Summary
Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
Abstract
L'osteocita, una volta ritenuto un residente passivo dell'osso data la funzione dietro le quinte di rilevare il carico meccanico, è ora portato sotto i riflettori e ha dimostrato di avere molteplici funzioni importanti come modificare attivamente la matrice extracellulare e formare un organo endocrino con il sistema lacunocanalicolare che lo racchiude inviando messaggi a siti distanti. Grazie ai metodi che hanno permesso di testare l'osteocita in vitro dall'isolamento degli osteociti primari alle linee cellulari simili agli osteociti, gli osteociti stanno ora vivendo un interesse clamoroso e un'ondata di conoscenze sulla struttura e la funzione. Molti aspetti della biologia degli osteociti e dell'interazione con altri componenti molecolari devono ancora essere scoperti. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l'isolamento efficiente degli osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio, che esprimono la proteina fluorescente verde negli osteociti, attraverso il frazionamento cellulare e successivamente l'acquisizione di colture di osteociti primari da parte di FACS.
Introduction
Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate dai progenitori osteoblastici che sono stati incorporati nella loro matrice secreta1. Sono le cellule più abbondanti e più longeve tra le popolazioni di cellule ossee. Risiedono all'interno di lacune e hanno una caratteristica morfologia stellata con dendriti che si estendono attraverso canali chiamati canalicoli formando una vasta rete di comunicazione e scambio metabolico con l'ambiente circostante e la superficie ossea2. Gli osteociti coreografano sia i ruoli degli osteoblasti che degli osteoclasti nel rimodellamento osseo, sono le cellule meccanosensoriali primarie che conferiscono adattamento al carico meccanico3, sono coinvolte nell'omeostasi del fosfato4 e nella mineralizzazione della matrice ossea5 e, insieme al sistema lacunocanalicolare, agiscono come un organo endocrino che segnala i tessuti distanti6.
Gli osteociti sono situati all'interno di una matrice mineralizzata, che limita l'accessibilità e rende difficile il loro isolamento, ostacolando così l'indagine in vitro. Uno dei primi metodi di isolamento ha descritto osteociti isolati dalla calvaria di pollo utilizzando un anticorpo monoclonale osteocita-specifico (OB7.3)7 che in seguito è stato conosciuto per essere la variante aviaria di PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)8. Altri ricercatori hanno utilizzato la digestione sequenziale delle ossa lunghe del ratto 9 o del topo 10 per ottenere frazioni ricche di osteociti in cui la purezza degli osteociti è stata riportata intorno al70%9. I limiti di questa procedura includono la purezza sub-ottimale delle colture contaminate con altri tipi di cellule oltre agli osteociti e che gli osteociti potrebbero essere potenzialmente ricoperti da altre cellule in coltura poiché gli osteociti hanno perso la capacità di dividersi. Queste sfide limitano l'usabilità delle culture a lungo termine.
Per superare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse linee cellulari di osteociti. La linea cellulare MLO-Y411 e la linea cellulare MLO-A512 sono in particolare le linee cellulari più studiate che sono utili per lo studio degli osteociti allo stadio iniziale; tuttavia, sono meno utili per studiare la segnalazione degli osteociti maturi in quanto esprimono bassi livelli di sclerostina e FGF2313, entrambi marcatori di osteociti maturi. Altre linee cellulari, tra cui IDG-SW3 14 e Ocy45415, esprimono alti livelli di sclerostina e FGF23 e sono utili nello studio dello stadio tardivo degli osteociti. Le linee cellulari si rivelano utili strumenti di ricerca; Tuttavia, non sono privi di limitazioni in quanto non rappresentano pienamente la biologia della cellula primaria. Diverse linee cellulari rappresentano diversi stadi di sviluppo dello spettro di maturità degli osteociti e le linee cellulari non riescono a rappresentare l'eterogeneità degli osteociti primari16,17.
Per ottenere colture pure di osteociti primari, i ricercatori hanno sfruttato il modello murino cre in cui il promotore dmp1 da 8 kb viene utilizzato per guidare l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) negli osteociti18,19. Topi transgenici doppi (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topazio) di Paic et al.19 e topi transgenici dmp1-topazio di Nakashima et al.20 sono stati utilizzati per ottenere popolazioni di osteociti. In cui hanno impiegato la digestione sequenziale e FACS di osteociti che esprimono GFP per acquisire colture di osteociti primari19,20. La direzione del cre nel topo reporter Ai9 dmp1 da 10 kb, che attiva la proteina tdTomato, ha dimostrato di essere presente negli osteociti, negli osteoblasti, nei muscoli e nelle cellule all'interno del midollo osseo. Il promotore dmp1 da 8 kb aveva lo stesso pattern di espressione, ma solo una percentuale di osteoblasti e cellule del midollo osseo esprimeva la proteina, il che indica che il promotore dmp1 da 8 kb è più specifico21. Nonostante ciò, i risultati ottenuti utilizzando il promotore dmp1 da 8 kb devono essere interpretati con cautela e i profili di espressione genica devono essere eseguiti di routine utilizzando marcatori specifici degli osteociti rispetto agli osteoblasti per garantire che la popolazione ottenuta sia di purezza sufficientemente elevata.
I marcatori osteoclasti OSCAR e Dcstamp sono stati trovati in popolazioni di osteociti ematopoietici non impoveriti rispetto a quelli impoveriti, questa scoperta ha portato gli autori a concludere che i digesti ottenuti dal frazionamento della calvaria neonatale dmp1-topazio 8-kb e dalla selezione GFP sono contaminati da cellule ematopoietiche. La contaminazione con cellule ematopoietiche avrebbe potuto essere mitigata stringendo la porta di ordinamento della GFP poiché le cellule ematopoietiche GFP-positive avevano un'intensità GFP ragionevolmente inferiore rispetto alle cellule mesenchimali GFP-positive (osteociti)22.
I metodi per lo studio degli osteociti in vitro hanno contribuito alla recente ricchezza di informazioni sulla biologia degli osteociti. Tuttavia, l'isolamento degli osteociti rimane una procedura laboriosa e lunga con basse rese cellulari. Il metodo descritto di digestione ossea utilizzando collagenasi e EDTA spesso fino alla frazione 823, richiede diverse ore in cui la vitalità degli osteociti è tassata. I ricercatori hanno riferito di utilizzare frazioni (2\u20125) per l'ordinamento cellulare 20 e hanno dimostrato che il profilo di espressione dei geni associati agli osteociti rispetto a quelli degli osteoblasti conferma il successo dell'isolamento di popolazioni di osteociti puri20. In questo articolo, descriviamo il processo di ottenimento delle frazioni (2-0125) e confrontiamo la resa degli osteociti da ciascuna frazione a partire dalla frazione da 1 a 8 per determinare il ritorno degli osteociti in ogni frazione. Descriviamo anche la dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonatale e la digestione calvariale usando collagenasi e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), nonché la preparazione delle cellule per FACS.
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Protocol
Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite in conformità con le regole e i regolamenti dell'Università di Tohoku.
1. Dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonato
- Per questo protocollo, utilizzare 6\u20127 cuccioli di C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia topi con inalazione di isoflurano al 5% e quindi trasferire i cuccioli in etanolo al 70%.
- Trasferire il cucciolo eutanasia in un piatto di coltura non trattato.
- Usando forbici e pinzette, afferrare la pelle alla base del cranio e fare un'incisione.
- Usando la prima incisione come punto di partenza, tagliare su entrambi i lati laterali del cranio davanti alle orecchie, rimuovere la pelle ed esporre la calvaria.
- Tenere la testa dal ponte nasale e tagliare la calvaria lungo la sutura lambdoide. Tagliare lungo i bordi laterali delle ossa parietali ed estenderlo per includere la parte frontale.
- Separare il calvario dal tessuto cerebrale sottostante.
NOTA: Per garantire un calvario osseo pulito con un attacco minimo dei tessuti molli, non tagliare in profondità l'osso; Per riferimento, si dovrebbe essere in grado di vedere l'ombra delle forbici sotto l'osso. - Trasferire la calvaria in soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4 durante tutto il protocollo). Assicurati che la parte concava sia rivolta verso l'alto.
2. Frazionamento della calvaria di topo appena nata
- Trasferire fino a 5 calvario in un tubo conico da 50 mL contenente 5 mL di soluzione di collagenasi 2 mg/mL. Utilizzare una soluzione di collagenasi fresca preparata appena prima dell'uso.
- Per preparare una soluzione di collagenasi fresca, aggiungere la polvere di collagenasi al tampone isolante (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitolo,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA), 5 mg/ml di glucosio e 25 mM HEPES) a2mg/ml. Sciogliere la polvere di collagenasi su un agitatore magnetico.
- Far passare la soluzione di collagenasi attraverso un'unità filtrante sterile da 0,22 μm in un tubo da 50 ml e tenerla in ghiaccio per tutta la durata del protocollo.
- Incubare la calvaria a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 giri/min per ottenere la frazione 1.
- Scartare il digesto della frazione 1, lavare il calvario con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e gettare il lavaggio.
- Incubare il calvario in 5 mL di acido etilendiamminotetraacetico 5 mM contenente 1 mg/mL di BSA in PBS, PH 7,4 a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 rpm.
- Raccogliere il digest in un tubo conico da 50 ml. Lavare la calvaria con 5 ml di PBS e aggiungere la soluzione di lavaggio al digest.
NOTA: In ogni punto di raccolta del digesto e lavaggio, pipettare le ossa nella loro soluzione per staccare le cellule dall'osso e per prevenire doppietti e aggregati cellulari. - Per ottenere la frazione 2, centrifugare il digesto a 300 x g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 8 ml di α-Minimum Essential Medium (MEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Seminare su un piatto di coltura di 10 cm. Incubare la frazione 2 a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.
- Per raccogliere la frazione 3, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 3 a 37 °C sotto il 5% di CO2.
NOTA: A questo punto, le ossa diventeranno più piccole e saranno ridotte a frammenti. Per garantire che nessuna osso venga aspirato accidentalmente nei digesti, il che porta alla perdita di cellule nel processo, utilizzare una piccola pipetta a punta per la raccolta dei digesti (punte per pipette da 1000-2000 μL). - Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.
- Per raccogliere la frazione 4, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 4 a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Incubare il calvario in 5 mL di 5 mM EDTA contenente 1 mg/mL di BSA in PBS (pH 7,4) a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 giri/min.
- Per raccogliere la frazione 5, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 5 a 37 °C sotto il 5% di CO2. Gli osteociti possono essere preparati per la selezione nello stesso giorno o coltivati fino a 24 ore prima della selezione.
3. Preparazione di osteociti per la selezione cellulare attivata a fluorescenza
- Aspirare il mezzo di ciascuna frazione cellulare e lavare delicatamente con 10 ml di PBS due volte.
- Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,5% in PBS e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 5 ml di FBS al 10% α-MEM e pipettare per staccare delicatamente le cellule. Combinare le cellule in ciascuna frazione setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
- Lavare le celle con 10 ml di PBS e raccogliere setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.
- Aspirare il surnatante e aggiungere il 10% di FBS α-MEM al pellet. Regolare la concentrazione cellulare a circa 1 x 107 cellule/ml.
- Filtrare le celle in un tubo con copertura in rete di nylon da 35 μm. Le celle sono ora pronte per FACS.
- Per questo protocollo, utilizzare un ugello di dimensioni 100 μm. Il fluido di raccolta deve essere costituito per il 10% da FBS α-MEM. Mantenere il campione da selezionare in agitazione e a 4 °C in tutto il tipo, se possibile.
- Prima dell'ordinamento, ottimizzare il gating per rimuovere artefatti e celle regolando l'area SSC (side scatter) e l'area FSC (forward scatter). Elimina i doppietti regolando SSC-width vs SSC-Height e FSC-area vs FSC-width. Gli osteociti GFP-negativi dovrebbero essere usati come controllo per regolare i parametri dello strumento di ordinamento.
- Al termine della raccolta delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 10 minuti. Lavare le celle con PBS. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.
- Risospendere le celle e regolare il numero come desiderato utilizzando il 10% FBS α-MEM.
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Representative Results
Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare il processo di ottenimento di colture di osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio attraverso un processo di frazionamento utilizzando collagenasi per degradare la matrice di collagene e EDTA per la chelazione del calcio, dopo di che le cellule vengono preparate per FACS per separare gli osteociti da altre popolazioni cellulari.
I metodi per ottenere osteociti primari dalla calvaria di topo neonatale spesso descrivono l'uso di frazioni (1-20128) per l'ordinamentodi 23. Per testare l'efficienza di questo metodo, abbiamo confrontato la resa degli osteociti ottenuti da una calvario di topo dmp1-topazio, a partire dalle frazioni da 1 a 8. Le frazioni 1\u20128 sono state ordinate separatamente per determinare la percentuale e la resa degli osteociti da ciascuna frazione. Dopo il tipo, abbiamo coltivato osteociti per 24 ore su una piastra a 96 pozzetti per confrontare la densità delle cellule seminate. La densità degli osteociti nelle frazioni 2-0125 è superiore a quella della frazione 1 e la densità degli osteociti inizia a diminuire notevolmente nelle frazioni 6, 7 e 8 (Figura 1A).
Sebbene la percentuale di osteociti ottenuta tra tutte le frazioni non sia statisticamente significativa (Figura 1B), la densità degli osteociti differisce notevolmente. I ricercatori20 hanno riportato l'uso delle frazioni 2\u20125 per isolare gli osteociti tramite FACS, e mostriamo in Figura 1 che l'uso delle frazioni 2\u20125 ottimizza il processo per ottenere gli osteociti e diminuisce il tempo del tipo.
La figura 2 mostra il numero di cellule e la strategia di gating praticata per isolare le cellule GFP-positive da quelle GFP-negative in cui le cellule ottenute attraverso il frazionamento della calvaria di topo GFP-negativa sono state utilizzate come controllo. Gli osteociti ottenuti attraverso questo metodo sono stati analizzati per l'espressione genica di Dmp1 e SOST, che sono noti marcatori osteociti. Le espressioni di mRNA Dmp1 e SOST sono più alte negli osteociti rispetto alla frazione pre-ordinamento 2, che è nota come alta frazione di osteoblasti (Figura 3A). La figura 3B mostra la morfologia di un osteocita GFP-positivo che mantiene una forma stellata con dendriti che si estendono dal corpo cellulare coltivato per 24 ore su un piatto di coltura di plastica dopo la selezione.
Figura 1: Efficienza del frazionamento degli osteociti. (A) Immagini microscopiche della densità degli osteociti dalle frazioni 1\u20128 seminate su una piastra a 96 pozzetti catturata dopo 24 ore del tipo. Le frazioni 2\u20125 hanno una densità cellulare superiore rispetto alle frazioni 1 e 6\u20128. Barra della scala = 100 μm. (B) Percentuale di osteociti ottenuti dalle frazioni 1\u20128 misurata dal software del citometro a flusso. I risultati derivano da tre esperimenti rappresentativi separati. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Isolamento di osteociti GFP-positivi mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza. Il pannello superiore rappresenta le cellule isolate dalla calvaria di C57Bl/6J cucciolata GFP-negativa come controllo della soglia GFP. Il pannello inferiore rappresenta il numero di cellule e il controllo del gating praticati per isolare gli osteociti GFP-positivi da cellule GFP-negative nella frazione 2 ottenuta dalla calvaria di topo dmp1-topazio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Post ordinamento della caratterizzazione degli osteociti. (A) Espressione relativa di mRNA di Dmp1 e SOST di cellule della frazione 2 coltivate per 24 ore e osteociti coltivati per 24 ore dopo il sortamento. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Le differenze statistiche sono state rilevate utilizzando il test t di Student: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Immagine microscopica di un osteocita che trattiene dendriti che si estendono verso l'esterno dal corpo cellulare coltivato per 24 ore dopo l'ordinamento. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il primo osteocita isolato proveniva da una calvaria di pollo7 isolata utilizzando (OB7.3) o la variante aviant di PHEX; Tuttavia, questo metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi funzionanti, poiché devono essere prodotti anticorpi specifici per osteociti che sono anche specie-specifici. I ricercatori hanno utilizzato una diversa modifica del processo enzimatico sequenziale per ottenere osteociti da ossa lunghe di topo e ratto; La purezza riportata di queste colture è stata fissata a circa il 70%9. Lo sviluppo del modello murino cre ha permesso di ingegnerizzare gli osteociti, che esprimono GFP sulla loro superficie. Questo modello murino, insieme a FACS, è stato utilizzato per ottenere colture pure di osteociti primari20.
Omettiamo l'uso delle frazioni 1 e delle frazioni 6\u20128 poiché piccole quantità di osteociti si staccano in queste frazioni. Utilizzando le frazioni 2\u20125 si ottiene la migliore resa possibile di osteociti nel minor tempo di lavorazione; Ciò limita il tempo di manipolazione degli osteociti e lavora per prevenire la morte cellulare o una possibile alterazione della segnalazione cellulare a causa dello stress a cui la cellula è sottoposta durante il frazionamento. Coltiviamo anche osteociti per 24 ore di pre-ordinamento, che per impostazione predefinita, esclude le cellule di sospensione non aderenti (cellule ematopoietiche) durante la preparazione del sorteggio. Ciò riduce al minimo la contaminazione da parte delle cellule ematopoietiche che esprimono GFP22. Il flusso di lavoro fornito in questo protocollo sfrutta i metodi precedentemente pubblicati23 e riduce i tempi di selezione consentendo un recupero efficiente e rapido degli osteociti con una contaminazione minima.
I passaggi critici del protocollo includono l'ottenimento di una calvaria ossea pulita e il taglio dei tessuti molli dal cervello o dal tessuto connettivo attaccato all'osso per limitare la contaminazione delle cellule aderenti (fibroblasti e cellule neurali). Inoltre, il pipettaggio delle cellule durante le fasi che includono l'ottenimento e il lavaggio dei digesti è fondamentale, poiché gli aggregati cellulari e le doppiette vengono letti come rifiuti durante la selezione e contribuiranno a una bassa resa di osteociti.
Gli osteociti possono essere ordinati senza coltura precedente. Tuttavia, ciò significa che un numero maggiore di cellule deve essere ordinato, aumentando il tempo del tipo e aumentando la possibilità di contaminazione ematopoietica. Questo può essere mitigato applicando il pre-ordinamento della deplezione delle cellule ematopoietiche. Tuttavia, questo è faticoso e non raccomandato per le analisi di laboratorio di routine e batch22. Possono sorgere problemi durante lo smistamento a causa della presenza di aggregati cellulari di grandi dimensioni e doppiette che ostruiscono il flusso del fluido della macchina di smistamento. Nel nostro protocollo, questo non è stato un problema, ma questo può essere risolto riducendo il contenuto FBS del buffer di ordinamento (meno del 10%).
Questo protocollo non è privo di limitazioni. Questo metodo utilizza osteociti di topo, che non assomigliano completamente agli osteociti umani. Ciò limita l'estensione dei risultati ottenuti studiando gli osteociti murini a risultati clinici significativi. I protocolli per l'isolamento degli osteociti umani sono stati descritti24 e i ricercatori sono incoraggiati a utilizzare le specie cellulari che meglio servono i loro obiettivi. Come con altri protocolli, le quantità di osteociti ottenute utilizzando questo protocollo sono limitate e un gran numero di topi è richiesto per l'analisi su larga scala, tuttavia, diminuendo il tempo necessario per la preparazione e l'ordinamento degli osteociti, è possibile acquisire quantità più elevate di cellule in un unico lasso di tempo.
Gli osteociti ottenuti attraverso questo processo possono essere utilizzati per ulteriori colture e co-colture, analisi dell'espressione genica, analisi a valle dell'attivazione / inibizione del substrato, sondaggio molecolare e applicazioni di colorazione. Le cellule primarie possono anche essere utilizzate per costruire un modello 3D di matrice osteocitaria simile all'ambiente osteocitico nativo per lo studio della meccanotrasduzione e del meccanorilevamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione JSPS KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (n. 19K10397 a H.K. e n. 18K09862 a I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
References
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