Summary
우리는 인간 페모라의 전방 측면에서 SRμCT 실험을 위해 균일한 크기의 피질 뼈 표본을 조달하기 위해 지질학적(coring) 샘플링 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 최소한의 파괴적이고 효율적이며, 불규칙한 샘플 모양에서 이미징 아티팩트를 최소화하고 미세 건축 시각화 및 분석을 향상시키는 원통형 표본을 초래합니다.
Abstract
뼈는 인간의 수명 동안 구조에 변화 하는 동적 및 기계적으로 활성 조직. 뼈 리모델링 과정의 제품은 기존의 2차원 기술을 사용하여 실질적으로 연구되었습니다. 데스크톱 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT) 및 싱크로트론 방사선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(SRμCT)을 통한 X선 이미징 기술의 최근 발전은 다른 3D 이미징 기술(예를 들어, SEM)보다 더 큰 시야(FOV)의 고해상도 3차원(3D) 스캔을 획득하여 인간 내 마이크로코픽 구조의 보다 완전한 그림을 제공한다. 그러나 표본은 FOV 내에서 정확하게 중심을 두어 데이터 분석에 영향을 미치는 것으로 알려진 줄무늬 아티팩트의 모양을 제한해야 합니다. 이전 연구는 고르지 못한 가장자리 또는 이미지 잘림으로 인해 이미징 아티팩트를 초래하는 불규칙한 모양의 직선 골 블록의 조달을 보고했습니다. 우리는 인간 페모라의 전방 양으로부터 SRμCT 실험을 위해 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 표본을 조달하기 위해 지질 학적 샘플링 프로토콜 (coring)을 적용했습니다. 이 코링 방법은 효율적이고 조직에 최소한의 파괴적입니다. 균일한 원통형 샘플을 생성하여 회전 시 동포메트릭이 되고 스캔 전반에 걸쳐 X선 빔에 대한 균일한 경로 길이를 제공하는 특성상 이미징 아티팩트를 감소시합니다. 코어및 불규칙한 모양의 샘플의 X선 지형 데이터의 이미지 처리는 피질 뼈 미세 아키텍처의 시각화 및 분석을 개선하는 기술의 잠재력을 확인합니다. 이 프로토콜의 목표는 다양한 유형의 고해상도 뼈 이미징 실험에 적응할 수 있는 피질 뼈 코어추출을 위한 신뢰할 수 있고 반복가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이 작업의 가장 중요한 목표는 저렴하고 일관되며 간단하며 SRμCT를 위한 표준화된 피질 뼈 조달을 만드는 것입니다. 이 절차는 생물학적 인류학, 지구과학 또는 물질 과학과 같은 단단한 복합 물질을 일반적으로 평가하는 관련 분야의 연구원에 의해 더 적응될 수 있습니다.
Introduction
이미징 기술의 최근 발전으로, 지금 매우 높은 해상도의 X 선 이미징 데이터를 취득하는 것이 가능합니다. 데스크탑 마이크로 CT(μCT) 시스템은 비파괴적 특성1로인해 방수 골격을 이미징하는 현재 표준입니다. 그러나 피질 뼈의 미세 구조 적 특징을 이미징 할 때 μCT 사용은 더 제한적이었습니다. 해상도 제약으로 인해 데스크톱 시스템은 골세포 라쿠나에 같은 피질 모공보다 작은 미세 구조 적 특징을 이미지하는 데 필요한 해상도를 달성할 수 없습니다. 이 응용 프로그램의 경우 SRμCT는 이러한 시스템1의해상도가 커지므로 이상적입니다. 예를 들어, 생물 의학 이미징 및 치료 (BMIT) 빔 라인2에 캐나다 광원 (CLS)에서 실험은 0.9 μm만큼 작은 복셀이미지를 생산하고있다. 이전 연구1,3,4,5는 인간 긴 뼈(그림 1)에서피질 뼈 표본으로부터 프로젝션및 후속 3차원 (3D)을 획득하기 위해 이 해상도를 사용하여 골구세포 라부나 밀도4,6,7,9및라쿠나 모양및 크기3의 변화및 성간 사이의 변화. 추가 연구는 인간에서 골연 밴딩의 존재를입증했다 10,이전에 법의학 인류학 문헌에서 비 인간 포유동물과 연관된 것으로 인식 되는 현상.
뛰어난 해상도를 달성하기 위해 X선 빔은 최대 시편 크기를 직경 이내로 제한하는 시야(FOV) 내에 미세하게 초점을 맞추어야 합니다. 현재, 이러한 제한을 충족하는 뼈 샘플 조달을 요약하는 문헌에 설명된 포괄적이고 표준화된 절차는 없었습니다. FOV 내의 중심 표본은 1) 이미징 중에 180°를 회전할 때 샘플이 중심을 유지하고 2) 스캔 아티팩트가 이미지 잘림이 없기 때문에 제한되도록 하는 것이 중요합니다. 즉, FOV 외부의 시료의 어떤 부분도 FOV 내부의 초점으로 들어가는 빔을 방해하지 않는다. 이 경우 재구성 알고리즘은 완전히 올바른 재구성에 필요한 일부 감쇠 데이터가 박탈됩니다. 360° (전체 회전) 스캔빔 경화의 영향을 최소화하지만 이미징 중 정렬 불량 및 샘플 움직임으로 인한 아티팩트를 증가시키는 것은 주목할 가치가 있습니다. 따라서 360° 검사는 일반적으로 더 깨끗한 데이터를 생성하지만 이미징 시간이 두 배가되므로 실험 비용과 데이터 품질 간의 절충안을 해결해야 합니다.
뼈 화상 진찰 실험의 중요하고 수시로 간과되는 양상은 스캐닝의 앞에 수행된 정확하고 복제가능한 견본 준비 기술입니다. SRμCT 방법을 실험에 통합하는 연구는 샘플링 프로토콜을 간략하게 언급하지만 저자는 표본을 수집하는 데 사용되는 특정 방법론에 대해 거의 또는 전혀 세부 사항을 제공하지 않습니다. 많은 연구는 임의 차원의 직선 뼈 블록을 절단 언급하지만, 일반적으로사용되는도구 또는 포함 재료에 대한 자세한 정보를 제공하지3,4,10,11,12,13,14. 일부 연구자들은 일반적으로 핸드헬드 로터리 도구(예를 들어, Dremel)를 사용하여 관심 영역(ROI)3,4,10,11, 12,13,14에서뼈의 직선 블록을 제거한다. 이 방법은 FOV보다 더 큰 균일하게 크기의 샘플을 생성하여 아티팩트 및 이미지 잘림 스캔가능성을 높입니다. 이러한 표본은 종종 정밀 다이아몬드 웨이퍼 톱 (예 : Buehler Isomet)을 사용하여 추가 정제가 필요합니다. 일관된 차원(200/mm)으로 샘플을 조달하는 것은 획득된 데이터 집합이 최고 품질이고 후속 결과가 복제가능한지 확인하는 데 중요합니다.
샘플 조달 방법론의 제한된 보고는 이전 연구에서 수행된 방법을 사용 및/또는 검증하려고 할 때 어려움을 더합니다. 현재 연구원은 샘플링 절차에 대한 자세한 내용은 저자에게 직접 문의해야 합니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 생물 의학 연구자들이 철저히 문서화되고 복제되고 비용 효율적인 샘플링 기술을 제공합니다. 이 문서의 주요 목적은 미세 건축 데이터의 정확한 시각화 및 추출을 위해 밀 드릴 프레스 및 다이아몬드 코링 비트를 사용하여 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 샘플을 조달하는 방법에 대한 포괄적 인 자습서를 제공하는 것입니다. 이 방법은 고압 암석 역학15,16,17,18,19의단단한 재료 블록에서 균일하고 작은 직경 (1-5 mm) 실린더를 일상적으로 수집하는 데 사용되는 절차에서 수정됩니다.
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Protocol
모든 표본은 Toledo 대학, 의학 생명 과학 대학 및 북동부 오하이오 의과 대학 (NEOMED)에서 방부 처리 된 cadaveric 기증자로부터 공급되었으며 기증자 자신 또는 기증자의 다음 친척의 정보에 입각한 동의를 받았습니다. 인간 과목보호를 위한 애크런 대학 기관 검토 위원회 (IRB)는 살아있는 개인에게서 조달되지 않았기 때문에 이 표본이 완전한 IRB 검토에서 면제되었다고 간주했습니다. 나이, 성별 및 사망 원인을 포함한 인구 통계 학적 정보는 모든 기부자에게 제공되었습니다. 선택된 개별은 죽음의 시간에 뼈 리모델링에 영향을 미칠 수 있는 처리 식이요법에 뼈 영향을 미치는 조건 또는 노출을 문서화하지 않았습니다. 피질 뼈 샘플은 19세에서 101세 사이의 연령대를 가진 카다브릭 현대 남성과 여성의 여성(평균 = 73.9세)에서 수득하였다. 대퇴엽은피질 다공성(20,21, 22,23,24) 및 골조직의물질밀도(25,26,27)의변이 검사를 포함하여 광범위하게 연구되어 왔으며, 따라서 미세구조 분석을 위해 일반적으로 사용되는 사이트가 되었다.
1. 조직 조달 및 메이션
- 왼쪽 페모라의 중간 디아피에서 ~ 7.5cm 뼈 블록을 조달하기 위해 (복합 재료의 경우) 급식 절단 초경 블레이드가 장착 된 진동 톱을 사용합니다.
- 45°C로 설정된 인큐베이터에 분말 프로테아제 효소와 수돗물 용액으로 채워진 오븐에서 안전한 유리 접시에 대퇴 블록을 담급니다.
- 잠복 후, 무딘 해부 또는 치과 도구를 사용하여 남아있는 연조직과 periosteum을 조심스럽게 제거하십시오.
참고: 연조직을 제거하기 위해 날카로운 도구(예: 메스)를 사용하지 마십시오. 이러한 계측기는 μCT 스캔에서 검출가능한 뼈에 손상을 입히고 시편 보존 및 스캔 데이터 품질에 영향을 줄 수 있습니다. - 20:1 부품 수돗물로 5-10분 동안 초음파 청소기에 뼈 블록을 배치하거나 수중 물 치실(예: Waterpik)을 사용하여 수질 구멍의이물질 이나 폐색을 제거합니다.
- 뼈 블록을 시편 컵에 담그고 70% 에탄올로 채웁니다. 뼈가 적어도 24시간 동안 몸을 담그고 지질을 제거합니다.
참고: Xylenes는 지질을 제거하는 데에도 사용될 수 있습니다. 그러나, 자일렌에 담그는 확장, 그러나, 그것은 유화기로 뼈 가성 또는 백악질을 만들 수 있습니다. - 24시간 후, 에탄올에서 뼈 블록을 제거하고 24-48시간 동안 주변 온도에서 건조한 공기를 허용합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있습니다.
2. 조직 단면
- 140 °C로 설정된 핫 플레이트에 75 x 25mm 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 중앙에 풍부한 양의 열 에폭시 수지(재료 표참조)를 녹입니다.
- 현미경 검사법(&50 μm)에 대한 추가 얇은 섹션을 준비하는 경우, 뼈 블록은 trabeculae를 보존하기 위해 2부 에폭시에 내장되어야 할 수 있습니다. 또한, 에폭시에 표본을 포함시키는 연약한 표본(예를 들어, 투석질한 뼈 또는 고도로 배란된 표본)에 대한 이 프로토콜을 구현할 때 는 필요하다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 뼈 샘플은 방부된 cadaveric 표본에서 검색되었습니다. 새로운 표본이 SRμCT를 통해 연조직 구조(예를 들어, 혈관)를 검사하기 위해 부검 시 또는 외과 적 경우에 수집되는 경우, 에폭시함으로 함침은 그러한 조직에 손상을 유발할 수 있다. 이러한 경우 대체 접착제 또는 마운팅 매체가 권장됩니다(예: 양면 테이프, 모델링 점토).
- 현미경 검사법(&50 μm)에 대한 추가 얇은 섹션을 준비하는 경우, 뼈 블록은 trabeculae를 보존하기 위해 2부 에폭시에 내장되어야 할 수 있습니다. 또한, 에폭시에 표본을 포함시키는 연약한 표본(예를 들어, 투석질한 뼈 또는 고도로 배란된 표본)에 대한 이 프로토콜을 구현할 때 는 필요하다.
- 뼈 블록의 열등한 측면을 현미경 슬라이드의 열 에폭시 수지로 밀어 넣고 골격의 길이가 슬라이드에 수직으로 전달됩니다. 뼈의 밑면을 코팅하고 슬라이드에 안전한 접착력을 보장하기 위해 샘플을 앞뒤로 이동합니다.
- 장착 된 시편을 핫 플레이트에 5 분 동안 놓아 열 에폭시가 모공 및 / 또는 균열로 심을 수 있도록하십시오.
참고 : 슬라이드의 에폭시는 최상의 접착을 위해 거품이 없어야합니다. 거품을 제거하려면 슬라이드에서 샘플을 앞뒤로 이동합니다. 거품은 종종 물 및 / 또는 에탄올이 뼈 가탈출 및 증발 에탄올로 인해 형성됩니다. - 무딘 집게를 사용하여 핫 플레이트에서 장착 된 표본으로 슬라이드를 제거하고 - 10 분 동안 실온에서 냉각 할 수 있습니다. 면도날을 사용하여 슬라이드 가장자리에서 에폭시를 제거하여 척이 슬라이드를 적절하게 잡을 수 있도록 합니다.
- 부착된 샘플이 유리 슬라이드 척에 부착된 슬라이드를 부착하고 척을 저속 단면 톱의 회전암에 장착합니다(재료 표, 그림 2참조).
참고: Buehler IsoMet 톱이 이 프로토콜에 사용되었지만 IsoMet 대신 사용할 수 있는 다른 정밀 단면 톱(예: 레코, 엑스타크, 스마트컷, CT3, 부엘러 페트로틴, 웰 다이아몬드 와이어)을 사용할 수 있습니다. - 위치 다이얼을 사용하여 회전 암을 조정하여 블레이드 접선을 확인하고 샘플을 변환합니다. 뼈의 단면이 길이에 수직으로 절단될 수 있도록 시편을 배치합니다.
- 절단 팔의 먼 쪽에 가중치를 추가하여 팔의 무게에 대처합니다.
참고: 카운터웨이트가 부족한 경우 샘플이 블레이드에 부담을 주어 블레이드가 골절될 수 있습니다. - 절단 유체 (20:1 부품 물을 절단 유체에 물)를 톱의 유체 리셉터클에 추가합니다.
- 다이아몬드 웨이퍼 블레이드를 단단히 고정하고 유체 수준이 블레이드의 절단 부분을 침수있는지 확인합니다. 속도를 200 RPM으로 설정하고 샘플을블레이드(그림 3)로천천히 낮춥니다.
- 블레이드와 척이 흔들리거나 튀지 않도록 하십시오. 과도한 움직임이 지적되면 절단을 재개하기 전에 즉시 톱을 중지하고 블레이드 및 / 또는 척 팔 조립을 조입니다. 척이 공격적으로 위아래로 이동하는 경우 카운터웨이트를 추가합니다. 눈에 보이는 좌우 운동을 포함한 과도한 움직임은 블레이드가 골절될 수 있습니다.
- 첫 번째 두꺼운 단면은 각 추가 절단에 평행하게 잘 정의된 표면을 제공하는 '폐기물 절단'입니다. 초기 폐기물 절단 후, 회전 팔을 들어 올리고 포지셔닝 다이얼을 사용하여 척을 5mm쪽으로 이동합니다. 현미경 검사법을 위한 더 두꺼운 단면(~1mm)은 이 방법으로 더 수집될 수 있다.
참고 : 귀중한 조직을 저장하기 위해 폐기물 절단을 생략 할 수 있습니다. 그러나 고르지 않은 가장자리로 샘플을 단면화할 때, 시편의 피크가 코링 드릴 비트의 가장자리에 접선으로 줄지어 있는 것이 중요합니다.- 단면화 시 블레이드의 커프를 설명해야 합니다. 예를 들어, 0.5mm의 커프가 있는 블레이드에서 5mm 단면을 얻으려면 샘플을 이동하고 5.5mm를 블레이드쪽으로 이동합니다.
- 단면이 완료된 후, 열 에폭시를 녹이기 위해 장착된 시편과 유리 슬라이드를 핫 플레이트에 놓습니다. 이렇게 하면 슬라이드에서 골격 블록을 신속하게 제거할 수 있습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. 샘플 코링
- 단계 2.2-2.4에 설명된 바와 같이 열 에폭시 접합 기술을 사용하여 얕은 알루미늄 주석(직경 8cm)의 바닥에 5mm 뼈 섹션을 마운트한다.
- 밀 드릴 프레스의 XY 기계 테이블에 주석을 놓고(재료 표참조) 고정 고정 클램프(그림4).
- 2mm 이내 직경의 중공 샤프트 주얼러의 다이아몬드 팁 코링 드릴 비트(재료 표참조)를 밀 드릴 척에 삽입합니다. 주석(도 5)을통해 코링을 방지하기 위해 깊이 리미터를 조정합니다.
- 골골 비트 아래에 있는 뼈 샘플의 중앙 전방 측면을 정렬하면서 골망막, 내스트리움 또는 고도로 배반된 부위와의 밀접한 접촉을 피한다.
참고: 피질 두께가 개인마다 다르기 때문에 특히 나이가 증가함에 따라 중전방 대퇴 피코르티의 자동 선택은 실현 가능하지 않습니다. - 주석을 증류수로 채우면 시료를 완전히 덮습니다. 이렇게 하면 열 축적, 시료 굽기 및/또는 코어링 중 드릴 비트가 손상되는 것을 방지할 수 있습니다.
참고: 코링으로 인한 열 손상 가능성을 평가하기 위해, 코어링 비트가 먼저 뼈 표면에 침투함에 따라 증류수의 온도 측정값을 달성하기 위해 적외선 온도계를 사용했습니다. 온도는 1 °C에 의해 변화, 22.9 – 23.9 °C1 샘플 중 이 시험을 위해 코어. 따라서 열로 인한 손상은 무시할 수 있다고 주장합니다. - 코어 비트와 뼈 사이의 접촉의 처음 몇 인스턴스에 대 한, 뼈의 우수한 표면에 반지를 착용 하기 위해 부드러운 압력을 적용. 이렇게 하면 코어링 프로세스 의 시작 부분에서 드릴 비트가 편향되는 것을 방지하고 비트의 올바른 배치를 보장합니다.
- 코어링 하는 동안, 물 표면 아래 비트의 끝을 유지 하는 동안 샘플에서 드릴 비트를 들어 올립니다. 이 기술을 몇 초마다 계속하여 갇힌 뼈 먼지를 씻어내고 파편이 드릴 비트를 가려지지 않도록 하십시오.
참고: 코어가 원추형 모양을 형성하는 경우 1) 코링 비트에서 뼈 먼지를 플러시하는 데 충분한 시간을 허용하고 2) 코어링이 너무 빨리 발생하기 때문일 수 있습니다. 증가 된 속도는 샘플에서 큰 조각을 분해하고 우수한 측면을 분쇄 할 수 있습니다. - 코잉이 완료되면, 결과 뼈 코어는 중공 줄기 드릴비트(도 6)에박혀질 수 있다. 미세 한 팁 된 집게 또는 작은 알렌 렌치를 사용하여 비트(그림 2)에서코어를 빼낸다.
- 코르드 샘플을 이미징까지 시원하고 건조한 위치에 표시된 미세 원심 분리기 튜브에 보관하십시오.
4. 피질 뼈 코어에서 뼈 미세 아키텍처 매개 변수를 평가하기위한 이미지 처리 루틴
- μCT 이미지의 재구성
- SRμCT 프로젝션 이미지의 재구성을 위해 https://www.bruker.com/products/microtomography.html 최신 NRecon 버전을 다운로드하여 설치합니다.
- 데스크톱에서 NRecon 바로 가기를 선택하고 관련 GPUReconServer가 나타납니다.
- 팝업 창에서 원하는 데이터 집합을 엽니다. 창이 나타나지 않으면 데이터 뷰어 창의 왼쪽 위 모서리에 있는 폴더 아이콘을 선택합니다.
- SRμCT 획득에서 첫 번째 투영을 선택합니다. 출력에서 ROI 및 비늘 켜기사용 선택을 제거합니다.
- 재구성 파일 대상을 선택합니다. 찾아보기를 선택하고 정찰이라는새 폴더를 만듭니다. 선택한 파일 형식은 BMP(8)여야 합니다.
- 정렬 불량 보상을확인합니다.
참고: 이 추정은 종종 수정에 가깝습니다. 거친 3D 렌더링은 화살표를 위아래로 이동하여 오른쪽과 왼쪽 가장자리가 가능한 한 가깝게 정렬되도록 겹치는 이미지를 이동하여 수동으로 조정할 수 있습니다. - 설정에서 스무딩, 빔 경화, CS 회전, FOV보다 큰 개체 및 링 아티팩트 알고리즘을적용하려면 원하는 선택을 선택합니다.
- 자동을선택하여 출력 에서 히스토그램을 조정합니다.
참고: 결과 이미지가 어둡을 수 있습니다. - 시작을 선택하여 재구성 처리를 시작합니다.
- 운하/골다세포 라쿠나 지수28에표준 명명술을 사용하십시오. 여기에는 총 VOI 조직 부적(TV), 운하 부피(Ca.V), 총 운하 수(Ca.N), 평균 운하 직경(Ca.Dm), 피질 다공성(Ca.V/TV), 백분율로 주어지는 총 라쿠나(N.Lc), 평균 라쿠나 부피(Lc.V) 등이 포함될 수 있다. mm 당 라쿠나밀도를 3(N.Lc/BV)로 결정하기 위해 뼈 부피(BV)는 총 부피 마이너스 운하 부피(TV-Ca.V)로 계산됩니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 재구성된 이미지에서 마이크로 아키텍처 데이터 수집
- 마이크로 아키텍처 매개 변수 분석을 위해 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html CTAnalyser의 최신 버전을 다운로드하고 설치합니다.
참고: CT분석기의 무료 버전은 기능이 제한됩니다. 따라서 자세한 분석을 수행하기 위해 전체 라이센스를 구입하는 것이 좋습니다. - 이미지 | 아래 속성 | 픽셀 크기를 변경하고픽셀 크기가 적용된 μCT 이미징 프로토콜과 일치하는지 확인합니다.
참고: ImageJ 또는 유사한 프로그램에서 이미지를 편집하는 경우 저장 시 TIFF 파일에 포함된 헤더가 수정되고 데이터 집합을 가져올 때 분석 소프트웨어가 픽셀 크기를 변경합니다. - 선택 사용자 지정 처리 작업 목록을 만들려면(참조) 보충 재료)을 스캔 데이터 집합에서 뼈 마이크로아키텍처를 분석합니다. CTAnalyser에 독점 플러그인을 사용하여 골다구 세포 라부나 네트워크 매개 변수에 대한 일반적인 프로토콜은 다음과 같습니다:
참고: 플러그인 작업 목록은 샘플이 FOV에 표시되는 유일한 주제인 데이터 집합에 적합합니다. 빈 공간이 표본을 둘러싸고 있으면 ROI의 적용이 필요합니다. 그렇지 않으면 3D 분석 및 개별 개체 분석에 수집된 값이 인위적으로 줄어듭니다.- 분석 소프트웨어에서 사용자 지정 처리 메뉴를 열기 전에 이미지를 다시 로드하여 수정 사항(예: ImageJ 또는 이와 유사한 편집)을 재설정 및/또는 조정합니다.
- 이미지의 노이즈를 줄이려면 둥근 커널과 반지름 2-3이 있는 3D 공간에 가우시안 로우 패스 필터를 적용합니다.
참고: 이러한 설정은 시행 착오 테스트를 통해 보고된 SRμCT 실험의 데이터 집합에 적용되었습니다. 목표는 데이터에 대한 최상의 품질의 재구성을 얻는 것이었습니다. 각 고유한 실험 설정에 맞게 재구성 설정을 조정합니다. - 혈관 운하를 강조하기 위해 낮고 높은 값을 선택하여 이미지에 전역 회색 값 임계값을 적용합니다. 그림 8B 및 8D에서 볼 수 있는 재구성된 조각은 0-155의 예제 임계값을 묘사합니다.
참고: 4.2.3.2 단계와 마찬가지로 여기에 적용된 임계값 설정은 광범위한 시행 착오를 통해 선택되었습니다. 사용되는 각 실험 설정 및 μCT 이미징 시스템에 대해 임계값을 조정해야 합니다. - 데스펙클(denoise)은 운하만 분리하기 위해 골다이트 라쿠나에 대한 체적 픽셀(voxel) 크기 범위 내에 있는 3D 공간에서 흰색 반점을 제거합니다.
참고: 0.9 μm 픽셀 크기로 촬영한 인체 피질 뼈의 SRμCT 스캔의 경우, 골구세포 라쿠나에 대한 하한은 13개의 복셀입니다. - 2D 공간에서 검은 반점제거를 위해 운하의 유물을 제거합니다. 2D에서 매우 클 수 있으므로 <15,000 픽셀인 피처를 제거할 수 있습니다.
- 운하에 갇힌 연조직을 분리하기 위해 이미지의 품질에 따라 2 또는 3 반경의 둥근 커널을 사용하여 모공을 3D 공간에서 팽창시다.
- 단계 4.2.3.5와 동일한 설정을 사용하여 추가 데반클 기능을 수행합니다. 운하 내에서 격리 된 연조직을 제거하기 위해.
- 4.2.3.6 단계에서 팽창을 침식. 반지름 2 개 또는 3개의 둥근 커널을 사용하여 형태학적 동작 함수를 사용합니다. 이 단계의 반지름은 프로시저 4.2.3.6에 사용된 반지름과 일치해야 합니다.
- 3D 분석을 실행하고 혈관 운하의 볼륨을 계산할 매개 변수를 선택합니다. 일반적으로 기본 값은 충분한 정보를 제공합니다.
- 비트맵 저장을 사용한 처리된 이미지를 디렉터리의 사용자 지정 하위 폴더에 저장합니다.
참고: 아미라/아비조, 드래곤플라이, 드리슈티 등의 프로그램을 사용하여 가공된 이미지에서 3D 재구성 이미지를 생성하면 이미지를 흑백(1비트)으로 저장하는 것이 좋습니다. - 혈관 운하 수를 계산하고 개별 개체 분석 함수를 사용하여 크기, 모양 및 방향을 설명합니다.
- 4.2.3.1 – 4.2.3.3 단계를 반복합니다. 골세포 라부나 분석을 위해 이미지를 재설정합니다.
- 데반클 기능을 사용하여 3D 공간에서 흰색 반점을 제거하여 이러한 아티팩트가 라쿠나 크기의 하한보다 작도록 합니다. 이 단계는 피질 모공으로 보일 수 있는 스캔에서 노이즈를 제거하고 진정한 골다세포 라쿠나에 보존합니다. 0.9 μm 픽셀 크기의 인간 SRμCT 스캔의 경우 이 하한은 13개의 복셀입니다.
- 라쿠나 크기의 상한보다 큰 흰색 반점을 제거하기 위해 다시 한 번 데펙클. 4.2.3.13 단계에 나열된 설정이 있는 인간 SRμCT 데이터 집합의 경우 이 제한은 2743개의 복셀입니다.
- 3D 분석을 수행하여 골세포 라쿠나에 관련된 미세 구조 정보를 구체적으로 추출한다.
- 처리된 이미지를 저장하여 골다이드 라쿠네를 분리하려면 비트맵 저장을 선택합니다.
- 개별 개체 분석을 수행하여 선택한 관심량(VOI) 내에서 3D의 골세포 수를 계산합니다.
참고: 작업 목록이 설정되고 테스트되면 CTAnalyser는 데이터 추출을 가속화하고 균일한 이미지 처리를 보장하기 위해 사용할 수 있는 배치 관리자(BatMan) 기능을 가지고 있습니다. 프로시저 4.2.3에 대한 예제 설정이 있는 작업 목록입니다. 보충 재질에서찾을 수 있습니다.
- 마이크로 아키텍처 매개 변수 분석을 위해 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html CTAnalyser의 최신 버전을 다운로드하고 설치합니다.
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Representative Results
설명된 코어 샘플링 방법은 매우 효과적이고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 코링 시편은 CLS BMIT-BM 빔라인2의실험을 위해 일관되게 크기의 샘플을 조달할 수 있었으며, FOV는 1.49 μm 복셀 크기로 ~2mm입니다. 코어 직경의 일관성을 검증하기 위해 인간 전방 대퇴코어(n=69)의 하위 집합의 길이(위,중간, 아래)를 따라 세 가지 측정을 수행하였다. 코어의 평균 직경은 1.96 ± 0.11mm였으며, 코어의 길이를 따라 평균 숱이 0.06 ± 0.06 mm/mm로 다른 단단한 복합 재료에 대한 적용성을 강조하기 위해돌로미테(n=32)의 샘플에서 이 방법을 시도하여 평균 직경이 1.06 ± 0.02mm였다. 코어 샘플의 길이를 따라 숱이 0.01 ± 0.005 mm/mm로 기록되었다. 4.2.3 단계에서 설명된 바와 같이, 코리 샘플의 이미지 처리 워크플로우와 로터리 툴(예를 들어, Dremel)을 사용하여 조달된 하나의 이미지 처리 워크플로우를 비교하는 대표적인 수치는 도 7에서볼 수 있다. 일반적인 회전 도구를 사용하여 샘플 절단은 코로이드 샘플과 비교했을 때 운하(Ca.N) 및 lacunae(Lc.N) 및 평균 운하 직경(Ca.Dm), 운하 부피(Ca.V) 및 피질 다공성(Ca.V/TV)의 증가를 나타냈다. 이러한 차이점 중 일부는 개인 간의 뼈 미세 구조 적 변화로 인해 발생할 수 있지만, 로터리 도구 데이터 집합에서 추출된 운하와 라쿠나인의 수가 많을 가능성이 있는 것은 스캔 아티팩트 및소음(그림 7)으로인해 인위적으로 증가할 가능성이 높았다. 각 샘플에 대해 4.2.3.9 단계에서 수집된 다공성 데이터는 표 1에있습니다. 코링 프로토콜은 SRμCT 스캔에서 관찰된 아티팩트를 감소시지만, 직사각형 뼈 블록실험(그림 7A)에서낮은 품질의 유물이 담긴 수치가 다각적인 문제를 나타낸다는 점은 주목할 가치가 있다. 특정 아티팩트(예: 위상 대비 신호)는 싱크로트론 시설 또는 빔라인별 문제로 인해 발생했을 수 있습니다. 실험의 대표적인 세트와 관련수치(그림 7A, 7B)에대한 스캔 파라미터는 보충재료(표 S1, S2)에서찾을 수 있다.
코어 샘플에서 수집한 Synchrotron 마이크로 CT 이미지는 줄무늬 아티팩트를 포함하여 위에서 설명한 바와 같이 스캔 아티팩트를 성공적으로 억제했습니다. 후속 이미지 처리는 피질 뼈 마이크로 아키텍처의 시각화를 개선하는 기술의 잠재력을 확인했습니다. 예를 들어, 광물화 차이, 골경계의 개선된 묘사, 혈관 관 내의 연조직의 일관된시각화(그림 8C, 8D)가관찰되었다. 후자는 공공이 완전히 채워지지 않기 때문에 운하 내의 연조직의 부분 적인 시각화로 인해 다공성 및 모공 두께의 부정확한 계산을 초래할 수 있기 때문에 이미지 처리에 매우 중요합니다. 골구세포 라쿠나에 의한 경계도 배금감소로 개선되어 형상 파라미터의 정량화를 가능하게 했다. 설명된 코링 기술의 잠재적인 이점은 FOV에 있는 견본을 중심으로 의 용이성, 감소된 분석 요구 사항 및 혈관 관 내의 연조직의 일관된 가시화를 포함합니다.
유사한 절차는 고압 암석 변형 실험을 위해 정형 외과18,다결정 마그네사이트19 및 기타 지질 학적 재료15,16,17의 단일 결정코어에 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 실험은 방향별 강점을 결정하기 위해 단일 결정18 또는 다결정 바위19의 결정축 또는 정렬된 결정과 비교하여 특정 방향으로 코어가 필요합니다. 위에서 설명한 접근법은 먼저 지향성 슬래브를 만드는 데 사용되었으며, 그 후 일련의 변형 실험을 위해 여러 균일한 원통형 코어를 수집합니다. 이러한 방법은 뼈, 세라믹 또는 안경과 같은 모든 단단한 재료의 코어를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 상기 방법론은 생물학적 인류학자에 의해 피질 뼈 내의 특정 영역과 관련 생체 역학(예: 장력/압축) 축에서 코어를 평가하도록 적용할 수 있다.
그림 1. 왼쪽 전방 에서 원통형 VOI 인간의 중간 샤프트 대퇴골. 좌측 전방 인간 중간샤프트 대퇴골(21세여성)(A)으로부터전체 코어의 단일 SRμCT 를 재구성하고, 상급(B) 및 전방시야(C)로부터원통형 VOI의 3D 렌더링이 가시화된다. 투영은 0.9 μm에서 촬영되었으며, 혈관 운하는 빨간색과 골다세포 라쿠나에 회색으로 강조되어 있습니다. 스케일 바는 0.25mm(A) 및0.02mm(B,C)를나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 중간 샤프트 대퇴 샘플 (5mm 두께)은 열 에폭시 (재료의 표 참조)와 유리 현미경 슬라이드에 장착유리 슬라이드 척에 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 단면 전에 저속 단면 톱(재료 표 참조)의 회전암에 고정된 장착된 시편이 있는 유리 슬라이드 척. 톱날과 단면 속도(RPM)를 기준으로 회전암의 측면 위치는 LCD 디스플레이의 위쪽 및 하단 행에 각각 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 알루미늄 주석에 장착된 5mm 대퇴 구간은 코어링을 준비하기 위해 고정 클램프를 사용하여 XY 밀 드릴 프레스 기계 테이블에 고정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 고안된 프로토콜(A)에 사용되는 밀 드릴 프레스. 화살표는 드릴 비트가 샘플이나주석(B)의바닥을 통해 깊이 침투하는 것을 방지하는 깊이 리미터를 식별합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 전방 측면에서 코어 조달 다음 5mm 대퇴 골 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 단일 SRμCT는 두 개인에서 왼쪽 대퇴골의 전방 측면의 조각을 재구성. 시편(A)은일반적인 로터리 툴을 사용하여 단면화되었고(B)는여기에 기재된 코어링 방법을 사용하여 조달되었다. 각 슬라이스는 분할된슬라이스(C 및 D)와비교됩니다. 로터리툴(C)으로채집된 시편과 는 달리 코르드샘플(D)에서피질 다공성을 분리하는 용이성을 유의한다. 이것은 각 견본(E 및 F)의혈관 운하의 3D 렌더링에서 추가로 증명됩니다. B 주변의 소음이 분명하고 표본은 FOV를 떠나 이미지 처리 중에 문제가 증가합니다. 패널(D)의스케일 바는패널(A-D)의경우 250 μm을 나타냅니다. 패널(E 및 F)의스케일 바는 각각 700 및 600 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 로터리 툴(A-C)으로 조달된 샘플의 대표 ROI와 여기에 제시된 방법을 사용하여 코어(D-F). 패널(A)및(D)는SRμCT 스캔으로부터 지정된 ROI를 나타낸다. 패널(B)및(E)는혈관 운하 파라미터를 분리하고 추출하는 데 사용되는 처리 단계를 나타낸다. 패널(B)의오른쪽 상단에는 이미지 처리 소프트웨어에 의해 혈관 운하로 분류된 외부 물체(화살표)가 있다. 패널(C)및(F)는라쿠네를 분리하고 추출하는 데 사용되는 가공 단계를 나타낸다. 스케일 바는 모든 패널에 대해 0.1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조직 볼륨 (TV) | 운하 볼륨 (Ca.V) | 운하 표면 (Ca.S) | 피질 다공성 (Ca.V/TV) | 운하 표면에서 조직 볼륨까지(Ca.S/TV) | 평균 운하 직경 (Ca.Dm) | 평균 운하 분리 (Ca.Sp) | 아니요. 운하 (Ca.N) | 아니요. 라쿠나 (Lc.N) | 모공 밀도 (모공/TV) | |
| 단위 | mm³ | mm³ | mm² | % | 1/mm | Μ m | Μ m | # | # | 모공/μm³ |
| 로타리 컷 | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| 코르드(이 방법) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
표 1. 도 8에서 시각화된 로터리 공구 및 코어화된 표본의 4.2.3.9단계에 대한 대표적인 결과. Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, 회전 절단 시료의 모공 및 모공 밀도 의 수뿐만 아니라 혈관 운하와 라쿠네의 증가 수를 유의하십시오. 고르지 않게 절단된 시료에 의해 부분적으로 유도된 스캔 아티팩트는 라쿠나 및 피질 모공의 인위적인 증가에 기여할 가능성이 높다.
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Discussion
제한된 FOV 설정을 갖춘 고해상도 SRμCT 이미징을 위한 균일한 및 원통형 피질 뼈 코어 샘플을 조달하기 위한 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 없었습니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 SRμCT 이미징에 대한 일관되게 크기의 피질 뼈 코어 샘플을 조달하는 방법과 미세 건축 데이터의 후속 정확한 시각화 및 추출에 대한 포괄적인 자습서를 제공함으로써 무효화를 채웁니다. 당사의 프로토콜은 임의 차원의 직선 골격 블록을 절개하는 이전 설명보다 피질 뼈 코어를 조달하기 위한 보다 표준화되고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 핸드헬드 로터리 도구(예를 들어, Dremel)에 의존하여 불규칙한 크기의 뼈 블록을 제거하는 연구자들은 분석 중에 이미징 중에 훨씬 더 긴 샘플 설정 시간을 경험하고 분석 중에 임계값 및 피질 모공 추출에 더 큰 오류를 경험할 수 있습니다. 이러한 불일치는 뼈 샘플 준비, 후속 시각화 및 분석 및 해석 결과와 관련하여 이 표준화된 프로토콜의 필요성과 중요성을 강조합니다.
여기에 설명 된 절차는 일반적으로 생물학적 인류학자 및 고고학자와 같은 뼈 조직을 평가하는 관련 분야의 연구원에 의해 더 적응 될 수 있습니다. 그러나, 기술된 연구 프로토콜을 위해 투병유전학도 고고학/역사적인 뼈 견본은 없습니다. Diagenesis, 지질학에서, 증착 후 물질 (예를 들어, 뼈)의 변경을 말하며 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의한 변화를 포괄할 수있다 29,30. 지하수, 곰팡이 및 기타 미생물 침투는 모두 투석제역할을 하고 뼈 조직미세형성(31)을변경할 수 있다. 이러한 표본은 메틸 메타크릴레이트(MMA) 또는 2부 에폭시 수지에 포함되는 것과 같은 코링 전에 추가적인 절차적 단계를 요구할 수 있다. 대퇴골 블록을 포함시키는 것은 대퇴 피질 뼈의 조밀한 특성으로 인해 설명 된 실험에 필요하지 않았으며, cadaveric 표본이 사망 직후 방부처리되었다는 사실. 깨지기 쉬운 골격 원소와 그 trabeculae (예 : 갈비뼈)를 평가하는 경우, 그러나, 우리는 코링 전에 전체 뼈 블록을 포함하는 것이 좋습니다.
이 연구에서 평가된 모든 뼈 조직은 신선하면서 방부처리되었습니다. 저자는 방부 처리 도중 사용된 화학제품의 특정 조합에 접근할 수 없었습니다, 보존 화학 물질은 일반적으로 포름알데히드, 에탄올, 페놀, 에틸렌 글리콜 및 글루타랄데히드를 포함하지만. 포름알데히드 포화 뼈의 미세 구조의 변화를 문서화하는 법의학 인류학적 데이터는 제한되어 있지만 Freidlander32는 포름알데히드 고정이 Haversian 운하 및 이차 골션을 포함한 특정 기능의 형태를 변경하지 않는다는 것을 입증했습니다. 그러나 포름알데히드 포화도는 충격 강도 및 골절인성(33,34)과같은 비인간적 뼈의 특정 기계적 특성 및 골절특성에대한 효과를 문서화하였다.
우리는 고해상도 X 선 시스템 (SRμCT)로 이미징하기 전에 피질 뼈 샘플을 코팅하는 방법을보고했습니다. 이 방법은 자재와 장비가 현지 하드웨어 상점에서 공급될 수 있고 효율적이며 표본 전체에 걸쳐 균일한 샘플 크기를 보장할 수 있기 때문에 비용 효율적입니다. 기존 문헌이 희소하게 유지되고 준비 및 후속 분석에 관한 중요한 세부 사항이 없기 때문에 SRμCT에 대해 샘플을 조달, 코어링 및 분석하는 방법에 대한 문의를 줄일 수 있기를 바랍니다. 우리의 주요 목표는 고해상도 뼈 화상 진찰 연구를 위한 표준화된 절차로 이 칭응고 프로토콜을 적용하는 연구원을 동기를 부여하는 것입니다. 우리는 또한 우리가이 기술을 개발하는 데 대해 언급 한 어려움이 일반적인 질문을 완화하고 문제 해결에 대한 지침을 제공 할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 논문에 설명된 연구는 캐나다 혁신, 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 서스 캐처 원 대학, 서스 캐처 원 정부, 서부 경제 다각화 캐나다, 캐나다 국립 연구위원회 및 캐나다 보건 연구소의 캐나다 혁신 재단이 지원하는 캐나다 광원의 BMIT 시설에서 수행되었습니다. 저자는 캐나다 광원의 빔 라인 과학자, 특히 아담 웹, 데니스 밀러, 세르게이 가질로프, 닝 주 스카이스캔 SRμCT 및 백색 빔 현미경 시스템의 설정 및 문제 해결에 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 대한 cadaveric 견본에 접근을 위한 Toledo 의과 대학의 대학 및 박사 제프리 웬스트루프에서 베스 달젤에게 감사드립니다. JM Andronowski는 애크런 대학과 형사 사법 목적 부여를위한 법의학 과학의 국립 사법 연구 개발 연구소 (2018-DU-BX-0188)에서 제공하는 창업 연구 기금을 통해 지원됩니다. RA 데이비스는 애크런 대학에서 제공하는 대학원 보조에 의해 지원됩니다. 코링 과 톱질에 사용되는 장비와 공급은 아크론 대학과 NSF가 CW 홀리오크에 EAR-1624242를 부여하는 스타트업 기금에 의해 구입되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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