे में कोई विस्तार करने के लिए थोड़ा प्रदान करते हैं । ऐसे कई अध्ययनों में मनमानेआयामों के रेक्टिलियर हड्डी ब्लॉक काटने का उल्लेख है, लेकिन आम तौर पर3,4,10, 11, 12, 13, 14का उपयोग किए जाने वाले उपकरणों या एम्बेडिंग सामग्रियोंकेबारे में कोई और जानकारी प्रदान नहीं की गई है। कुछ शोधकर्ता आमतौर पर ब्याज के क्षेत्र(आरओआई)3, 4, 10, 11, 12, 13,14से हड्डी के रेक्टिलियर ब्लॉकों को हटाने के लिए हैंडहेल्ड रोटरी टूल्स (जैसे,ड्रेमेल)का उपयोगकरतेहैं। इस विधि के परिणामस्वरूप गैर-गुणवत्ता वाले नमूने होते हैं जो एफओवी से बड़े हो सकते हैं, जिससे कलाकृतियों और छवि ट्रंकेशन को स्कैन करने की संभावना बढ़ जाती है। इस तरह के नमूनों को अक्सर सटीक डायमंड-वेफर आरी (जैसे, बुहलर आइसोमेट) का उपयोग करके और अधिक परिष्कृत करने की आवश्यकता होती है। लगातार आयामों (दो-सौवें/मिमी तक) के साथ नमूनों की खरीद यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि अधिग्रहीत डेटासेट उच्चतम गुणवत्ता के हैं और बाद के परिणाम प्रतिकृति हैं ।

नमूना खरीद पद्धति की सीमित रिपोर्टिंग में पिछले अध्ययन में किए गए तरीकों को नियोजित करने और/या मान्य करने का प्रयास करते समय कठिनाई की एक अतिरिक्त परत जोड़ती है । वर्तमान में, शोधकर्ताओं ने अपने नमूना प्रक्रियाओं पर अधिक जानकारी के लिए सीधे लेखकों से संपर्क करना चाहिए । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बायोमेडिकल शोधकर्ताओं को अच्छी तरह से प्रलेखित, प्रतिकृति और लागत-कुशल नमूना तकनीक प्रदान करता है। इस लेख का प्राथमिक उद्देश्य माइक्रोआर्किटक्चुअल डेटा के सटीक दृश्य और निष्कर्षण के लिए मिल-ड्रिल प्रेस और डायमंड स्कोरिंग बिट का उपयोग करके लगातार आकार के कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के बारे में एक व्यापक ट्यूटोरियल प्रदान करना है। इस विधि को नियमित रूप से उच्च दबाव वाले रॉक यांत्रिकी 15, 16, 17,18,19 में कठोर सामग्रियों के ब्लॉक से एकसमान,छोटे व्यास(1-5मिमी)सिलेंडर एकत्र करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं से संशोधित कियाजाताहै।

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Protocol

सभी नमूनों टोलेडो विश्वविद्यालय, चिकित्सा और जीवन विज्ञान और पूर्वोत्तर ओहियो चिकित्सा विश्वविद्यालय (NEOMED) में शवदाता दाताओं से मंगाया गया था, दाता खुद या दाता के अगले परिजन की सूचित सहमति के साथ । मानव विषयों के संरक्षण के लिए Akron संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय (आईआरबी) इन नमूनों पूर्ण आईआरबी की समीक्षा से मुक्त समझा के रूप में वे जीवित व्यक्तियों से नहीं खरीदे गए थे । उम्र, लिंग और मृत्यु के कारण सहित जनसांख्यिकीय जानकारी सभी दानदाताओं के लिए उपलब्ध थी । चयनित व्यक्तियों के पास हड्डी को प्रभावित करने वाली स्थिति नहीं थी और न ही उपचार आहार के संपर्क में आने से मृत्यु के समय हड्डी रीमॉडलिंग प्रभावित हो सकती है। कॉर्टिकल हड्डी के नमूने 19 से 101 वर्ष की उम्र (मतलब = 73.9 वर्ष) से लेकर उम्र के साथ कैडेवरिक आधुनिक पुरुषों और महिलाओं के फेमोरा से प्राप्त किए गए थे। इस फेमोरल मिडशाफ्ट का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है जिसमें कॉर्टिकल पोर्सिटी20,21, 22,23,24 और हड्डी के ऊतकों के भौतिक घनत्व25,26, 27में भिन्नता की परीक्षाएं शामिल हैं और इस प्रकार सूक्ष्म संरचनात्मक विश्लेषणों के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली साइट बन गई है।

1. ऊतक खरीद और Maceration

  1. बाएं फेमोरा के मध्य डायफिसिज से ~ 7.5 सेमी बोन ब्लॉक खरीदने के लिए कार्बाइड ब्लेड (समग्र सामग्री के लिए) से सुसज्जित एक दोलन देखा का उपयोग करें।
  2. 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए पाउडर प्रोटीज एंजाइम और नल के पानी के समाधान से भरे ओवन-सुरक्षित ग्लास डिश में फेमोरल ब्लॉक सोख लें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, कुंद विच्छेदन या दंत चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करके किसी भी शेष नरम ऊतकों और पेरिओस्टियम को ध्यान से हटा दें।
    नोट: नरम ऊतकों को हटाने के लिए तेज उपकरण (जैसे, स्केलपेल) के उपयोग से बचें। इस तरह के उपकरणों हड्डी है कि μCT स्कैन में पता लगाने योग्य है, नमूना संरक्षण और स्कैन डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नुकसान का कारण बन सकता है ।
  4. 20:1 भागों के साथ एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में हड्डी ब्लॉक रखकर मेडुलरी गुहा में मलबे या ऑक्सीक्यूशन को हटा दें, समाधान की सफाई के लिए पानी का नल (सामग्री की तालिकादेखें) या एक हाथ में पानी फ्लॉसर (जैसे, वाटरपिक) का उपयोग करके।
  5. एक नमूना कप में हड्डी ब्लॉक विसर्जित कर दिया और 70% इथेनॉल के साथ भरें। लिपिड को हटाने के लिए हड्डी को कम से कम 24 घंटे तक भिगोने दें।
    नोट: लिपिंस लिपिड को हटाने के लिए जाइलीन का भी उपयोग किया जा सकता है। जाइलीन में विस्तारित भिगोने, हालांकि, हड्डी भंगुर या चाक कर सकते हैं क्योंकि यह एक पायसिफायर है।
  6. 24 घंटे के बाद, इथेनॉल से हड्डी ब्लॉक हटा दें और 24-48 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर हवा सूखने दें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रुका जा सकता है ।

2. टिश्यू सेक्शनिंग

  1. 140 डिग्री सेल्सियस तक सेट की गई गर्म प्लेट पर 75 x 25 मिमी ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। स्लाइड के केंद्र पर थर्मल एपॉक्सी राल (सामग्री की तालिकादेखें) की एक उदार मात्रा पिघलाएं।
    1. यदि माइक्रोस्कोपी (<50 माइक्रोन) के लिए अतिरिक्त पतले अनुभाग तैयार कर रहे हैं, तो हड्डी ब्लॉक को ट्राबेकुला को संरक्षित करने के लिए दो-भाग एपॉक्सी में एम्बेडेड करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, नाजुक नमूनों (जैसे, डायजेनेटिक हड्डी या अत्यधिक ट्रैबेकुलाइज्ड नमूनों) के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय एपॉक्सी में नमूनों को एम्बेड करना आवश्यक है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अस्थि नमूनों को शवनालित नमूनों से प्राप्त किया गया था। यदि एसआरसीटीसी के माध्यम से नरम ऊतक संरचनाओं (उदाहरण के लिए, वाक्यूलेचर) की जांच करने के लिए ऑटोप्सी या सर्जिकल मामले से नए नमूने एकत्र किए जाते हैं, तो एपॉक्सी के साथ गर्भवती ऐसे ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकती है। इन मामलों में, एक वैकल्पिक चिपकने वाला या बढ़ते माध्यम की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, दो तरफा टेप, मॉडलिंग क्ले)।
  2. हड्डी ब्लॉक के अवर पहलू को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर थर्मल एपॉक्सी राल में दबाएं, स्लाइड के लंबवत हड्डी की लंबाई के साथ। हड्डी के नीचे कोट करने और स्लाइड करने के लिए सुरक्षित आसंजन सुनिश्चित करने के लिए नमूना को आगे-पीछे शिफ्ट करें।
  3. माउंटेड नमूना ~ 5 मिनट के लिए गर्म थाली पर आराम करने के लिए थर्मल epoxy छिद्रों और/
    नोट: स्लाइड पर एपॉक्सी सबसे अच्छा आसंजन के लिए बुलबुले से मुक्त होना चाहिए। बुलबुले को हटाने के लिए, स्लाइड पर नमूना आगे और पीछे शिफ्ट करें। बुलबुले अक्सर पानी और/या इथेनॉल हड्डी से बचने और वाष्पीकरण के भीतर फंस के कारण फार्म ।
  4. कुंद संदंश का उपयोग कर गर्म थाली से घुड़सवार नमूने के साथ स्लाइड निकालें और ~ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं । चक को पर्याप्त रूप से स्लाइड पकड़ता सुनिश्चित करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके स्लाइड के किनारे से किसी भी एपॉक्सी को हटा दें।
  5. एक गिलास स्लाइड चक के लिए पालन नमूने के साथ स्लाइड संलग्न करें और एक धीमी गति से खंड देखा के कुंडा हाथ करने के लिए चक माउंट (सामग्री की मेजदेखें, चित्रा 2)।
    नोट: जबकि एक Buehler IsoMet देखा इस प्रोटोकॉल में नियोजित किया गया था, अंय सटीक खंड आरी उपलब्ध है कि IsoMet के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler पेट्रोथिन, वेल डायमंड वायर) ।
  6. ब्लेड संपर्क सुनिश्चित करने और नमूना पार करने के लिए पोजिशनिंग डायल का उपयोग करके कुंडा हाथ समायोजित करें। नमूने को इस तरह रखें कि हड्डी के एक क्रॉस-सेक्शन को उसकी लंबाई के लंबवत काट दिया जाएगा।
  7. हाथ के वजन का मुकाबला करने के लिए काटने वाले हाथ के दूर की ओर वजन जोड़ें।
    नोट: यदि अपर्याप्त वजन का उपयोग किया जाता है, तो नमूना ब्लेड पर सहन कर सकता है और ब्लेड को फ्रैक्चर का कारण बन सकता है।
  8. आरी के तरल पदार्थ के पात्र में तरल पदार्थ (तरल पदार्थ काटने के लिए 20:1 भागों पानी) जोड़ें।
  9. हीरा वेफर ब्लेड को कसकर सुरक्षित करें और यह सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ का स्तर ब्लेड के काटने वाले हिस्से को जलमग्न कर देता है। गति को 200 आरपीएम पर सेट करें और ब्लेड(चित्र 3)पर धीरे-धीरे नमूना कम करें।
  10. सुनिश्चित करें कि ब्लेड और चक लड़खड़ा नहीं रहे है और/ यदि अत्यधिक आंदोलन नोट किया जाता है, तो तुरंत आरी को रोकें और काटने से पहले ब्लेड और/या चक आर्म असेंबली को कस दें । यदि चक आक्रामक रूप से ऊपर और नीचे बढ़ रहा है तो अतिरिक्त काउंटरवेट जोड़ें। दृश्यमान साइड-टू-साइड गति सहित अत्यधिक आंदोलन ब्लेड को फ्रैक्चर का कारण बन सकता है।
  11. पहला मोटा खंड प्रत्येक अतिरिक्त कटौती के समानांतर एक अच्छी तरह से परिभाषित सतह प्रदान करने के लिए एक 'अपशिष्ट कटौती' है। प्रारंभिक अपशिष्ट कटौती के बाद, कुंडा हाथ उठाएं और पोजिशनिंग डायल का उपयोग करके ब्लेड 5 मिमी की ओर चक को स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोपी के लिए आगे मोटी धाराओं (~ 1 मिमी) को इस विधि के साथ आगे एकत्र किया जा सकता है।
    नोट: मूल्यवान ऊतकों को बचाने के लिए, अपशिष्ट कटौती को छोड़ा जा सकता है। एक असमान किनारे के साथ एक नमूना खंडित करते समय, हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि नमूने की चोटी को स्कोरिंग ड्रिल बिट के किनारे पर स्पर्शरेखा रूप से रेखांकित किया जाए।
    1. सेक्शनिंग करते समय ब्लेड के कर्फ का हिसाब करना सुनिश्चित करें। उदाहरण के लिए, एक ब्लेड से 5 मिमी अनुभाग प्राप्त करने के लिए जिसमें 0.5 मिमी का कर्फ होता है, नमूना ले जाएं और ब्लेड की ओर 5.5 मिमी चक करें।
  12. सेक्शनिंग पूरा होने के बाद, थर्मल एपॉक्सी को पिघलाने के लिए गर्म प्लेट पर घुड़सवार नमूने के साथ ग्लास स्लाइड रखें। यह स्लाइड से हड्डी ब्लॉक को तेजी से हटाने के लिए अनुमति देता है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. नमूना स्कोरिंग

  1. थर्मल एपॉक्सी बॉन्डिंग तकनीक का उपयोग करके एक उथले एल्यूमीनियम टिन (व्यास में ~ 8 सेमी) के नीचे माउंट 5 मिमी हड्डी अनुभागों को चरण 2.2-2.4 में वर्णित किया गया है।
  2. मिल-ड्रिल प्रेस की एक XY मशीन टेबल पर टिन रखें (सामग्री की मेजदेखें) और हाथ से फिक्सिंग क्लैंप(चित्रा 4)कस लें।
  3. मिल-ड्रिल चक करने के लिए 2 मिमी आंतरिक व्यास खोखले-शाफ्ट जौहरी के हीरे इत्तला दे दी स्कोरिंग ड्रिल बिट (सामग्री की मेजदेखें) डालें । टिन(चित्रा 5)के माध्यम से स्कोरिंग को रोकने के लिए गहराई सीमक को समायोजित करें।
  4. ड्रिल बिट के नीचे हड्डी के नमूने के केंद्रीय पूर्वकाल पहलू को संरेखित करें, जबकि पेरिओस्टियम, एंडोस्टियम, या अत्यधिक ट्रैबेक्यूलराइज्ड क्षेत्रों के साथ घनिष्ठ संपर्क से बचें।
    नोट: मध्य पूर्वकाल फेमोरल कॉर्टिस का स्वचालित चयन संभव नहीं है क्योंकि कॉर्टिकल मोटाई व्यक्तियों के बीच भिन्न होती है, विशेष रूप से बढ़ती उम्र के साथ।
  5. नमूने को पूरी तरह से कवर करने के लिए टिन को आसुत पानी से भरें। यह हीट बिल्ड-अप, नमूने को जलाने, और/या स्कोरिंग के दौरान ड्रिल बिट को नुकसान से रोकता है ।
    नोट: स्कोरिंग की वजह से गर्मी के नुकसान की संभावना का आकलन करने के लिए, एक अवरक्त थर्मामीटर आसुत पानी से तापमान रीडिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में स्कोरिंग बिट पहले हड्डियों की सतह में प्रवेश किया । इस परीक्षण के लिए किए गए दस नमूनों में तापमान में 22.9 - 23.9 डिग्री सेल्सियस से 1 डिग्री सेल्सियस की भिन्नता थी। इस प्रकार, हम तर्क है कि गर्मी से प्रेरित क्षति नगण्य है ।
  6. कोर बिट और हड्डी के बीच संपर्क के पहले कुछ उदाहरणों के लिए, हड्डी की बेहतर सतह पर एक अंगूठी पहनने के लिए कोमल दबाव लागू करें। यह स्कोरिंग प्रक्रिया की शुरुआत में ड्रिल बिट के विक्षेप को रोकता है और बिट की सही नियुक्ति सुनिश्चित करता है।
  7. स्कोरिंग के दौरान, पानी की सतह के नीचे बिट की नोक रखते हुए नमूने में और बाहर ड्रिल बिट उठाएं। इस तकनीक को हर कुछ सेकंड के लिए बाहर फंसे हड्डी धूल फ्लश और सुनिश्चित करने के मलबे ड्रिल बिट occluding नहीं है जारी रखें ।
    नोट: यदि कोर एक शंकु आकार बना रहा है, यह 1 के कारण होने की संभावना है) अपर्याप्त समय के लिए स्कोरिंग बिट से हड्डी धूल फ्लश की अनुमति है, और 2) स्कोरिंग भी जल्दी होने वाली है । बढ़ी हुई गति नमूने से बड़े टुकड़ों को तोड़ सकती है और बेहतर पहलू को स्पंदित कर सकती है।
  8. स्कोरिंग पूरा होने के बाद, परिणामस्वरूप हड्डी कोर खोखले उपजी ड्रिल बिट(चित्रा 6)में दर्ज हो सकता है । बिट(चित्रा 2)से कोर को उखाड़ फेंकने के लिए ठीक-इत्तला दी संदंश या एक छोटे एलन रिंच की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  9. इमेजिंग तक एक शांत और शुष्क स्थान में एक लेबल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कॉर्ड नमूना स्टोर करें।

4. कॉर्टिकल बोन कोर से हड्डी माइक्रोआर्किटक्ट्राल मापदंडों के मूल्यांकन के लिए छवि प्रसंस्करण दिनचर्या

  1. μCT छवियों का पुनर्निर्माण
    1. डाउनलोड करें और SRμCT प्रक्षेपण छवियों के पुनर्निर्माण के लिए https://www.bruker.com/products/microtomography.html पर नवीनतम NRecon संस्करण स्थापित करें।
    2. डेस्कटॉप पर NRecon शॉर्टकट चुनें और संबद्ध GPUReconServer दिखाई देगा।
    3. पॉप-अप विंडो में वांछित डेटासेट खोलें। यदि विंडो दिखाई नहीं देती है, तो डेटाव्यूअर विंडो के ऊपरी बाएं हाथ के कोने पर फ़ोल्डर आइकन का चयन करें।
    4. SRμCT अधिग्रहण से पहले प्रक्षेपण का चयन करें। आउटपुटके तहत, उपयोग आरओआई और तराजूके लिए चयन को हटा दें ।
    5. पुनर्निर्माण फ़ाइल गंतव्य चुनें। ब्राउज़ का चयन करें और टोहनाम का एक नया फ़ोल्डर बनाएं। चयनित फाइल प्रारूप बीएमपी (8) होना चाहिए।
    6. मिसलिंमेंट मुआवजेकी जांच करें ।
      नोट: यह अनुमान अक्सर सही करने के करीब है। किसी न किसी 3 डी रेंडर को ओवरलैपिंग छवियों को स्थानांतरित करने के लिए तीर को ऊपर और नीचे ले जाकर मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है ताकि दाएं और बाएं किनारे यथासंभव निकटता से संरेखित हो सकें।
    7. सेटिंग्स केतहत, स्मूदिंग, बीम हार्डिंग, सीएस रोटेशन, एफओवी से बड़ी वस्तु और रिंग कलाकृतियों एल्गोरिदमको लागू करने के लिए वांछित चयन चुनें।
    8. ऑटोका चयन करके आउटपुट के तहत हिस्टोग्राम को समायोजित करें।
      नोट: जिसके परिणामस्वरूप छवि मंद हो सकती है।
    9. पुनर्निर्माण प्रसंस्करण शुरू करने के लिए शुरू का चयन करें।
    10. नहर/ऑस्टियोसाइट कमियों के लिए मानक नामकरण का उपयोगकरें 28। इनमें शामिल हो सकते हैं: कुल वीओआई ऊतक मात्रा (टीवी), नहर की मात्रा (सीएवी), नहरों की कुल संख्या (सीएएन), औसत नहर व्यास (Ca.Dm), कॉर्टिकल पोरोसिटी (सीएवी/टीवी), एक प्रतिशत के रूप में दिया गया, कमी की कुल संख्या (N.Lc), और औसत कमियों की मात्रा (एलसीवी), दूसरों के बीच । प्रतिमिमी 3 (N.Lc/BV) कम घनत्व निर्धारित करने के लिए, हड्डी की मात्रा (बीवी) की गणना कुल मात्रा शून्य नहर मात्रा (टीवी-सीएवी) के रूप में की जाती है।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  2. पुनर्निर्मित छवियों से माइक्रोआर्किटक्टुरल डेटा का संग्रह
    1. माइक्रोआर्किटेक्चरल मापदंडों के विश्लेषण के लिए https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html पर CTAnalyser के नवीनतम संस्करण डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें।
      नोट: CTAnalyser का मुफ्त संस्करण कार्यक्षमता में सीमित है। इसलिए, अधिक विस्तृत विश्लेषण करने के लिए पूर्ण लाइसेंस खरीदने की सिफारिश की जाती है।
    2. इमेज | के तहत गुण | पिक्सेल का आकार बदलें,यह सुनिश्चित करें कि पिक्सेल का आकार लागू μCT इमेजिंग प्रोटोकॉल से मेल खाता है।
      नोट: यदि इमेजजे या इसी तरह के प्रोग्राम में छवियों को संपादित करना है, तो ध्यान दें कि बचत करने पर, झगड़ा फ़ाइल में एम्बेडेड हेडर को संशोधित किया जाएगा और डेटासेट आयात करते समय विश्लेषण सॉफ्टवेयर पिक्सेल आकार को बदल देगा।
    3. चुनें कस्टम प्रोसेसिंग एक कार्य सूची बनाने के लिए (देखें अनुपूरक सामग्री) स्कैन डाटासेट से बोन माइक्रोआर्साइटिक्चर का विश्लेषण करना। CTAnalyser के लिए प्लगइन्स मालिकाना का उपयोग कर ऑस्टियोसाइट कम्कुनार नेटवर्क मापदंडों के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल यहां इस प्रकार है:
      नोट: प्लगइन कार्य सूची डेटासेट के लिए अच्छी तरह से काम करती है जहां नमूना एफओवी में दिखाई देने वाला एकमात्र विषय है। यदि खाली स्थान नमूने को घेरे हुए है, तो आरओआई के आवेदन की आवश्यकता होती है। अन्यथा, 3डी विश्लेषण और व्यक्तिगत ऑब्जेक्ट विश्लेषण में एकत्र किए गए मूल्यों को कृत्रिम रूप से कम कर दिया जाएगा।
      1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कस्टम प्रोसेसिंग मेनू खोलने से पहले किसी भी संशोधन (उदाहरण के लिए, इमेजजे या इसी तरह के संपादन से) को रीसेट करने और/या समायोजित करने के लिए छवियों को फिर से लोड करें।
      2. छवियों में शोर को कम करने के लिए, एक गोल गिरी और 2-3 के त्रिज्या के साथ 3 डी अंतरिक्ष में एक गॉसियन कम पास फिल्टर लागू करें।
        नोट: ये सेटिंग परीक्षण और त्रुटि परीक्षण के माध्यम से रिपोर्ट किए गए SRμCT प्रयोगों से डेटासेट पर लागू की गई थीं। लक्ष्य डेटा के लिए सबसे अच्छी गुणवत्ता पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए किया गया था । प्रत्येक अद्वितीय प्रयोगात्मक सेटअप के अनुरूप पुनर्निर्माण सेटिंग्स को समायोजित करें।
      3. संवहनी नहरों को उजागर करने के लिए कम और उच्च मूल्यों का चयन करके छवियों के लिए एक वैश्विक ग्रेस्केल सीमा लागू करें। आंकड़े 8B और 8D में देखे गए पुनर्निर्मित स्लाइस 0-155 की एक उदाहरण सीमा को दर्शाते हैं।
        नोट: चरण 4.2.3.2 के समान, यहां लागू सीमा सेटिंग्स को व्यापक परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से चुना गया था। थ्रेसहोल्डिंग को प्रत्येक प्रयोगात्मक सेट-अप और μCT इमेजिंग सिस्टम के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
      4. 3 डी स्पेस में सफेद धब्बे को हटाने के लिए डेस्पेकल (मूल्य) जो केवल नहरों को अलग करने के लिए ऑस्टियोसाइट लैक्नो के वॉल्यूमेट्रिक पिक्सेल (स्वर) आकार की सीमा के भीतर हैं।
        नोट: 0.9 माइक्रोन पिक्सेल आकार पर ली गई मानव कॉर्टिकल हड्डी के एसआरसीटी स्कैन के लिए, ऑस्टियोसाइट कमियों के लिए कम सीमा 13 वोक्सल है।
      5. नहरों में कलाकृतियों को हटाने के लिए 2D अंतरिक्ष में किसी भी काले धब्बे को हटाने के लिए Despeckle। ये 2D में काफी बड़े हो सकते हैं, इस प्रकार उन सुविधाओं को हटा दें जो <15,000 पिक्सल हैं।
      6. नहरों में फंसे किसी भी नरम ऊतकों को अलग करने के लिए, छवियों की गुणवत्ता के आधार पर, 2 या 3 त्रिज्या की एक गोल गिरी के साथ रूपात्मक ऑपरेशन फ़ंक्शन का उपयोग करके 3 डी अंतरिक्ष में छिद्रों को फैलाएं।
      7. चरण 4.2.3.5 के समान सेटिंग्स का उपयोग करके एक अतिरिक्त डेस्पेकल फ़ंक्शन करें। नहरों के भीतर अलग नरम ऊतकों को हटाने के लिए।
      8. चरण 4.2.3.6 से फैलाव इरोड करें। या तो 2 या 3 त्रिज्या के साथ एक दौर गिरी का उपयोग कर एक रूपात्मक आपरेशन समारोह का उपयोग करना। इस चरण के लिए त्रिज्या प्रक्रिया 4.2.3.6 में उपयोग किए जाने वाले त्रिज्या से मेल खाती है।
      9. 3डी विश्लेषण चलाएं और संवहनी नहरों की मात्रा के लिए गणना करने के लिए कौन से मापदंडों का चयन करें। आम तौर पर, बुनियादी मूल्यों को पर्याप्त जानकारी प्रदान करेगा।
      10. निर्देशिका में एक कस्टम सबफोल्डर में सेव बिटमैप्स के साथ प्रसंस्कृत छवियों को सहेजें।
        नोट: यदि अमीरा/एविज़ो, ड्रैगनफ्लाई, ड्रिश्टी आदि जैसे कार्यक्रम का उपयोग करके प्रसंस्कृत छवियों से 3डी पुनर्निर्माण छवि बनाना है, तो मोनोक्रोम (1 बिट) के रूप में छवियों को सहेजने की सिफारिश की जाती है।
      11. वैस्कुलर नहरों की संख्या की गणना करें और व्यक्तिगत ऑब्जेक्ट विश्लेषण समारोह का उपयोग करके उनके आकार, आकार और अभिविन्यास का वर्णन करें।
      12. चरण 4.2.3.1 - 4.2.3.3 दोहराएं। ऑस्टियोसाइट कमियों के विश्लेषण के लिए छवि को रीसेट करने के लिए।
      13. डेस्पेकल फ़ंक्शन का उपयोग करके 3 डी स्पेस में सफेद धब्बे हटाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि ऐसी कलाकृतियां कम आकार की निचली सीमा से छोटी हैं। यह कदम स्कैन से शोर को हटा देता है जो कॉर्टिकल छिद्रों के रूप में दिखाई दे सकता है, जबकि सही ऑस्टियोसाइट कमियों को संरक्षित करता है। 0.9 माइक्रोन पिक्सेल आकार के मानव SRμCT स्कैन के लिए, यह कम सीमा 13 स्वर है।
      14. कमियों के आकार की ऊपरी सीमा से बड़े सफेद धब्बे को हटाने के लिए एक बार फिर डेक्सले। चरण 4.2.3.13 में सूचीबद्ध सेटिंग्स के साथ मानव SRμCT डेटासेट के लिए, यह सीमा 2743 स्वर है।
      15. विशेष रूप से ऑस्टियोसाइट कमियों से संबंधित सूक्ष्म संरचनात्मक जानकारी निकालने के लिए 3 डी विश्लेषण करें।
      16. ऑस्टियोसाइट कमियों को अलग करने के लिए प्रसंस्कृत छवियों को सहेजने के लिए सेव बिटमैप्स का चयन करें।
      17. चयनित वॉल्यूम ऑफ इंटरेस्ट (वीओआई) के भीतर 3डी में ऑस्टियोसाइट्स की संख्या की गणना करने के लिए व्यक्तिगत ऑब्जेक्ट विश्लेषण करें।
        नोट: एक बार कार्य सूची स्थापित और परीक्षण हो जाने के बाद, CTAnalyser में एक बैच मैनेजर (बैटमैन) फ़ंक्शन होता है जिसे डेटा निष्कर्षण में तेजी लाने और समान छवि प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। प्रक्रिया 4.2.3 के लिए उदाहरण सेटिंग्स के साथ एक कार्य सूची। अनुपूरक सामग्रीमें पाया जा सकता है ।

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Representative Results

कोर सैंपलिंग की वर्णित विधि अत्यधिक प्रभावी और कुशल साबित हुई। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए नमूनों को स्कोरिंग करने की अनुमति दी गई और सीएलएस बीएमआईटी-बीएम बीमलाइन2पर प्रयोगों के लिए लगातार आकार के नमूनों की खरीद के लिए 1.49 माइक्रोन वोक्सल आकार में ~ 2 मिमी के एफओवी के साथ। कोर व्यास की स्थिरता को मान्य करने के लिए, मानव पूर्वकाल फेमोरल कोर(एन= 69) के सबसेट की लंबाई (ऊपर, मध्य, नीचे) के साथ तीन माप लिए गए थे। कोर का औसत व्यास 1.96 ± 0.11 मिमी था, और कोर की लंबाई के साथ औसत पतला 0.06 ± 0.06 ±मिमी/ कोर नमूने की लंबाई के साथ पतला 0.01 ± 0.005 मिमी/ प्रतिनिधि आंकड़े एक कॉर्ड नमूने के छवि प्रसंस्करण कार्यप्रवाह की तुलना करते हैं और एक रोटरी उपकरण (जैसे, ड्रेमेल) का उपयोग करके खरीदा गया है, जैसा कि चरण 4.2.3 में वर्णित है, चित्र 7में देखा जा सकता है। आम रोटरी उपकरण का उपयोग कर नमूना कटौती नहरों की एक वृद्धि की संख्या (Ca.N) और कमियों (Lc.N), और एक कम औसत नहर व्यास (Ca.Dm), नहर की मात्रा (Ca.V), और कॉर्टिकल पोर्ोसिटी (Ca.V/TV) का प्रदर्शन किया जब cored नमूना की तुलना में । हालांकि इनमें से कुछ अंतर व्यक्तियों के बीच अस्थि सूक्ष्मसंरचना भिन्नता के कारण हो सकते हैं, लेकिन रोटरी टूल डेटासेट से निकाली गई नहरों और कमियों की अधिक संख्या कृत्रिम रूप से स्कैन कलाकृतियों और शोर(चित्रा 7)के कारण बढ़ गई थी। प्रत्येक नमूने के लिए चरण 4.2.3.9 से एकत्र किए गए पोर्सिटी डेटा तालिका 1में स्थित है। यह ध्यान देने योग्य है कि हालांकि स्कोरिंग प्रोटोकॉल SRμCT स्कैन में देखी गई कलाकृतियों को कम करता है, लेकिन रेक्टिलियर बोन ब्लॉक प्रयोगों(चित्रा 7A)से कम गुणवत्ता वाले, विरूपण-लादेन के आंकड़े एक बहुआयामी मुद्दे का प्रतिनिधित्व करते हैं। कुछ कलाकृतियों (जैसे, चरण विपरीत संकेत) सिंक्रोट्रॉन सुविधा या बीमलाइन-विशिष्ट मुद्दों के कारण हो सकते हैं। प्रयोगों के दोनों प्रतिनिधि सेट के लिए पैरामीटर स्कैन करें और संबंधित आंकड़े(आंकड़े 7A, 7B) पूरक सामग्री (टेबल एस 1, S2)में पाए जा सकते हैं।

सिंक्रोट्रॉन माइक्रो-सीटी छवियों को कॉर्ड नमूनों से इकट्ठा किया गया सफलतापूर्वक स्कैन कलाकृतियों को दबा दिया गया, जैसा कि ऊपर दिखाया गया है, जिसमें लकीर कलाकृतियों शामिल हैं। बाद की छवि प्रसंस्करण ने कॉर्टिकल बोन माइक्रोआर्किटेक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करने के लिए तकनीक की क्षमता की पुष्टि की। उदाहरण के लिए, खनिजीकरण मतभेद, ऑस्टियोनल सीमाओं के बेहतर चित्रण, और संवहनी नहरों के भीतर नरम ऊतकों के लगातार दृश्य(आंकड़े 8C, 8D)मनाया गया । बाद की छवि प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि नहरों के भीतर नरम ऊतकों के आंशिक दृश्य के परिणामस्वरूप प्रतिशत पोर्सिटी और पोर मोटाई की गलत गणना हो सकती है, क्योंकि छिद्र पूरी तरह से भरे नहीं होते हैं। कम द्विउदि के कारण ऑस्टियोसाइट कमियों की सीमाओं में भी सुधार किया गया, जिससे आकार मापदंडों के परिमाणीकरण की अनुमति मिली। वर्णित स्कोरिंग तकनीक के संभावित फायदों में एफओवी में नमूने को केंद्रित करने में आसानी, विश्लेषणात्मक आवश्यकताओं को कम करना, और संवहनी नहरों के भीतर नरम ऊतकों का लगातार दृश्य शामिल है।

इसी तरह की प्रक्रियाओं का उपयोग उच्च दबाव वाले रॉक विरूपण प्रयोगों के लिए आर्थोपिरोक्सीन18,पॉलीक्रिस्टलाइन मैग्नेसाइट19 और अन्य भूगर्भिक सामग्री15,16,17 के एकल क्रिस्टल को कोर करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इन प्रयोगों को अभिविन्यास-विशिष्ट शक्तियों को निर्धारित करने के लिए एकल क्रिस्टल18 में क्रिस्टलीय कुल्हाड़ियों या पॉलीक्रिस्टलाइन चट्टानों19 में गठबंधन क्रिस्टल के सापेक्ष विशिष्ट झुकाव में कोर की आवश्यकता होती है। ऊपर वर्णित दृष्टिकोणों का उपयोग पहले उन्मुख स्लैब बनाने के लिए किया गया है और बाद में, विरूपण प्रयोगों की श्रृंखला के लिए कई वर्दी, बेलनाकार कोर एकत्र करें। इन तरीकों का उपयोग हड्डी, सिरेमिक या चश्मे जैसे किसी भी कठोर सामग्री के कोर एकत्र करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उपर्युक्त पद्धति जैविक मानवविज्ञानियों द्वारा कॉर्टिकल हड्डी के भीतर विशिष्ट क्षेत्रों और उनके संबद्ध बायोमैकेनिकल (जैसे, तनाव/संपीड़न) कुल्हाड़ियों से कोर का मूल्यांकन करने के लिए लागू की जा सकती है ।

Figure 1
चित्रा 1. एक बाएं पूर्वकाल मानव मध्य शाफ्ट फीमर से बेलनाकार वीओआई।  एक बाएं पूर्वकाल मानव मध्य शाफ्ट फीमर (21 वर्षीय महिला)(ए)से एक पूरे कोर का एक एकल SRμCT खंगाला गया, और बेहतर(बी)और पूर्वकाल विचारों(सी)से बेलनाकार वीओआई के 3 डी रेंडर कल्पना की जाती है। अनुमानों को 0.9 माइक्रोन पर लिया गया था, जिसमें वैस्कुलर नहरों को ग्रे में लाल और ऑस्टियोसाइट कमियों में रेखांकित किया गया था। स्केल बार 0.25 मिमी(ए)और 0.02 मिमी(बी,सी)को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। थर्मल एपॉक्सी (सामग्री की तालिका देखें) के साथ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर चढ़कर एक मध्य शाफ्ट फेमोरल नमूना (5 मिमी मोटाई) और ग्लास स्लाइड चक के लिए सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। एक कम गति खंड के कुंडा हाथ करने के लिए सुरक्षित घुड़सवार नमूना के साथ ग्लास स्लाइड चक देखा (सामग्री की मेज देखें) खंड से पहले । सॉ ब्लेड और सेक्शनिंग स्पीड (आरपीएम) के सापेक्ष कुंडा हाथ की पार्श्व स्थिति क्रमशः एलसीडी डिस्प्ले की ऊपर और निचली पंक्तियों पर प्रदर्शित होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. एक 5 मिमी फेमोरल अनुभाग एक एल्यूमीनियम टिन के लिए घुड़सवार और स्कोरिंग के लिए तैयारी में फिक्सिंग क्लैंप का उपयोग कर एक XY मिल-ड्रिल प्रेस टेबल के लिए सुरक्षित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। मिल-ड्रिल प्रेस तैयार प्रोटोकॉल (ए)में कार्यरत है । तीर गहराई सीमक की पहचान करता है, जो ड्रिल बिट को नमूने में गहराई से प्रवेश करने से रोकता है या टिन(बी)के नीचे के माध्यम से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6. पूर्वकाल पहलू से कोर खरीद के बाद एक 5 मिमी फीमोरल बोन क्रॉस-सेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। एकल SRμCT दो व्यक्तियों से बाएं फीमर के पूर्वकाल पहलू के स्लाइस खंगाला । नमूना(ए)एक आम रोटरी उपकरण का उपयोग कर खंडित किया गया था और(बी)यहां वर्णित स्कोरिंग विधि का उपयोग कर खरीदा गया था । प्रत्येक स्लाइस की तुलना उनके खंडित समकक्ष(सी और डी) सेकी जाती है। रोटरी टूल(सी)के साथ इकट्ठे हुए नमूने के विपरीत कॉर्ड सैंपल(डी)में कॉर्टिकल पोरोसिटी को अलग करने में आसानी पर ध्यान दें। यह प्रत्येक नमूने(ई और एफ)के संवहनी नहरों के 3 डी रेंडर में आगे का सबूत है। बी की परिधि के आसपास शोर स्पष्ट है और नमूना FOV छोड़ देता है, जो दोनों छवि प्रसंस्करण के दौरान चुनौतियों में वृद्धि हुई है । पैनल(डी)में स्केल बार पैनल(ए-डी)के लिए 250 माइक्रोन को दर्शाता है। पैनलों में स्केल बार(ई और एफ)क्रमशः 700 और 600 माइक्रोन को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8। रोटरी टूल (ए-सी) के साथ खरीदे गए नमूने से एक प्रतिनिधि आरओआई और यहां प्रस्तुत विधि (डी-एफ) का उपयोग करके एक कोर्ड। पैनल(ए)और(डी)SRμCT स्कैन से नामित आरओआई का प्रतिनिधित्व करते हैं। पैनल(बी)और(ई)संवहनी नहर मापदंडों को अलग करने और निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रसंस्करण चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। पैनल के ऊपरी दाईं ओर(बी)में बाहरी वस्तुएं (तीर) हैं जिन्हें छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर द्वारा संवहनी नहरों के रूप में वर्गीकृत किया गया है। पैनल(ग)और(एफ)कमियों को अलग करने और निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रसंस्करण चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार सभी पैनलों के लिए 0.1 मिमी निरूपित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऊतक मात्रा (टीवी) नहर की मात्रा (Ca.V) नहर सतह (सीए) कॉर्टिकल पोरोसिटी (Ca.V/TV) नहर सतह ऊतक मात्रा के लिए (Ca.S/TV) औसत नहर व्यास (Ca.Dm) औसत नहर जुदाई (सीए. एसपी) नहीं। नहरों की (सीएएन) नहीं। कमियों की (एलसीएन) पोर घनत्व (छिद्र/टीवी)
इकाइयों एमएमई एमएमई एमएम² % 1/मिमी सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी # # छिद्र/μma
रोटरी कट 0.15861 0.01780 0.00287 11.23 0.01808 51.05 122.81 459 64662 0.00041
कॉर्ड (यह विधि) 0.15747 0.02451 0.00216 15.56 0.01373 120.73 145.38 76 30531 0.00019

तालिका 1. रोटरी टूल के चरण 4.2.3.9 के लिए प्रतिनिधि परिणाम और चित्र 8में कल्पना किए गए नमूनों का परिणाम । नोट घटी हुई Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, रोटरी कट सैंपल के लिए छिद्रों और पोर घनत्व की संख्या के साथ-साथ संवहनी नहरों और कमियों की बढ़ी हुई संख्या पर ध्यान दें । असमान कटौती नमूने से आंशिक रूप से प्रेरित कलाकृतियों को स्कैन करने से कमियों और कॉर्टिकल छिद्रों में कृत्रिम वृद्धि हुई।

अनुपूरक सामग्री। कृपया इन सामग्रियों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीमित एफवीओ सेटअप के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसआरसीटी इमेजिंग के लिए यूनिफॉर्म और बेलनाकार कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के लिए कोई व्यापक, मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं किया गया है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल एसआरसीटी इमेजिंग और बाद में सटीक दृश्य और माइक्रोआर्किटेक्चुरल डेटा के निष्कर्षण के लिए लगातार आकार के कॉर्टिकल बोन कोर नमूनों की खरीद के बारे में एक व्यापक ट्यूटोरियल प्रदान करके उस शून्य को भरता है। हमने दिखाया है कि हमारा प्रोटोकॉल मनमाने आयामों के खंडित रेक्टिलियर बोन ब्लॉकों के पिछले विवरणों की तुलना में कॉर्टिकल बोन कोर की खरीद के लिए अधिक मानकीकृत और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है। इस प्रकार, शोधकर्ताओं ने हाथ में रोटरी उपकरण (जैसे, Dremel) पर भरोसा किया है हड्डी के अनियमित आकार के ब्लॉकों को दूर करने की संभावना इमेजिंग के दौरान बहुत लंबे समय तक नमूना सेट अप समय और थ्रेसिंग और कॉर्टिकल ताकना निष्कर्षण में विश्लेषण के दौरान अधिक से अधिक त्रुटियों का अनुभव किया । यह विसंगति हड्डी नमूना तैयारी, बाद में दृश्य और विश्लेषण, और परिणामों की व्याख्या के संबंध में इस मानकीकृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता और महत्व पर प्रकाश डालती है।

यहां उल्लिखित प्रक्रिया को संबंधित क्षेत्रों में शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है जो आमतौर पर जैविक मानवविज्ञानियों और पुरातत्वविदों जैसे अस्थि ऊतकों का मूल्यांकन करते हैं । हालांकि, कोई डायजेनेटिक और न ही पुरातात्विक/ऐतिहासिक अस्थि नमूनों को वर्णित अनुसंधान प्रोटोकॉल के लिए cored किया गया । भूविज्ञान में डायजेनेसिस, बयान के बाद एक सामग्री (जैसे, हड्डी) के परिवर्तन को संदर्भित करता है और भौतिक, रासायनिक, या जैविकसाधनों 29,30के कारण परिवर्तन शामिल कर सकते हैं। भूजल, कवक, और अन्य माइक्रोबियल घुसपैठ सभी डायजेनेटिक एजेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं और हड्डी के ऊतक माइक्रोमॉर्फोलॉजी31को बदल सकते हैं। इस तरह के नमूनों को स्कोरिंग से पहले अतिरिक्त प्रक्रियात्मक कदमों की आवश्यकता हो सकती है, जैसे मिथाइल मेथाक्रिलेट (एमएमए) या दो भाग वाले एपॉक्सी राल में एम्बेड करना। फेमोरल कॉर्टिकल हड्डी की घनी प्रकृति के कारण वर्णित प्रयोगों के लिए फीमोरल ब्लॉक एम्बेड करना आवश्यक नहीं था, और यह तथ्य कि मृत्यु के तुरंत बाद शवलेख्या नमूनों को एम्बलम किया गया था। यदि नाजुक कंकाल तत्वों और उनके ट्रैबेकुला (जैसे, पसलियों) का मूल्यांकन करते हैं, तो हम स्कोरिंग से पहले पूरे अस्थि ब्लॉक को एम्बेड करने की सलाह देते हैं।

इस अध्ययन में मूल्यांकन किए गए सभी अस्थि ऊतकों को ताजा करते समय एम्बलम किया गया था। लेखकों के पास एम्बलमिंग प्रक्रिया के दौरान उपयोग किए जाने वाले रसायनों के विशिष्ट संयोजन तक पहुंच नहीं थी, हालांकि संरक्षण रसायनों में आमतौर पर फॉर्मलडिहाइड, इथेनॉल, फिनोल, एथिलीन ग्लाइकोल और ग्लूटाराल्डिहाइड शामिल होते हैं। फॉर्मलडिहाइड संतृप्त हड्डियों के माइक्रोस्ट्रक्चर में परिवर्तन का दस्तावेजीकरण करने वाले फोरेंसिक मानवविज्ञान डेटा सीमित है, हालांकि फ्रीडलैंडर32 ने प्रदर्शन किया कि फॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण हैवर्सियन नहरों और माध्यमिक ऑस्टियोन सहित कुछ विशेषताओं के आकृति विज्ञान को नहीं बदलता है। हालांकि, फॉर्मलडिहाइड संतृप्ति ने कुछ यांत्रिक गुणों और अमानवीय हड्डी की फ्रैक्चर विशेषताओं जैसे प्रभाव शक्ति और फ्रैक्चर क्रूरता33,34पर प्रभाव का दस्तावेजीकरण किया है।

हमने उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे सिस्टम (SRμCT) के साथ इमेजिंग से पहले कॉर्टिकल हड्डी के नमूनों को स्कोरिंग के लिए एक विधि की सूचना दी है। यह विधि लागत प्रभावी है, इस तथ्य के कारण कि सामग्री और उपकरण स्थानीय हार्डवेयर स्टोर, कुशल से प्राप्त किए जा सकते हैं, और नमूनों में एक समान नमूना आकार सुनिश्चित करते हैं। यह हमारी आशा है कि हमारे सुझावों से संबंधित जांच में कमी आएगी कि नमूनों की खरीद, कॉर्ड और एसआरसीटी के लिए विश्लेषण कैसे किया जाना चाहिए, क्योंकि मौजूदा साहित्य विरल बना हुआ है और तैयारी और बाद के विश्लेषण के संबंध में महत्वपूर्ण विवरणों का अभाव है । हमारा प्राथमिक लक्ष्य शोधकर्ताओं को उच्च संकल्प हड्डी इमेजिंग अनुसंधान के लिए मानकीकृत प्रक्रिया के रूप में इस स्कोरिंग प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए प्रेरित करना है। हम आगे आशा करते हैं कि इस तकनीक को विकसित करने में हमने जो उपरोक्त कठिनाइयों का अनुभव किया है, वे आम प्रश्नों को कम करेंगे और समस्या निवारण के लिए मार्गदर्शन प्रदान करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस पेपर में वर्णित शोध कनाडा के लाइट सोर्स में BMIT सुविधा में किया गया था, जिसे कनाडा फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा, साकटचेवान विश्वविद्यालय, साकटचेवान सरकार, वेस्टर्न इकोनॉमिक डाइवर्सिफिकेशन कनाडा, नेशनल रिसर्च काउंसिल कनाडा और कनाडा के इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ रिसर्च द्वारा समर्थित किया जाता है । लेखक कनाडा के प्रकाश स्रोत, विशेष रूप से एडम वेब, डेनिस मिलर, सेर्गेई गैसिलोव, और निंग ज़ू में स्काईस्कैन SRμCT और सफेद बीम माइक्रोस्कोप सिस्टम के सेट-अप और समस्या निवारण में सहायता के लिए बीमलाइन वैज्ञानिकों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम इस अध्ययन के लिए कैडेड्रिक नमूनों तक पहुंच के लिए टोलेडो कॉलेज ऑफ मेडिसिन एंड लाइफ साइंसेज और पूर्वोत्तर ओहियो मेडिकल यूनिवर्सिटी के डॉ जेफरी वेनस्ट्रप से बेथ डालजेल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं । जेएम एंड्रोनोवस्की को एक्रोन विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्ट-अप अनुसंधान कोषों और आपराधिक न्याय उद्देश्य अनुदान (2018-डीयू-बीएक्स-0188) के लिए फोरेंसिक विज्ञान में एक राष्ट्रीय न्याय अनुसंधान और विकास संस्थान द्वारा प्रदान किया जाता है। आरए डेविस को एक स्नातक सहायक द्वारा समर्थित किया जाता है जो एक्रोन विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया जाता है। स्कोरिंग और सॉइंग के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण और आपूर्ति को यूनिवर्सिटी ऑफ एक्रोन और एनएसएफ ग्रांट इयर-1624242 द्वारा सीडब्ल्यू होलीओक को प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंडों द्वारा खरीदा गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1/8" plunge cutting carbide for composites Warrior 61812 28.6mm plunge
70% Ethanol Fisher Scientific BP8201500 3.8 Liters
Blunt-tipped forceps Fisher Scientific 10-300
Centrifuge tubes ThermoFisher 55398
Crystalbond 509-3 Epoxy Ted Pella 821-3
CTAnalyser Bruker microCT v.1.15.4.0 Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool Kit Amazon 787269885110
Diamond wafering saw blade for composite material Buehler #11-4247
Drill Press Jet Mill/Drill 350017 Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forceps Fisher Scientific 22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill MSC Industrial Supply #04804571
Glass microscope slides Ted Pella 26005 75x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuck Buehler #112488 Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °C ThermoScientific HP88850105
Incubator NAPCO Model 4200
Isocut Fluid Buehler 111193032 Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bit Otto Frei #119.050 2mm inner diameter hollow stem coring bit
NRecon Bruker microCT v.1.6.10.2 Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating saw Harbor Freight 62866
Oven-safe glass dishes Pyrex 1117715 Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000) Buehler 111280160
Razor blades Amazon 25181
Shallow aluminum tins Amazon B01MRWLD0R ~8cm diameter
Specimen cups Amazon 616784425436 885334344729
Tergazyme detergent Alconox 1304-1 1.8kg box
Ultrasonic cleaner MTI Corporation KJ201508006

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Andronowski, J. M., Davis, R. A., Holyoke, C. W. A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT. J. Vis. Exp. (160), e61081, doi:10.3791/61081 (2020).

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