Summary
该协议描述了新生儿dmp1-黄玉小鼠颅骨的解剖和通过细胞消化和分级分离表达绿色荧光蛋白的骨细胞，以及用于荧光活化细胞分选（FACS）的骨细胞制备。
Abstract
骨细胞曾经被认为是骨骼的被动驻留，具有感知机械负荷的后台功能，现在被带到聚光灯下，并已被证明具有多种主要功能，例如主动修改细胞外基质并与腔隙小管系统形成内分泌器官，该系统包围它向远处发送信息。由于可以从分离原代骨细胞到骨细胞样细胞系的体外测试骨细胞的方法，骨细胞现在正经历着巨大的兴趣和对结构和功能的知识激增。骨细胞生物学的许多方面以及与其他分子成分的相互作用尚未被发现。在该协议中，我们详细描述了从dmp1-topaz新生小鼠颅骨中有效分离原代骨细胞，其通过细胞分离并随后通过FACS获得原代骨细胞的培养物在骨细胞中表达绿色荧光蛋白。
Introduction
骨细胞是来自成骨细胞祖细胞的终末分化细胞，嵌入其分泌基质1。它们是骨细胞群中最丰富和最长寿的细胞。它们位于腔隙内，具有特征性的星状形态，树突通过称为小管的通道延伸，形成与周围环境和骨表面的广泛沟通和代谢交换网络2。骨细胞在骨重塑中的作用是成骨细胞和破骨细胞，它们是赋予适应机械负荷的主要机械感觉细胞3，参与磷酸盐稳态4和骨基质矿化5，并与腔隙小管系统一起充当内分泌器官，向远处组织发出信号6。
骨细胞位于矿化基质内，这限制了可及性并使其分离具有挑战性，从而阻碍了体外研究。最早的分离方法之一描述了使用骨细胞特异性单克隆抗体（OB7.3）7从鸡颅骨中分离出骨细胞，该抗体后来被称为PHEX（PHosphate调节基因与X染色体上的内肽酶同源）的禽变体8。其他研究人员使用大鼠9或小鼠10长骨的顺序消化来获得富含骨细胞的部分，其中骨细胞纯度据报道约为70%9。该程序的局限性包括被骨细胞以外的其他细胞类型污染的培养物纯度欠佳，并且由于骨细胞已失去分裂能力，骨细胞可能被培养物中的其他细胞过度生长。这些挑战限制了长期文化的可用性。
为了克服这些限制，开发了不同的骨细胞系。MLO-Y4细胞系11和MLO-A5细胞系12是研究最广泛的细胞系，可用于研究早期骨细胞;然而，它们对于研究成熟骨细胞信号传导不太有用，因为它们表达低水平的硬化素和FGF2313，两者都是成熟的骨细胞标志物。其他细胞系包括IDG-SW3 14和Ocy45415，表达高水平的硬化素和FGF23，可用于研究晚期骨细胞阶段。细胞系被证明是有用的研究工具;然而，它们并非没有限制，因为它们不能完全代表原代细胞的生物学。不同的细胞系代表骨细胞成熟谱的不同发育阶段，细胞系不能代表原代骨细胞的异质性16,17。
为了获得原代骨细胞的纯培养物，研究人员利用了CRE小鼠模型，其中8kb dmp1启动子用于驱动骨细胞中的绿色荧光蛋白（GFP）表达18,19。Paic等人的双转基因小鼠（pOB-Col 2.3-GFP-青色和DMP1-GFP-托帕石）19和Nakashima等人的dmp1-黄玉转基因小鼠已被用于获得骨细胞群。其中他们采用表达GFP的骨细胞的顺序消化和FACS来获得原代骨细胞的培养物19,20。激活tdTomato蛋白的10 kb dmp1报告小鼠Ai9中的cre方向被证明存在于骨髓内的骨细胞，成骨细胞，肌肉和细胞中。8 kb dmp1启动子具有相同的表达模式，但只有一部分成骨细胞和骨髓细胞表达该蛋白，这表明8 kb dmp1启动子更具特异性21。尽管如此，应谨慎解释使用8 kb dmp1启动子获得的结果，并且应常规使用骨细胞与成骨细胞特异性标记进行基因表达谱，以确保获得的群体具有足够高的纯度。
破骨细胞标志物OSCAR和Dcstamp在造血未耗尽与缺氧骨细胞群体中发现，这一发现使作者得出结论，从8 kb dmp1-黄玉新生儿颅骨分馏和GFP分选中获得的消化物被造血细胞污染。造血细胞的污染可以通过收紧GFP分选门来减轻，因为GFP阳性造血细胞的GFP强度比GFP阳性间充质细胞（骨细胞）低22。
体外研究骨细胞的方法为最近关于骨细胞生物学的丰富信息做出了贡献。然而，骨细胞分离仍然是一个劳动密集型和漫长的过程，细胞产量低。所描述的使用胶原酶和EDTA的骨消化方法通常高达823级分，需要几个小时，其中骨细胞活力被征税。研究人员报告使用级分（2\u20125）进行细胞分选20，并表明与骨细胞相关的基因与成骨细胞相关的基因的表达谱证实了分离纯骨细胞群的成功20。在本文中，我们描述了获得分数（2\u20125）的过程，并比较了从分数1到8开始的每个分数的骨细胞产量，以确定每个分数中骨细胞的返回。我们还描述了使用胶原酶和乙二胺四乙酸（EDTA）解剖新生dmp1-topaz小鼠颅骨和颅骨消化，以及制备FACS细胞。
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Protocol
所有动物程序和动物护理均按照东北大学的规章制度进行。
1.解剖新生dmp1-黄玉小鼠颅骨
- 对于该协议，使用 6\u20127 天龄的 C57BL/6-Tg（Dmp1-Topaz）1Ikal/J 小鼠幼崽。用5%异氟醚吸入对小鼠实施安乐死，然后将幼崽转移到70%乙醇中。
- 将安乐死的幼犬转移到未经处理的培养皿中。
- 用剪刀和镊子抓住头骨底部的皮肤并做一个切口。
- 以第一个切口为起点，在耳朵前面颅骨的两侧切开，去除皮肤，露出颅骨。
- 握住鼻梁的头部，沿着λ样缝合线切开颅骨。沿着顶骨的侧边缘切割，并将其延伸至包括额部。
- 将颅骨与下面的脑组织分开。
注意：为确保清洁的骨性颅骨和最少的软组织附着，请勿深入骨骼;作为参考，人们应该能够看到骨头下面剪刀的影子。 - 将钙质转移到磷酸盐缓冲盐水中（PBS，整个方案中的pH 7.4）。确保凹面朝上。
2.新生小鼠颅骨的分馏
- 将多达 5 个颅骨转移到含有 5 mL 2 mg/mL 胶原酶溶液的 50 mL 锥形管中。使用前准备的新鲜胶原酶溶液。
- 要制备新鲜的胶原酶溶液，将胶原酶粉末加入分离缓冲液（70 mM NaCl、10 mM NaHCO 3、60 mM 山梨糖醇、3 mMK2 HPO4、1 mM CaCl 2、1 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA）、5 mg/mL 葡萄糖和 25 mM HEPES）中，浓度为2 mg/mL。将胶原酶粉末溶解在磁力搅拌器上。
- 将胶原酶溶液通过0.22μm无菌过滤单元运行到50 mL管中，并在整个方案中将其保持在冰上。
- 将Calvaria在37°C下以300rpm在摇床上孵育20分钟以获得馏分1。
- 丢弃馏分 1 的消化物，用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤钙质并丢弃洗涤液。
- 将钙瓦里亚在含有1mg / mL BSA的5mM乙二胺四乙酸（EDTA）中的PBS中孵育，PH 7.4在300rpm的振荡器上孵育15分钟。
- 将消化物收集在 50 mL 锥形管中。用 5 mL PBS 洗涤颅骨，并将洗涤溶液添加到消化液中。
注意：在收集消化物和洗涤的每个点，将骨头移入其溶液中以将细胞与骨分离并防止双峰和细胞聚集。 - 为了获得馏分2，将消化物在4°C下以300× g 离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于含有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的 8 mL α最低必需培养基 （MEM） 中。在10厘米培养皿上播种。将馏分2在37°C下在5%CO2下孵育。
- 将Calvaria在37°C的5mL胶原酶溶液中以300rpm在摇床上孵育20分钟。
- 要收集分数 3，请重复步骤 2.5-6。将级分3在37°C下在5%CO2下孵育。
注意：此时，骨骼会变小，并减少到碎片。为确保不会意外吸入消化物中的骨头，从而导致在此过程中细胞丢失，请使用小型吸头移液器收集消化物（1000\u2012200 μL 移液器吸头）。 - 将Calvaria在37°C的5mL胶原酶溶液中以300rpm在摇床上孵育20分钟。
- 要收集分数 4，请重复步骤 2.5-6。将级分4在37°C下在5%CO2下孵育。
- 将Calvaria在5mL含有1mg / mL BSA的5mM EDTA中的PBS（pH 7.4）在37°C下以300rpm的振荡器孵育15分钟。
- 要收集分数 5，请重复步骤 2.5-6。将级分5在37°C下在5%CO2下孵育。骨细胞可以在同一天准备分选，也可以在分选前培养长达24小时。
3. 用于荧光活化细胞分选的骨细胞制备
- 吸出每个细胞级分的培养基，并用 10 mL PBS 轻轻洗涤两次。
- 在PBS中加入5mL的0.5%胰蛋白酶-EDTA，并将细胞在37°C孵育5分钟。 加入 5 mL 10% FBS α-MEM 并移液器以轻轻分离细胞。通过将 40 μm 细胞过滤器筛入 50 mL 锥形离心管中，将每个级分中的细胞合并。
- 用 10 mL PBS 洗涤细胞，并通过 40 μm 细胞过滤器筛入 50 mL 锥形离心管中收集。将细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 吸出上清液并向沉淀中加入10%FBS α-MEM。将细胞浓度调节至约 1 x 107 个细胞/mL。
- 在35μm尼龙网盖管中过滤细胞。这些牢房现已准备好进行FACS。
- 对于此协议，请使用100μm尺寸的喷嘴。收集液应由10%的FBS α-MEM组成。保持正在搅拌分选的样品，如果可能的话，在整个分选过程中保持在4°C。
- 在排序之前，优化门控，通过调整侧向散射 （SSC） 区域和前向散射 （FSC） 区域来去除伪影和细胞。通过调整 SSC 宽度与 SSC 高度和 FSC 面积与 FSC 宽度来消除双峰。GFP阴性骨细胞应用作对照，以调整分选仪器的参数。
- 细胞收集完成后，将细胞在4°C下以300× g 离心10分钟。用PBS清洗细胞。将细胞在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 重新悬浮细胞并使用10%FBS α-MEM根据需要调整数量。
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Representative Results
该协议的目的是通过分离过程从dmp1-topaz新生小鼠颅骨中获得原代骨细胞培养物的过程，该过程使用胶原酶降解胶原基质和EDTA进行钙螯合，之后准备用于FACS的细胞以将骨细胞与其他细胞群分离。
从新生小鼠颅骨获得原代骨细胞的方法通常描述使用馏分（1\u20128）进行分类23。为了测试该方法的效率，我们比较了从组分1到8开始的从dmp1-topaz小鼠颅骨中获得的骨细胞产量。对馏分1-u20128进行单独分类，以确定每个馏分中骨细胞的百分比和产量。分选后，我们将骨细胞在96孔板上培养24小时，以比较接种细胞的密度。部分 2\u20125 中的骨细胞密度高于部分 1，并且部分 6、7 和 8 中的骨细胞密度开始显着降低（图 1A）。
尽管在所有部分中获得的骨细胞百分比没有统计学意义（图1B），但骨细胞的密度差异很大。研究人员 20 报告了使用级分 2\u20125 通过 FACS 分离骨细胞，我们在 图 1 中显示，使用级分 2\u20125 优化了获取骨细胞的过程并减少了分选时间。
图2 显示了用于从GFP阴性细胞中分离GFP阳性细胞的细胞数量和门控策略，其中通过分馏获得的GFP阴性小鼠颅骨的细胞用作对照。分析通过该方法获得的骨细胞的Dmp1和SOST的基因表达，它们是已知的骨细胞标志物。与预分选级分2（称为高成骨细胞级分）相比，骨细胞中的Dmp1和SOST mRNA表达更高（图3A）。 图3B 显示了GFP阳性骨细胞的形态，该骨细胞保持星状形状，树突从细胞体延伸，在塑料培养皿上培养24小时。
图1：骨细胞分离的效率。 （A） 接种在 96 孔板上的级分 1\u20128 骨细胞密度的显微图像，该图像在 24 小时后捕获。馏分 2\u20125 的像元密度高于馏分 1 和 6\u20128。比例尺 = 100 μm。 （B） 流式细胞仪软件测量的从级分 1\u20128 获得的骨细胞百分比。结果来自三个独立的代表性实验。数据以平均值±标准差表示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过荧光活化细胞分选分离GFP阳性骨细胞。 上图表示从GFP阴性C57Bl / 6J同窝伴侣颅骨中分离的细胞作为GFP阈值对照。下图表示从dmp1-黄玉小鼠颅骨获得的级分2中分离GFP阳性骨细胞的细胞数量和门控控制。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：分选后的骨细胞表征。 （A）分选后培养24小时的部分2细胞和培养24小时的骨细胞的Dmp1和SOST的相对mRNA表达。数据以平均值±标准差表示。使用学生 t 检验检测统计差异：* p < 0.05，**p < 0.01。（B）骨细胞保留树突的显微镜图像，从细胞体向外延伸，在分选后培养24小时。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
第一个分离的骨细胞来自使用（OB7.3）或PHEX的禽变种分离的鸡颅骨7 ;然而，这种方法受到可行抗体可用性的限制，因为必须制造具有特异性的骨细胞特异性抗体。研究人员使用顺序酶促过程的不同修饰从小鼠和大鼠长骨中获得骨细胞;据报道，这些培养物的纯度设定为约70%9。cre小鼠模型的发展允许工程骨细胞，其在其表面表达GFP。该小鼠模型与FACS一起用于获得原代骨细胞20的纯培养物。
我们省略了分数 1 和分数 6\u20128 的使用，因为这些分数中只有少量的骨细胞脱落。使用馏分 2\u20125 可在最短的处理时间内获得最佳的骨细胞产量;这限制了骨细胞的处理时间，并有助于防止细胞死亡或由于细胞在分离过程中受到的压力而导致的细胞信号传导可能改变。我们还培养骨细胞进行24小时预分选，默认情况下，在分选制备过程中排除非贴壁悬浮细胞（造血细胞）。这最大限度地减少了表达GFP22的造血细胞的污染。该协议中提供的工作流程利用了先前发表的方法23 并缩短了分类时间，允许以最小的污染高效快速地恢复骨细胞。
该方案中的关键步骤包括获得干净的骨颅骨和修剪附着在骨骼上的大脑或结缔组织的软组织，以限制贴壁细胞（成纤维细胞和神经细胞）的污染。此外，在包括获取和洗涤消化物在内的步骤中移液细胞至关重要，因为细胞聚集体和双峰在分选过程中被读取为废物，并会导致骨细胞产量低。
骨细胞可以在没有先前培养的情况下进行分类。然而，这意味着必须分选更多的细胞，从而增加了分选的时间并增加了造血污染的机会。这可以通过应用造血细胞耗竭预分拣来缓解。然而，这很费力，不建议用于常规和批量实验室分析22。由于存在大细胞聚集体和双峰堵塞分拣机的流体流动，分拣时可能会出现问题。在我们的协议中，这不是问题，但这可以通过减少排序缓冲区的FBS含量（小于10%）来解决。
该协议并非没有限制。这种方法利用小鼠骨细胞，其不完全类似于人类骨细胞。这限制了通过研究小鼠骨细胞获得的结果扩展到有意义的临床结果。已经描述了分离人类骨细胞的方案24，鼓励研究人员使用最符合其目标的细胞物种。与其他方案一样，使用该方案获得的骨细胞数量是有限的，并且需要大量小鼠进行大规模分析，但是，通过减少制备和分选骨细胞所需的时间，可以在单个时间范围内获得更多的细胞。
通过该过程获得的骨细胞可用于进一步培养和共培养、基因表达分析、底物活化/抑制的下游分析、分子探测和染色应用。原代细胞还可用于构建类似于天然骨细胞环境的3D骨细胞基质模型，用于研究机械转导和机械传感。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会的JSPS KAKENHI资助（香港第19K10397号和I.M.第18K09862号）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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