Summary
يصف هذا البروتوكول تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz الوليدية وعزل الخلايا العظمية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر من خلال هضم الخلايا وتجزئتها ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا العظمية لفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS).
Abstract
إن الخلايا العظمية ، التي كان يعتقد في السابق أنها مقيم سلبي في العظام نظرا لوظيفة وراء الكواليس المتمثلة في استشعار التحميل الميكانيكي ، يتم تسليط الضوء عليها الآن وقد ثبت أن لها وظائف رئيسية متعددة مثل التعديل النشط للمصفوفة خارج الخلية وتشكيل عضو الغدد الصماء مع نظام القناة الجوبية الذي يحيط به إرسال رسائل إلى مواقع بعيدة. نظرا للطرق التي جعلت من الممكن اختبار الخلايا العظمية في المختبر من عزل الخلايا العظمية الأولية إلى خطوط الخلايا الشبيهة بالخلايا العظمية ، تشهد الخلايا العظمية الآن اهتماما مدويا وزيادة في المعرفة حول الهيكل والوظيفة. العديد من جوانب بيولوجيا الخلايا العظمية والتفاعل مع المكونات الجزيئية الأخرى لم يتم اكتشافها بعد. في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل العزل الفعال للخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفأر الوليدية dmp1-topaz ، والتي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في الخلايا العظمية ، من خلال تجزئة الخلايا وبالتالي الحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية بواسطة FACS.
Introduction
الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة نهائيا عن الخلايا السلفية العظمية الأرومية التي أصبحت جزءا لا يتجزأ من المصفوفة المفرزة1. إنها الخلايا الأكثر وفرة والأطول عمرا بين مجموعات الخلايا العظمية. وهي موجودة داخل ثغرات ولها مورفولوجيا نجمية مميزة مع التشعبات التي تمتد عبر قنوات تسمى canaliculi لتشكيل شبكة واسعة من الاتصالات والتبادل الأيضي مع البيئة المحيطة بها وسطح العظام2. تصمم الخلايا العظمية كلا من أدوار بانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم في إعادة تشكيل العظام ، فهي الخلايا الحسية الميكانيكية الأولية التي تمنح التكيف مع التحميل الميكانيكي3 ، وتشارك في توازن الفوسفات4 وتمعدن مصفوفة العظام5 ، وجنبا إلى جنب مع الجهاز الجوفي ، فإنها تعمل كعضو الغدد الصماء الذي يشير إلى الأنسجة البعيدة6.
تقع الخلايا العظمية داخل مصفوفة معدنية ، مما يحد من إمكانية الوصول ويجعل عزلها صعبا ، وبالتالي يعيق التحقيق في المختبر. وصفت إحدى طرق العزل الأولى الخلايا العظمية المعزولة من كالفاريا الدجاج باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بالخلايا العظمية (OB7.3)7 والذي عرف لاحقا بأنه البديل الطائر من PHEX (الجين المنظم للفوسفات مع التماثل مع Endopeptidases على كروموسوم X)8. استخدم باحثون آخرون الهضم المتسلسل للفأر 9 أو عظام الفأرالطويلة 10 للحصول على الكسور الغنية بالخلايا العظمية التي تم الإبلاغ عن نقاء الخلايا العظمية فيها حوالي 70٪ 9. تشمل قيود هذا الإجراء النقاء دون المستوى الأمثل للمزارع الملوثة بأنواع الخلايا الأخرى إلى جانب الخلايا العظمية وأن الخلايا العظمية يمكن أن تتضخم بواسطة خلايا أخرى في الثقافة لأن الخلايا العظمية فقدت القدرة على الانقسام. هذه التحديات تحد من قابلية استخدام الثقافات طويلة الأجل.
للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير خطوط خلايا الخلايا العظمية المختلفة. خط الخلية MLO-Y411 وخط الخلية MLO-A512 هي بشكل ملحوظ خطوط الخلايا الأكثر دراسة على نطاق واسع والتي هي مفيدة لدراسة الخلايا العظمية في المرحلة المبكرة. ومع ذلك ، فهي أقل فائدة لدراسة إشارات الخلايا العظمية الناضجة لأنها تعبر عن مستويات منخفضة من sclerostin و FGF2313 ، وكلاهما علامات الخلايا العظمية الناضجة. خطوط الخلايا الأخرى بما في ذلك IDG-SW3 14 و Ocy45415 ، تعبر عن مستويات عالية من sclerostin و FGF23 وهي مفيدة في دراسة مرحلة الخلايا العظمية المتأخرة. تثبت خطوط الخلايا أنها أدوات بحث مفيدة. ومع ذلك ، فهي لا تأتي بدون قيود لأنها لا تمثل بيولوجيا الخلية الأولية بشكل كامل. تمثل خطوط الخلايا المختلفة مراحل نمو مختلفة من طيف نضج الخلايا العظمية ، وتفشل خطوط الخلايا في تمثيل عدم تجانس الخلايا العظمية الأولية16,17.
للحصول على ثقافات نقية للخلايا العظمية الأولية ، استفاد الباحثون من نموذج الماوس cre الذي يستخدم فيه مروج dmp1 8 كيلو بايت لدفع تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الخلايا العظمية18,19. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة (pOB-Col 2.3- GFP-cyan و DMP1-GFP-topaz) بواسطة Paic et al.19 والفئران المعدلة وراثيا dmp1-topaz بواسطة Nakashhima et al.20 للحصول على مجموعات الخلايا العظمية. حيث استخدموا الهضم المتسلسل و FACS للخلايا العظمية التي تعبر عن GFP للحصول على ثقافات الخلايا العظمية الأولية19,20. تبين أن اتجاه cre في الماوس المراسل dmp1 10-kb Ai9 ، الذي ينشط بروتين tdTomato ، موجود في الخلايا العظمية وبانيات العظم والعضلات والخلايا داخل نخاع العظام. كان لمروج dmp1 8 كيلو بايت نفس نمط التعبير ، ولكن نسبة فقط من بانيات العظم وخلايا نخاع العظم عبرت عن البروتين ، مما يشير إلى أن مروج dmp1 8 كيلو بايت أكثر تحديدا21. على الرغم من ذلك ، يجب تفسير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مروج dmp1 8 كيلو بايت بحذر ، ويجب إجراء ملفات تعريف التعبير الجيني بشكل روتيني باستخدام الخلايا العظمية مقابل العلامات الخاصة ببانيات العظم للتأكد من أن السكان الذين تم الحصول عليهم يتمتعون بدرجة نقاء عالية.
تم العثور على علامات ناقضة العظم OSCAR و Dcstamp في مجموعات الخلايا العظمية غير المستنفدة للدم مقابل الخلايا العظمية المستنفدة ، وقد قادت هذه النتيجة المؤلفين إلى استنتاج أن الهضم الذي تم الحصول عليه من تجزئة 8 كيلو بايت dmp1-topaz alnatal calvaria وفرز GFP ملوثة بخلايا المكونة للدم. كان من الممكن التخفيف من التلوث بالخلايا المكونة للدم عن طريق تشديد بوابة فرز GFP لأن الخلايا المكونة للدم الإيجابية ل GFP كانت لها كثافة GFP أقل بشكل معقول من خلايا اللحمة المتوسطة الإيجابية ل GFP (الخلايا العظمية)22.
ساهمت طرق دراسة الخلايا العظمية في المختبر في الثروة الحديثة من المعلومات حول بيولوجيا الخلايا العظمية. ومع ذلك ، يظل عزل الخلايا العظمية إجراء كثيف العمالة وطويل مع انخفاض إنتاجية الخلايا. الطريقة الموصوفة لهضم العظام باستخدام كولاجيناز و EDTA غالبا ما تصل إلى الكسر 823 ، تستغرق عدة ساعات يتم فيها فرض ضرائب على صلاحية الخلايا العظمية. أفاد الباحثون باستخدام الكسور (2-20125) لفرز الخلايا 20، وأظهروا أن التعبير عن الجينات المرتبطة بالخلايا العظمية مقابل تلك الخاصة ببانيات العظم يؤكد نجاح عزل مجموعات الخلايا العظمية النقية20. في هذه المقالة، نصف عملية الحصول على الكسور (2-5)، ونقارن مردود الخلايا العظمية من كل كسر بدءا من الكسر 1 إلى 8 لتحديد عودة الخلايا العظمية في كل كسر. كما وصفنا تشريح كالفاريا الفأر dmp1-topaz حديثي الولادة والهضم الكالفاري باستخدام كولاجيناز وحمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، بالإضافة إلى تحضير الخلايا ل FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع إجراءات الحيوانات ورعاية الحيوان وفقا لقواعد ولوائح جامعة توهوكو.
1. تشريح حديثي الولادة dmp1-توباز الماوس كالفاريا
- بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الجراء البالغة من العمر 6 إلى 20127 يوما من الفئران C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J. القتل الرحيم للفئران باستنشاق الأيزوفلوران بنسبة 5٪ ثم نقل الجراء إلى 70٪ إيثانول.
- نقل الجرو القتل الرحيم إلى طبق ثقافة غير معالج.
- باستخدام المقص والملاقط ، أمسك الجلد عند قاعدة الجمجمة وقم بعمل شق.
- باستخدام الشق الأول كنقطة انطلاق ، قم بقطع كلا الجانبين الجانبي للجمجمة أمام الأذنين ، وإزالة الجلد ، وفضح الكالفاريا.
- امسك الرأس من جسر الأنف وقطع الكالفاريا على طول خياطة اللمبويد. قطع على طول الحواف الجانبية للعظام الجدارية وتمديدها لتشمل الجزء الأمامي.
- افصل الكالفاريا عن أنسجة المخ الكامنة.
ملاحظة: لضمان كالفاريا عظمية نظيفة مع الحد الأدنى من ارتباط الأنسجة الرخوة لا تقطع عميقا في العظام. كمرجع ، يجب أن يكون المرء قادرا على رؤية ظل المقص تحت العظم. - نقل كالفاريا إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 في جميع أنحاء البروتوكول). تأكد من أن الجزء المقعر متجها لأعلى.
2. تجزئة كالفاريا الفأر حديثي الولادة
- نقل ما يصل إلى 5 كالفاريا إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز 2 ملغ/مل. استخدم محلول كولاجيناز طازج محضر قبل الاستخدام مباشرة.
- لتحضير محلول كولاجيناز طازج ، أضف مسحوق كولاجيناز إلى مخزن العزل (70 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول NaHCO 3 ، 60 مللي متر سوربيتول ،3 مللي مول K 2 HPO4 ، 1 مللي مول CaCl 2 ، 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 5 مجم / مل جلوكوز و 25 مللي مول HEPES) عند2مجم / مل. قم بإذابة مسحوق الكولاجين على محرك مغناطيسي.
- قم بتشغيل محلول كولاجيناز من خلال وحدة مرشح معقمة 0.22 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل واحتفظ به على الجليد طوال البروتوكول.
- احتضان الكالفاريا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة للحصول على الكسر 1.
- تخلص من هضم الجزء 1 ، واغسل الكالفاريا ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وتخلص من الغسيل.
- احتضان كالفاريا في 5 مل من 5 مللي مول من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) الذي يحتوي على 1 ملغ / مل BSA في PBS ، PH 7.4 عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة.
- اجمع الهضم في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل الكالفاريا ب 5 مل من برنامج تلفزيوني وأضف محلول الغسيل إلى الهضم.
ملاحظة: في كل نقطة من جمع الهضم والغسيل ، ماصة العظام في محلولها لفصل الخلايا عن العظام ومنع الازدواجية وتجمعات الخلايا. - للحصول على الكسر 2 ، قم بهضم جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 8 مل من α الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين G ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. البذور على طبق ثقافة 10 سم. احتضان الكسر 2 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- احتضان كالفاريا في 5 مل من محلول كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة.
- لجمع الكسر 3، كرر الخطوات 2.5-6. احتضان الجزء 3 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، ستصبح العظام أصغر ، وسيتم تقليلها إلى شظايا. لضمان عدم استنشاق أي عظام عن طريق الخطأ في الهضمات، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا في هذه العملية، استخدم ماصة صغيرة الأطراف لجمع الملخصات (أطراف ماصة 1000-200 ميكرولتر). - احتضان كالفاريا في 5 مل من محلول كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة.
- لجمع الكسر 4، كرر الخطوات 2.5-6. احتضان الكسر 4 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- احتضان الكالفاريا في 5 مل من 5 ملليمتر EDTA تحتوي على 1 ملغ / مل BSA في PBS (درجة الحموضة 7.4) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على شاكر عند 300 دورة في الدقيقة.
- لجمع الكسر 5، كرر الخطوات 2.5-6. احتضان الكسر 5 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2. يمكن تحضير الخلايا العظمية للفرز في نفس اليوم أو استزراعها حتى 24 ساعة قبل الفرز.
3. إعداد الخلايا العظمية لفرز الخلايا المنشطة الفلورية
- نضح وسط كل جزء من الخلية واغسله برفق باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين.
- أضف 5 مل من 0.5٪ Trypsin-EDTA في برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف 5 مل من 10٪ FBS α-MEM وماصة لفصل الخلايا برفق. اجمع الخلايا في كل جزء عن طريق غربلة مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل.
- اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS واجمعها عن طريق غربلة مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- نضح المادة الطافية وأضف 10٪ FBS α-MEM إلى الحبيبات. اضبط تركيز الخلية على حوالي 1 × 107 خلايا / مل.
- قم بتصفية الخلايا في أنبوب شبكي من النايلون 35 ميكرومتر. الخلايا جاهزة الآن ل FACS.
- بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم فوهة بحجم 100 ميكرومتر. يجب أن يتكون سائل التجميع من 10٪ FBS α-MEM. احتفظ بالعينة التي يتم فرزها عند التحريك وعند 4 درجات مئوية طوال الفرز إن أمكن.
- قبل الفرز ، قم بتحسين البوابات لإزالة القطع الأثرية والخلايا عن طريق ضبط منطقة التشتت الجانبي (SSC) ومنطقة التشتت الأمامي (FSC). تخلص من الازدواجيات عن طريق ضبط عرض SSC مقابل ارتفاع SSC ومنطقة FSC مقابل عرض FSC. يجب استخدام الخلايا العظمية السلبية GFP كعنصر تحكم لضبط معلمات أداة الفرز.
- بعد اكتمال جمع الخلايا ، قم بطرد الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا واضبط الرقم حسب الرغبة باستخدام 10٪ FBS α-MEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الغرض من هذا البروتوكول هو إظهار عملية الحصول على مزارع الخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفأر الوليدي dmp1-topaz من خلال عملية تجزئة باستخدام كولاجيناز لتحلل مصفوفة الكولاجين و EDTA لاستخلاب الكالسيوم ، وبعد ذلك يتم تحضير الخلايا ل FACS لفصل الخلايا العظمية عن مجموعات الخلايا الأخرى.
غالبا ما تصف طرق الحصول على الخلايا العظمية الأولية من كالفاريا الفئران الوليدية استخدام الكسور (1-20128) للفرز23. لاختبار كفاءة هذه الطريقة ، قمنا بمقارنة إنتاجية الخلايا العظمية التي تم الحصول عليها من فأر واحد dmp1-topaz calvaria ، بدءا من الكسور من 1 إلى 8. تم فرز الكسور 1-8 بشكل منفصل لتحديد النسبة المئوية وإنتاجية الخلايا العظمية من كل كسر. بعد الفرز ، قمنا بزراعة الخلايا العظمية لمدة 24 ساعة على لوحة 96 بئرا لمقارنة كثافة الخلايا المصنفة. تبين أن كثافة الخلايا العظمية في الكسور 2-55 أعلى من كثافة الكسر 1، وتبدأ كثافة الخلايا العظمية في الانخفاض بشكل ملحوظ في الكسور 6 و7 و8 (الشكل 1أ).
على الرغم من أن النسبة المئوية للخلايا العظمية التي تم الحصول عليها بين جميع الكسور ليست ذات دلالة إحصائية (الشكل 1 ب) ، فإن كثافة الخلايا العظمية تختلف اختلافا كبيرا. أبلغ الباحثون20 عن استخدام الكسور 2-55 لعزل الخلايا العظمية عبر FACS ، ونوضح في الشكل 1 أن استخدام الكسور 2-20125 يحسن عملية الحصول على الخلايا العظمية ويقلل من وقت الفرز.
يوضح الشكل 2 عدد الخلايا واستراتيجية البوابات التي تمارس لعزل الخلايا الموجبة ل GFP عن الخلايا السالبة GFP التي تم فيها استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال تجزئة كالفاريا الفأر سالبة GFP كعنصر تحكم. تم تحليل الخلايا العظمية التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة للتعبير الجيني عن Dmp1 و SOST ، وهما علامتان معروفتان بالخلايا العظمية. تكون تعبيرات Dmp1 و SOST mRNA أعلى في الخلايا العظمية عند مقارنتها بالكسر 2 قبل الفرز ، والذي يعرف باسم جزء بانيات العظم العالي (الشكل 3 أ). يوضح الشكل 3 ب مورفولوجيا خلية عظمية موجبة ل GFP تحتفظ بشكل نجمي مع زوائد شجيرية تمتد من جسم الخلية المستزرع لمدة 24 ساعة على طبق استزراع بلاستيكي بعد الفرز.
الشكل 1: كفاءة تجزئة الخلايا العظمية. (أ) صور مجهرية لكثافة الخلايا العظمية من الكسور 1-20128 المصنفة على صفيحة مكونة من 96 بئرا تم التقاطها بعد 24 ساعة من هذا النوع. الكسور 2-20125 لها كثافة خلايا أعلى من الكسور 1 و6-20128. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) النسبة المئوية للخلايا العظمية التي تم الحصول عليها من الكسور 1-20128 كما تم قياسها بواسطة برنامج مقياس التدفق الخلوي. النتائج مستمدة من ثلاث تجارب تمثيلية منفصلة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل الخلايا العظمية الإيجابية ل GFP عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية. تمثل اللوحة العلوية الخلايا المعزولة من كالفاريا C57Bl / 6J سالبة GFP كعنصر تحكم في عتبة GFP. تمثل اللوحة السفلية عدد الخلايا والتحكم في البوابات التي تمارس لعزل الخلايا العظمية الإيجابية ل GFP عن الخلايا السلبية GFP في الجزء 2 الذي تم الحصول عليه من كالفاريا الفأر dmp1-topaz. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الخلايا العظمية بعد الفرز. (أ) تعبير mRNA النسبي ل Dmp1 و SOST لخلايا الكسر 2 المزروعة لمدة 24 ساعة والخلايا العظمية المزروعة لمدة 24 ساعة بعد الفرز. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تم الكشف عن فروق إحصائية باستخدام اختبار t للطالب: * p < 0.05, **p < 0.01. (ب) صورة مجهرية لخلية عظمية تحتفظ بالزوائد الشجيرية تمتد للخارج من جسم الخلية المزروعة لمدة 24 ساعة بعد الفرز. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كانت أول خلية عظمية معزولة من دجاج كالفاريا7 معزولة باستخدام (OB7.3) أو البديل الطيار من PHEX. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة بسبب توافر الأجسام المضادة القابلة للتطبيق ، حيث يجب تصنيع الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا العظمية والتي هي أيضا خاصة بالنوع. استخدم الباحثون تعديلا مختلفا للعملية الأنزيمية المتسلسلة للحصول على الخلايا العظمية من عظام الفئران والفئران الطويلة. تم تحديد نقاء هذه الثقافات المبلغ عنها بحوالي 70٪ 9. سمح تطوير نموذج الفأر cre بهندسة الخلايا العظمية ، والتي تعبر عن GFP على سطحها. تم استخدام نموذج الماوس هذا ، جنبا إلى جنب مع FACS ، للحصول على ثقافات نقية للخلايا العظمية الأولية20.
نحذف استخدام الكسور 1 والكسور 6-20128 لأن كميات قليلة من الخلايا العظمية تخرج في هذه الكسور. استخدام الكسور 2-20125 يعطي أفضل عائد ممكن من الخلايا العظمية على أقصر وقت معالجة ؛ هذا يحد من وقت التعامل مع الخلايا العظمية ويعمل على منع موت الخلايا أو تغيير محتمل في إشارات الخلية نتيجة للإجهاد الذي تتعرض له الخلية أثناء التجزئة. نقوم أيضا بزراعة الخلايا العظمية لمدة 24 ساعة قبل الفرز ، والتي تستبعد افتراضيا الخلايا المعلقة غير الملتصقة (الخلايا المكونة للدم) أثناء تحضير الفرز. هذا يقلل من التلوث بالخلايا المكونة للدم التي تعبر عن GFP22. يستفيد سير العمل المقدم في هذا البروتوكول من الطرق المنشورة مسبقا23 ويقصر وقت الفرز مما يسمح باستعادة الخلايا العظمية بكفاءة وسرعة مع الحد الأدنى من التلوث.
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحصول على كالفاريا عظمية نظيفة وتقليم الأنسجة الرخوة من الدماغ أو النسيج الضام المرتبط بالعظام للحد من تلوث الخلايا الملتصقة (الخلايا الليفية والخلايا العصبية). أيضا ، يعد سحب الخلايا أثناء الخطوات التي تتضمن الحصول على الهضم وغسله أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتم قراءة مجاميع الخلايا والزوجات على أنها نفايات أثناء الفرز وستساهم في انخفاض إنتاجية الخلايا العظمية.
يمكن فرز الخلايا العظمية دون ثقافة مسبقة. ومع ذلك ، هذا يعني أنه يجب فرز عدد أكبر من الخلايا ، مما يزيد من وقت الفرز ويزيد من فرصة تلوث المكونة للدم. يمكن التخفيف من ذلك عن طريق تطبيق الفرز المسبق لاستنفاد الخلايا المكونة للدم. ومع ذلك ، فإن هذا أمر مرهق ولا يوصى به للتحليل المختبري الروتيني والدفعي22. قد تنشأ مشكلة أثناء الفرز بسبب وجود مجاميع الخلايا الكبيرة ومضاعفة تسد تدفق السوائل في آلة الفرز. في بروتوكولنا ، لم تكن هذه مشكلة ، ولكن يمكن حل ذلك عن طريق تقليل محتوى FBS للمخزن المؤقت للفرز (أقل من 10٪).
هذا البروتوكول لا يأتي دون قيود. تستخدم هذه الطريقة الخلايا العظمية للفأر ، والتي لا تشبه تماما الخلايا العظمية البشرية. هذا يقيد توسيع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال دراسة الخلايا العظمية الفئران إلى نتائج سريرية ذات مغزى. تم وصف بروتوكولات عزل الخلايا العظمية البشرية24 ، ويتم تشجيع الباحثين على استخدام أنواع الخلايا التي تخدم أهدافهم على أفضل وجه. كما هو الحال مع البروتوكولات الأخرى ، فإن كميات الخلايا العظمية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول محدودة ، وهناك حاجة إلى عدد كبير من الفئران للتحليل على نطاق واسع ، ومع ذلك ، من خلال تقليل الوقت اللازم لإعداد وفرز الخلايا العظمية ، يمكن الحصول على كميات أكبر من الخلايا في إطار زمني واحد.
يمكن استخدام الخلايا العظمية التي تم الحصول عليها من خلال هذه العملية لمزيد من الثقافة والثقافة المشتركة ، وتحليل التعبير الجيني ، وتحليل المصب لتنشيط / تثبيط الركيزة ، والتحقيق الجزيئي ، وتطبيقات التلطيخ. يمكن أيضا استخدام الخلايا الأولية لبناء نموذج مصفوفة الخلايا العظمية 3D يشبه البيئة العظمية الأصلية لدراسة النقل الميكانيكي والاستشعار الميكانيكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة JSPS KAKENHI من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (رقم 19K10397 إلى H.K. ورقم 18K09862 إلى I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).
- Bonewald, L. F.
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Lane, N. E., et al. Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).
- Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
- Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
- Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
- Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
- Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Spatz, J. M., et al. The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro. The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).
- Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
- Sandberg, R., Ernberg, I. Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).
- Kalajzic, I., et al. Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene. Bone. 35 (1), 74-82 (2004).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
- Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
- Kalajzic, I., et al. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology. Bone. 54 (2), 296-306 (2013).
- Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes. Bone. 72, 34-42 (2015).
- Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).
- Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. An improved method to isolate primary human osteocytes from bone. Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).
