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Biology

जीएफपी-व्यक्त ओस्टियोसाइट्स के मुराइन कैल्वरियल फ्रैक्शनेशन के माध्यम से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स प्राप्त करना

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61513
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के लिए ओस्टियोसाइट तैयारी के अलावा, सेल पाचन और फ्रैक्शनेशन के माध्यम से हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले नवजात डीएमपी 1-टोपाज़ माउस कैल्वेरिया के विच्छेदन और ओस्टियोसाइट्स के अलगाव का वर्णन करता है।

Abstract

ओस्टियोसाइट, जिसे एक बार यांत्रिक लोडिंग को महसूस करने के बैकस्टेज फ़ंक्शन को देखते हुए हड्डी का निष्क्रिय निवासी माना जाता था, अब सुर्खियों में लाया गया है और इसमें कई प्रमुख कार्य दिखाए गए हैं जैसे कि बाह्य मैट्रिक्स को सक्रिय रूप से संशोधित करना और लैकुनोकैनालिकुलर सिस्टम के साथ एक अंतःस्रावी अंग बनाना जो इसे दूर की साइटों पर संदेश भेजता है। उन तरीकों के कारण जो प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स को अलग करने से ओस्टियोसाइट जैसी सेल लाइनों तक विट्रो में ओस्टियोसाइट का परीक्षण करना संभव बनाते हैं, ओस्टियोसाइट्स अब संरचना और कार्य पर एक शानदार रुचि और ज्ञान की वृद्धि का अनुभव कर रहे हैं। ओस्टियोसाइट जीव विज्ञान और अन्य आणविक घटकों के साथ बातचीत के कई पहलुओं की खोज की जानी बाकी है। इस प्रोटोकॉल में, हम डीएमपी 1-टोपाज़ नवजात माउस कैल्वेरिया से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स के कुशल अलगाव का विस्तार से वर्णन करते हैं, जो सेल फ्रैक्शनेशन के माध्यम से ओस्टियोसाइट्स में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं और बाद में एफएसीएस द्वारा प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की संस्कृतियों को प्राप्त करते हैं।

Introduction

ओस्टियोसाइट्स ओस्टियोब्लास्टिक पूर्वजों से टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं हैं जो उनके स्रावित मैट्रिक्स1 में एम्बेडेड हो गईं। वे हड्डी कोशिका आबादी के बीच सबसे प्रचुर मात्रा में और सबसे लंबे समय तक रहने वाली कोशिकाएं हैं। वे लैकुने के भीतर रहते हैं और डेंड्राइट के साथ एक विशिष्ट स्टेलेट आकृति विज्ञान होता है जो कैनालिकली नामक चैनलों के माध्यम से फैलता है जो उनके आसपास के वातावरण और हड्डी की सतहके साथ संचार और चयापचय विनिमय का एक व्यापक नेटवर्क बनाता है। ओस्टियोसाइट्स अस्थि रीमॉडेलिंग में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों भूमिकाओं को कोरियोग्राफ करते हैं, वे यांत्रिक लोडिंग3 के अनुकूलन प्रदान करने वाली प्राथमिक मेकेनोसेंसरी कोशिकाएं हैं, फॉस्फेट होमियोस्टैसिस4 और हड्डी मैट्रिक्स खनिजकरण5 में शामिल हैं, और लैकुनोकैनालिकुलर सिस्टम के साथ मिलकर, वे दूर के ऊतकों को संकेत देने वाले अंतःस्रावी अंग के रूप में कार्य करतेहैं।

ओस्टियोसाइट्स एक खनिज मैट्रिक्स के भीतर स्थित होते हैं, जो पहुंच को सीमित करता है और उनके अलगाव को चुनौतीपूर्ण बनाता है, इस प्रकार इन विट्रो जांच में बाधा डालता है। पहले अलगाव विधियों में से एक ने ओस्टियोसाइट-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (ओबी 7.3)7 का उपयोग करके चिकन कैल्वेरिया से अलग ओस्टियोसाइट्स का वर्णन किया, जिसे बाद में पीएचईएक्स के एवियन संस्करण के रूप में जाना जाता था (एक्स क्रोमोसोम पर एंडोपेप्टिडेस के होमोलॉजी के साथ फॉस्फेट-विनियमन जीन)8। अन्य शोधकर्ताओं ने ओस्टियोसाइट युक्त अंशों को प्राप्त करने के लिए चूहे 9 या माउस 10 लंबी हड्डियों के अनुक्रमिक पाचन का उपयोग किया, जिसमें ओस्टियोसाइट शुद्धता लगभग70% 9 बताई गई थी। इस प्रक्रिया की सीमाओं में ओस्टियोसाइट्स के अलावा अन्य सेल प्रकारों से दूषित संस्कृतियों की उप-इष्टतम शुद्धता शामिल है और यह कि ओस्टियोसाइट्स को संस्कृति में अन्य कोशिकाओं द्वारा संभावित रूप से अतिरंजित किया जा सकता है क्योंकि ओस्टियोसाइट्स ने विभाजित करने की क्षमता खो दी है। ये चुनौतियां दीर्घकालिक संस्कृतियों की प्रयोज्यता को प्रतिबंधित करती हैं।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, विभिन्न ऑस्टियोसाइट सेल लाइनों को विकसित किया गया था। एमएलओ-वाई 4 सेल लाइन11 और एमएलओ-ए 5 सेल लाइन12 विशेष रूप से सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की जाने वाली सेल लाइनें हैं जो प्रारंभिक चरण ओस्टियोसाइट्स के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं; हालांकि, वे परिपक्व ओस्टियोसाइट सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए कम उपयोगी हैं क्योंकि वे स्क्लेरोस्टिन और एफजीएफ 2313 के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, जिनमें से दोनों परिपक्व ओस्टियोसाइट मार्कर हैं। आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 14 और ओसी454 15 सहित अन्य सेल लाइनें, स्क्लेरोस्टिन और एफजीएफ 23 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं और देर से ओस्टियोसाइट चरण का अध्ययन करने में उपयोगी होती हैं। सेल लाइनें उपयोगी अनुसंधान उपकरण साबित होती हैं; फिर भी, वे सीमाओं के बिना नहीं आते हैं क्योंकि वे प्राथमिक कोशिका के जीव विज्ञान का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। विभिन्न सेल लाइनें ओस्टियोसाइट परिपक्वता स्पेक्ट्रम के विभिन्न विकास चरणों का प्रतिनिधित्व करती हैं, और सेल लाइनें प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स16,17 की विषमता का प्रतिनिधित्व करने में विफल रहती हैं।

प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, शोधकर्ताओं ने क्रे माउस मॉडल का लाभ उठाया जिसमें ओस्टियोसाइट्स18,19 में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति को चलाने के लिए 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर का उपयोग किया जाता है। पाइक एट अल.19 द्वारा दोहरे ट्रांसजेनिक चूहों (पीओबी-कोल 2.3- जीएफपी-सियान और डीएमपी1-जीएफपी-टोपाज) और नाकाशिमा एट अल.20 द्वारा डीएमपी 1-टोपाज ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग ओस्टियोसाइट आबादी प्राप्त करने के लिए किया गया है। जिसमें उन्होंने प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स19,20 की संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए जीएफपी को व्यक्त करने वाले ओस्टियोसाइट्स के अनुक्रमिक पाचन और एफएसीएस को नियोजित किया। 10-केबी डीएमपी 1 रिपोर्टर माउस एआई 9 में सीआरई की दिशा, जो टीडीटोमेटो प्रोटीन को सक्रिय करती है, अस्थि मज्जा के भीतर ओस्टियोसाइट्स, ओस्टियोब्लास्ट, मांसपेशियों और कोशिकाओं में मौजूद थी। 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर में एक ही अभिव्यक्ति पैटर्न था, लेकिन ओस्टियोब्लास्ट और अस्थि मज्जा कोशिकाओं के केवल एक अनुपात ने प्रोटीन व्यक्त किया, जो इंगित करता है कि 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर अधिक विशिष्ट21 है। इसके बावजूद, 8-केबी डीएमपी 1 प्रमोटर का उपयोग करके प्राप्त परिणामों को सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को ओस्टियोसाइट बनाम ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके नियमित रूप से किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्राप्त आबादी उच्च पर्याप्त शुद्धता की है।

ओस्टियोक्लास्ट मार्कर ऑस्कर और डीसीस्टैम्प हेमटोपोइएटिक गैर-क्षीण बनाम क्षीण ओस्टियोसाइट आबादी में पाए गए थे, इस खोज ने लेखकों को यह निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित किया कि 8-केबी डीएमपी 1-टोपाज नवजात कलवरिया और जीएफपी सॉर्टिंग के विभाजन से प्राप्त पाचन हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं से दूषित हैं। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के साथ संदूषण को जीएफपी सॉर्ट गेट को कसकर कम किया जा सकता था क्योंकि जीएफपी-पॉजिटिव हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में जीएफपी-पॉजिटिव मेसेनकाइमल कोशिकाओं (ओस्टियोसाइट्स) की तुलना में काफी कम जीएफपी तीव्रता थी।

विट्रो में ओस्टियोसाइट्स का अध्ययन करने के तरीकों ने ओस्टियोसाइट जीव विज्ञान पर जानकारी के हालिया धन में योगदान दिया है। हालांकि, ओस्टियोसाइट अलगाव कम सेल पैदावार के साथ एक श्रम-गहन और लंबी प्रक्रिया बनी हुई है। कोलेजनेस और ईडीटीए का उपयोग करके हड्डी के पाचन की वर्णित विधि अक्सर अंश 823 तक, कई घंटे लगते हैं जिसमें ओस्टियोसाइट व्यवहार्यता पर कर लगाया जाता है। शोधकर्ताओं ने सेल सॉर्टिंग20 के लिए अंशों (2-5) का उपयोग करने की सूचना दी है, और दिखाया है कि ओस्टियोसाइट्स बनाम ओस्टियोब्लास्ट से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल शुद्ध ओस्टियोसाइट आबादी20 को अलग करने की सफलता की पुष्टि करती है। इस लेख में, हम अंश (2-5) प्राप्त करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, और हम प्रत्येक अंश में ओस्टियोसाइट्स की वापसी निर्धारित करने के लिए अंश 1 से 8 से शुरू होने वाले प्रत्येक अंश से ओस्टियोसाइट्स की उपज की तुलना करते हैं। हम कोलेजनेस और एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके नवजात डीएमपी 1-टोपाज़ माउस कैल्वेरिया और कैल्वरियल पाचन के विच्छेदन के साथ-साथ एफएसीएस के लिए कोशिकाओं की तैयारी का भी वर्णन करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं और पशु देखभाल तोहोकू विश्वविद्यालय के नियमों और विनियमों के अनुसार किए गए थे।

1. नवजात डीएमपी 1-पुखराज माउस कैल्वरिया का विच्छेदन

  1. इस प्रोटोकॉल के लिए, C57BL/6-Tg (Dmp1-Topaz)1Ikal/J चूहों के 6-7 दिन पुराने पिल्ले का उपयोग करें। 5% आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें और फिर पिल्ले को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें।
  2. इच्छामृत्यु वाले पिल्ला को एक गैर-उपचारित संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
  3. कैंची और चिमटी का उपयोग करके, खोपड़ी के आधार पर त्वचा को पकड़ें और एक चीरा लगाएं।
  4. शुरुआती बिंदु के रूप में पहले चीरे का उपयोग करते हुए, कानों के सामने खोपड़ी के दोनों पार्श्व किनारों पर काटें, त्वचा को हटा दें, और कलवरिया को उजागर करें।
  5. नाक के पुल से सिर को पकड़ें और लैम्बडोइड सीवन के साथ कलवरिया को काट लें। पार्श्विका हड्डियों के पार्श्व किनारों के साथ काटें और इसे सामने के हिस्से को शामिल करने के लिए विस्तारित करें।
  6. अंतर्निहित मस्तिष्क ऊतक से कलवरिया को अलग करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि न्यूनतम नरम ऊतक लगाव के साथ एक साफ बोनी कैल्वरिया हड्डी में गहराई से न काटें; संदर्भ के लिए, किसी को हड्डी के नीचे कैंची की छाया देखने में सक्षम होना चाहिए।
  7. कैल्वेरिया को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस, पीएच 7.4 पूरे प्रोटोकॉल में) में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि अवतल भाग ऊपर की ओर है।

2. नवजात माउस कैल्वेरिया का विभाजन

  1. 5 कैलवरिया को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस समाधान होता है। उपयोग से ठीक पहले तैयार ताजा कोलेजनेस समाधान का उपयोग करें।
    1. एक ताजा कोलेजनेस समाधान तैयार करने के लिए, कोलेजनेज पाउडर को आइसोलेशन बफर (70 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम एनएएचसीओ 3, 60 एमएम सोर्बिटोल,3 एमएम के 2 एचपीओ4, 1 एमएम सीएसीएल2, 1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 5 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज और 25 एमएम एचईपीईएस) में 2 मिलीग्राम / एमएल पर जोड़ें। एक चुंबकीय हलचल पर कोलेजनेस पाउडर घोलें।
    2. 0.22 μm बाँझ फ़िल्टर इकाई के माध्यम से कोलेजनेस समाधान को 50 mL ट्यूब में चलाएं और इसे पूरे प्रोटोकॉल में बर्फ पर रखें।
  2. अंश 1 प्राप्त करने के लिए 300 आरपीएम पर एक शेकर पर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कैल्वरिया को इनक्यूबेट करें।
  3. अंश 1 के पाचन को छोड़ दें, कैल्वरिया को 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से धो लें और धोने को छोड़ दें।
  4. कैल्वरिया को 5 मिलीलीटर 5 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) में इनक्यूबेट करें, जिसमें पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, पीएच 7.4 37 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरपीएम पर शेकर पर 15 मिनट के लिए हो।
  5. पाचन को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। कैल्वरिया को 5 एमएल पीबीएस के साथ धो लें और पाचन में धोने का घोल जोड़ें।
    नोट: पाचन और धोने के प्रत्येक बिंदु पर, हड्डियों को हड्डी से अलग करने और डबल्स और सेल समुच्चय को रोकने के लिए हड्डियों को उनके घोल में पिपेट करें।
  6. अंश 2 प्राप्त करने के लिए, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर पाचन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 आईयू / एमएल पेनिसिलिन जी, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त α-न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के 8 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। 10 सेमी कल्चर डिश पर बीज। 5%CO2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अंश 2 को इनक्यूबेट करें।
  7. 300 आरपीएम पर शेकर पर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर कोलेजनेस समाधान में कलवरिया को इनक्यूबेट करें।
  8. अंश 3 एकत्र करने के लिए, चरण 2.5–2.6 दोहराएँ। 5%CO2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अंश 3 को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस बिंदु पर, हड्डियां छोटी हो जाएंगी, और वे टुकड़ों में कम हो जाएंगी। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई भी हड्डी गलती से पाचन में नहीं फंसती है, जिससे प्रक्रिया में कोशिका हानि होती है, पाचन को इकट्ठा करने के लिए एक छोटी टिप पिपेट का उपयोग करें (1000-200 μL पिपेट युक्तियाँ)।
  9. 300 आरपीएम पर शेकर पर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर कोलेजनेस समाधान में कलवरिया को इनक्यूबेट करें।
  10. अंश 4 एकत्र करने के लिए, चरण 2.5–2.6 दोहराएँ। 5%CO2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अंश 4 को इनक्यूबेट करें।
  11. कैल्वेरिया को 5 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर ईडीटीए में इनक्यूबेट करें जिसमें पीबीएस (पीएच 7.4) में 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए 37 डिग्री सेल्सियस पर 300 आरपीएम पर शेकर पर 15 मिनट के लिए होता है।
  12. अंश 5 एकत्र करने के लिए, चरण 2.5–2.6 दोहराएँ। 5%CO2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर अंश 5 को इनक्यूबेट करें। ओस्टियोसाइट्स को उसी दिन छंटाई के लिए तैयार किया जा सकता है या छंटाई से पहले 24 घंटे तक सुसंस्कृत किया जा सकता है।

3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए ओस्टियोसाइट्स की तैयारी

  1. प्रत्येक सेल अंश के माध्यम को एस्पिरेट करें और दो बार 10 एमएल पीबीएस के साथ धीरे से धोएं।
  2. पीबीएस में 0.5% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को धीरे से अलग करने के लिए 10% एफबीएस α-एमईएम और पिपेट के 5 एमएल जोड़ें। प्रत्येक अंश में कोशिकाओं को 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छानकर संयोजित करें।
  3. पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छानकर एकत्र करें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाला पदार्थ डालें और पेलेट में 10% एफबीएस α-एमईएम जोड़ें। सेल एकाग्रता को लगभग 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  5. कोशिकाओं को 35 μm नायलॉन जाल कैप्ड ट्यूब में फ़िल्टर करें। सेल अब एफएसीएस के लिए तैयार हैं।
  6. इस प्रोटोकॉल के लिए, 100 μm आकार नोजल का उपयोग करें। संग्रह द्रव में 10% एफबीएस α-एमईएम शामिल होना चाहिए। यदि संभव हो तो नमूने को आंदोलन पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रमबद्ध रखें।
  7. सॉर्ट से पहले, साइड स्कैटर (एसएससी) क्षेत्र और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) क्षेत्र को समायोजित करके कलाकृतियों और कोशिकाओं को हटाने के लिए गेटिंग को अनुकूलित करें। एसएससी-चौड़ाई बनाम एसएससी-ऊंचाई और एफएससी-क्षेत्र बनाम एफएससी-चौड़ाई को समायोजित करके डबल्स को हटा दें। जीएफपी-नकारात्मक ओस्टियोसाइट्स का उपयोग सॉर्ट उपकरण के मापदंडों को समायोजित करने के लिए नियंत्रण के रूप में किया जाना चाहिए।
  8. सेल संग्रह पूरा होने के बाद, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 10% एफबीएस α-एमईएम का उपयोग करके वांछित संख्या को समायोजित करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कोलेजन मैट्रिक्स को नीचा दिखाने के लिए कोलेजनेज का उपयोग करके एक फ्रैक्शनेशन प्रक्रिया के माध्यम से डीएमपी 1-टोपाज़ नवजात माउस कलवारिया से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स की संस्कृतियों को प्राप्त करने की प्रक्रिया का प्रदर्शन करना है, जिसके बाद कोशिकाओं को अन्य सेल आबादी से ओस्टियोसाइट्स को अलग करने के लिए एफएसीएस के लिए तैयार किया जाता है।

नवजात माउस कैल्वेरिया से प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स प्राप्त करने के तरीके अक्सर23 को छांटने के लिए अंशों (1-8) के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस विधि की दक्षता का परीक्षण करने के लिए, हमने एक डीएमपी 1-टोपाज़ माउस कैल्वेरिया से प्राप्त ओस्टियोसाइट्स की उपज की तुलना की, जो अंश 1 से 8 तक शुरू होती है। प्रत्येक अंश से ओस्टियोसाइट्स के प्रतिशत और उपज को निर्धारित करने के लिए अंश 1-8 को अलग से क्रमबद्ध किया गया था। प्रकार के बाद, हमने बीज कोशिकाओं के घनत्व की तुलना करने के लिए 96-वेल प्लेट पर 24 घंटे के लिए ओस्टियोसाइट्स को संवर्धित किया। अंश 2-5 में ओस्टियोसाइट्स का घनत्व अंश 1 की तुलना में अधिक दिखाया गया है, और ओस्टियोसाइट घनत्व अंश 6, 7 और 8 में उल्लेखनीय रूप से कम होने लगता है (चित्रा 1 ए)।

यद्यपि सभी अंशों के बीच प्राप्त ऑस्टियोसाइट का प्रतिशत सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है (चित्रा 1 बी), ओस्टियोसाइट्स का घनत्व नाटकीय रूप से भिन्न होता है। शोधकर्ताओं20 ने एफएसीएस के माध्यम से ओस्टियोसाइट्स को अलग करने के लिए अंश 2-5 के उपयोग की सूचना दी है, और हम चित्र 1 में दिखाते हैं कि अंश 2-5 का उपयोग ऑस्टियोसाइट्स प्राप्त करने की प्रक्रिया को अनुकूलित करता है और प्रकार के समय को कम करता है।

चित्रा 2 जीएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं से जीएफपी-पॉजिटिव को अलग करने के लिए अभ्यास की गई कोशिकाओं की संख्या और गेटिंग रणनीति को दर्शाता है जिसमें जीएफपी-नकारात्मक माउस कैल्वेरिया के विभाजन के माध्यम से प्राप्त कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। इस विधि के माध्यम से प्राप्त ओस्टियोसाइट्स का विश्लेषण डीएमपी 1 और एसओएसटी की जीन अभिव्यक्ति के लिए किया गया था, जिन्हें ओस्टियोसाइट्स मार्कर कहा जाता है। प्री-सॉर्ट अंश 2 की तुलना में ओस्टियोसाइट्स में डीएमपी 1 और एसओएसटी एमआरएनए अभिव्यक्तियां अधिक होती हैं, जिसे उच्च ओस्टियोब्लास्ट अंश (चित्रा 3 ए) के रूप में जाना जाता है। चित्रा 3 बी जीएफपी-पॉजिटिव ओस्टियोसाइट की आकृति विज्ञान को दर्शाता है जो प्लास्टिक कल्चर डिश पोस्ट सॉर्ट पर 24 घंटे के लिए सेल बॉडी से सुसंस्कृत डेंड्राइट के साथ एक स्टेलेट आकार को बनाए रखता है।

Figure 1
चित्रा 1: ओस्टियोसाइट फ्रैक्शनेशन की दक्षता। (ए) 24 घंटे के बाद कैप्चर किए गए 96-वेल प्लेट पर बीजित अंश 1-8 से ओस्टियोसाइट्स के घनत्व की सूक्ष्म छवियां। अंश 2-5 में अंश 1, और 6-8 की तुलना में अधिक सेल घनत्व होता है। स्केल बार = 100 μm. (B) फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया अंश 1-8 से प्राप्त ओस्टियोसाइट्स का प्रतिशत। परिणाम तीन अलग-अलग प्रतिनिधि प्रयोगों से प्राप्त होते हैं। डेटा को मानक विचलन ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग के माध्यम से जीएफपी-पॉजिटिव ओस्टियोसाइट्स का अलगाव। ऊपरी पैनल जीएफपी-नकारात्मक सी 57बीएल / 6 जे लिटरमेट कैल्वेरिया से अलग कोशिकाओं को जीएफपी थ्रेशोल्ड नियंत्रण के रूप में दर्शाता है। निचला पैनल डीएमपी 1-टोपाज माउस कैल्वेरिया से प्राप्त अंश 2 में जीएफपी-नकारात्मक कोशिकाओं से जीएफपी-पॉजिटिव ओस्टियोसाइट्स को अलग करने के लिए अभ्यास की जाने वाली कोशिकाओं और गेटिंग नियंत्रण की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओस्टियोसाइट लक्षण वर्णन पोस्ट सॉर्ट। (ए) डीएमपी 1 की सापेक्ष एमआरएनए अभिव्यक्ति और अंश 2 कोशिकाओं के एसओएसटी को 24 घंटे के लिए संवर्धित किया जाता है और ओस्टियोसाइट्स को 24 घंटे के बाद के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। डेटा को मानक विचलन ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतर का पता लगाया गया: * पी < 0.05, ** पी < 0.01। (बी) एक ओस्टियोसाइट की सूक्ष्म छवि जो कोशिका शरीर से बाहर की ओर फैले डेंड्राइट को 24 घंटे के बाद के लिए सुसंस्कृत करती है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पहला पृथक ओस्टियोसाइट एक चिकन कैल्वेरिया 7 से था जिसे (ओबी7.3 ) या पीएचईएक्स के एविएंट संस्करण का उपयोग करके अलग किया गया था; हालांकि, यह विधि व्यावहारिक एंटीबॉडी की उपलब्धता से सीमित है, क्योंकि ओस्टियोसाइट-विशिष्ट एंटीबॉडी जो विशिष्ट-विशिष्ट भी हैं, का निर्माण किया जाना है। शोधकर्ताओं ने माउस और चूहे की लंबी हड्डियों से ओस्टियोसाइट्स प्राप्त करने के लिए अनुक्रमिक एंजाइमेटिक प्रक्रिया के एक अलग संशोधन का उपयोग किया; इन संस्कृतियों की रिपोर्ट की गई शुद्धता लगभग 70% 9 पर निर्धारित की गई थी। क्रे माउस मॉडल के विकास ने इंजीनियरिंग ओस्टियोसाइट्स के लिए अनुमति दी, जो उनकी सतह पर जीएफपी व्यक्त करते हैं। एफएसीएस के साथ इस माउस मॉडल का उपयोग प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स20 की शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए किया गया था।

हम अंश 1 और अंश 6-8 के उपयोग को छोड़ देते हैं क्योंकि इन अंशों में ओस्टियोसाइट्स की थोड़ी मात्रा निकलती है। अंश 2-5 का उपयोग करके कम से कम प्रसंस्करण समय में ओस्टियोसाइट्स की सर्वोत्तम संभव उपज मिलती है; यह ओस्टियोसाइट्स के हैंडलिंग समय को सीमित करता है और कोशिका मृत्यु या सेल सिग्नलिंग में संभावित परिवर्तन को रोकने की दिशा में काम करता है क्योंकि सेल फ्रैक्शनेशन के दौरान तनाव के अधीन होता है। हम 24 घंटे के प्री-सॉर्ट के लिए ओस्टियोसाइट्स को भी कल्चर करते हैं, जो डिफ़ॉल्ट रूप से, सॉर्ट तैयारी के दौरान गैर-अनुयायी निलंबन कोशिकाओं (हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं) को शामिल नहीं करता है। यह जीएफपी22 को व्यक्त करने वाले हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं द्वारा संदूषण को कम करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रदान किया गया वर्कफ़्लो पहले प्रकाशित विधियों23 का लाभ उठाता है और न्यूनतम संदूषण के साथ एक कुशल और त्वरित ओस्टियोसाइट रिकवरी की अनुमति देने वाले प्रकार के समय को कम करता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में एक स्वच्छ बोनी कैल्वेरिया प्राप्त करना और अनुयायी कोशिकाओं (फाइब्रोब्लास्ट और तंत्रिका कोशिकाओं) के संदूषण को सीमित करने के लिए मस्तिष्क या हड्डी से जुड़े संयोजी ऊतक से नरम ऊतक को ट्रिम करना शामिल है। इसके अलावा, पाचन प्राप्त करने और धोने सहित चरणों के दौरान कोशिकाओं को पाइप करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि सेल समुच्चय और डबल्स को छंटाई के दौरान अपशिष्ट के रूप में पढ़ा जाता है और ओस्टियोसाइट्स की कम उपज में योगदान देगा।

ओस्टियोसाइट्स को पूर्व संस्कृति के बिना क्रमबद्ध किया जा सकता है। हालांकि, इसका मतलब है कि अधिक संख्या में कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जाना है, जिससे प्रकार का समय बढ़ जाता है और हेमटोपोइएटिक संदूषण की संभावना बढ़ जाती है। हेमटोपोइएटिक सेल की कमी को पूर्व-प्रकार लागू करके इसे कम किया जा सकता है। हालांकि, यह कर लगाने वाला है और नियमित और बैच प्रयोगशाला विश्लेषण22 के लिए अनुशंसित नहीं है। सॉर्ट मशीन के द्रव प्रवाह को रोकने वाले बड़े सेल समुच्चय और डबल्स की उपस्थिति के कारण छंटाई करते समय परेशानी उत्पन्न हो सकती है। हमारे प्रोटोकॉल में, यह एक मुद्दा नहीं रहा है, लेकिन इसे सॉर्ट बफर (10% से कम) की एफबीएस सामग्री को कम करके हल किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल सीमाओं के बिना नहीं आता है। यह विधि माउस ओस्टियोसाइट्स का उपयोग करती है, जो पूरी तरह से मानव ओस्टियोसाइट्स से मिलती-जुलती नहीं हैं। यह म्यूरिन ओस्टियोसाइट्स का अध्ययन करके प्राप्त परिणामों को सार्थक नैदानिक परिणामों तक विस्तारित करने को प्रतिबंधित करता है। मानव ओस्टियोसाइट्स के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल24 का वर्णन किया गया है, और शोधकर्ताओं को सेल प्रजातियों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है जो उनके लक्ष्यों को सर्वोत्तम रूप से पूरा करते हैं। अन्य प्रोटोकॉल के साथ, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त ओस्टियोसाइट्स की मात्रा सीमित है, और बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में चूहों की आवश्यकता होती है, हालांकि, ओस्टियोसाइट्स को तैयार करने और छांटने के लिए आवश्यक समय को कम करके, एक ही समय सीमा में कोशिकाओं की उच्च मात्रा प्राप्त की जा सकती है।

इस प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त ओस्टियोसाइट्स का उपयोग आगे की संस्कृति और सह-संस्कृति, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, सब्सट्रेट सक्रियण / निषेध, आणविक जांच और धुंधला अनुप्रयोगों के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग मेकेनोट्रांसडक्शन और मेकेनोसेंसिंग के अध्ययन के लिए देशी ओस्टियोसाइटिक वातावरण के समान 3 डी ओस्टियोसाइट मैट्रिक्स मॉडल बनाने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (नंबर 19K10397 से H.K. और नंबर 18K09862 से Im.M.) से JSPS KAKENHI अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSDiva software BD Biosciences Data aquisition and analysis
BD Falcon Tube BD Biosciences 352235 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase Wako, Osaka, Japan 034-22363 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.
EDTA Dojindo, Kumamoto, Japan 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA
FACSAriaTM II BD Biosciences
Fetal bovine serum (FBS) Biowest, Nuaillé, France
Isolation buffer 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES
Millex Sterile Filter Unit Merck Millipore, Ireland SLGV033RS 0.22μm
Nylon cell strainer FALCON, NY, USA 40μm
Trypsin-EDTA Life Technologies, NY, USA 0.5% x10. diluted to x1 in PBS
α-MEM Wako, Osaka, Japan Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin

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References

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