Summary
Ce protocole décrit la dissection du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze et l’isolement des ostéocytes exprimant la protéine fluorescente verte par digestion et fractionnement cellulaire, en plus de la préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
Abstract
L’ostéocytes, autrefois considéré comme un résident passif de l’os étant donné la fonction de détection de la charge mécanique en coulisses, est maintenant mis en lumière et a été montré pour avoir de multiples fonctions majeures comme la modification active de la matrice extracellulaire et la formation d’un organe endocrinien avec le système lacunocanaliculaire qui l’entoure envoyant des messages à des sites distants. Grâce aux méthodes qui ont permis de tester l’ostéocyte in vitro à partir d’ostéocytes primaires isolés en lignées cellulaires de type ostéocytes, les ostéocytes connaissent aujourd’hui un intérêt retentissant et une vague de connaissances sur la structure et la fonction. De nombreux aspects de la biologie des ostéocytes et de l’interaction avec d’autres composants moléculaires restent à découvrir. Dans ce protocole, nous décrivons en détail l’isolement efficace des ostéocytes primaires à partir du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze, qui expriment la protéine fluorescente verte dans les ostéocytes, par fractionnement cellulaire et acquisition ultérieure de cultures d’ostéocytes primaires par FACS.
Introduction
Les ostéocytes sont des cellules terminales différenciées des progéniteurs ostéoblastiques qui se sont intégrés dans leur matrice sécrétée1. Ce sont les cellules les plus abondantes et les plus anciennes parmi les populations de cellules osseuses. Ils résident dans des lacunes et ont une morphologie stellaire caractéristique avec des dendrites qui s’étendent à travers des canaux appelés canalicules formant un vaste réseau de communication et d’échange métabolique avec leur environnement et la surface osseuse2. Les ostéocytes chorégraphient à la fois les rôles des ostéoblastes et des ostéoclastes dans le remodelage osseux, ils sont les cellules mécanosensorielles primaires conférant une adaptation à la charge mécanique3, sont impliqués dans l’homéostasie phosphate4 et la minéralisation de la matrice osseuse5, et avec le système lacunocanaliculaire, ils agissent comme un organe endocrinien signalant des tissus distants6.
Les ostéocytes sont situés dans une matrice minéralisée, ce qui limite l’accessibilité et rend leur isolement difficile, entravant ainsi l’investigation in vitro. L’une des premières méthodes d’isolement a décrit des ostéocytes isolés du calvaire de poulet à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique aux ostéocytes (OB7.3)7 qui a été connu plus tard pour être la variante aviaire de PHEX (gène régulateur de PHosphate avec homologie aux endopeptidases sur le chromosome X)8. D’autres chercheurs ont utilisé la digestion séquentielle d’os longs de rat 9 ou de souris 10 pour obtenir des fractions riches en ostéocytes dans lesquelles la pureté des ostéocytes était d’environ70%9. Les limites de cette procédure comprennent la pureté sous-optimale des cultures contaminées par d’autres types de cellules que les ostéocytes et le fait que les ostéocytes pourraient être potentiellement envahis par d’autres cellules en culture puisque les ostéocytes ont perdu la capacité de se diviser. Ces défis limitent la facilité d’utilisation des cultures à long terme.
Pour surmonter ces limitations, différentes lignées cellulaires ostéopacytaires ont été développées. La lignée cellulaire MLO-Y411 et la lignée cellulaire MLO-A512 sont notamment les lignées cellulaires les plus étudiées qui sont utiles pour l’étude des ostéocytes à un stade précoce; cependant, ils sont moins utiles pour étudier la signalisation des ostéocytes matures car ils expriment de faibles niveaux de sclérostine et de FGF2313, qui sont tous deux des marqueurs ostéocytes matures. D’autres lignées cellulaires, y compris IDG-SW3 14 et Ocy45415, expriment des niveaux élevés de sclérostine et de FGF23 et sont utiles pour étudier le stade ostéocytaire tardif. Les lignées cellulaires s’avèrent être des outils de recherche utiles; Néanmoins, ils ne viennent pas sans limites car ils ne représentent pas pleinement la biologie de la cellule primaire. Différentes lignées cellulaires représentent différents stades de développement du spectre de maturité des ostéocytes, et les lignées cellulaires ne parviennent pas à représenter l’hétérogénéité des ostéocytes primaires16,17.
Pour obtenir des cultures pures d’ostéocytes primaires, les chercheurs ont tiré parti du modèle murin cre dans lequel le promoteur dmp1 de 8 kb est utilisé pour stimuler l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les ostéocytes18,19. Des souris transgéniques doubles (pOB-Col 2.3- GFP-cyan et DMP1-GFP-topaz) de Paic et al.19 et des souris transgéniques dmp1-topaze de Nakashima et al.20 ont été utilisées pour obtenir des populations d’ostéocytes. Dans lequel ils ont utilisé la digestion séquentielle et le FACS des ostéocytes exprimant la GFP pour acquérir des cultures d’ostéocytes primaires19,20. La direction de cre chez la souris rapporteure dmp1 de 10 kb Ai9, qui active la protéine tdTomato, s’est avérée présente dans les ostéocytes, les ostéoblastes, les muscles et les cellules de la moelle osseuse. Le promoteur dmp1 de 8 kb avait le même schéma d’expression, mais seule une proportion d’ostéoblastes et de cellules de moelle osseuse exprimait la protéine, ce qui indique que le promoteur dmp1 de 8 kb est plus spécifique21. Malgré cela, les résultats obtenus à l’aide du promoteur dmp1 de 8 kb doivent être interprétés avec prudence, et les profils d’expression génique doivent être systématiquement réalisés à l’aide de marqueurs spécifiques aux ostéocytes par rapport aux ostéoblastes pour s’assurer que la population obtenue est d’une pureté suffisamment élevée.
Les marqueurs ostéoclastes OSCAR et Dcstamp ont été trouvés dans des populations d’ostéocytes hématopoïétiques non appauvris vs appauvris, cette découverte a conduit les auteurs à conclure que les digestions obtenues par fractionnement de calvaire néonatal dmp1-topaze de 8 kb et le tri GFP sont contaminés par des cellules hématopoïétiques. La contamination par les cellules hématopoïétiques aurait pu être atténuée en resserrant la porte de tri de la GFP puisque les cellules hématopoïétiques GFP positives avaient une intensité de GFP raisonnablement inférieure à celle des cellules mésenchymateuses (ostéocytes) GFP-positives22.
Les méthodes d’étude des ostéocytes in vitro ont contribué à la richesse récente des informations sur la biologie des ostéocytes. Cependant, l’isolement des ostéocytes reste une procédure longue et laborieuse avec de faibles rendements cellulaires. La méthode décrite de digestion osseuse utilisant la collagénase et l’EDTA souvent jusqu’à la fraction 823, prend plusieurs heures au cours desquelles la viabilité des ostéocytes est taxée. Des chercheurs ont rapporté utiliser des fractions (2\u20125) pour le tri cellulaire 20, et ont montré que le profil d’expression des gènes associés aux ostéocytes par rapport à ceux des ostéoblastes confirme le succès de l’isolement des populations d’ostéocytes purs20. Dans cet article, nous décrivons le processus d’obtention des fractions (2\u20125), et nous comparons le rendement des ostéocytes de chaque fraction en commençant par la fraction 1 à 8 pour déterminer le retour des ostéocytes dans chaque fraction. Nous décrivons également la dissection du calvaria de souris dmp1-topaze nouveau-née et la digestion calvariaire à l’aide de collagénase et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ainsi que la préparation de cellules pour FACS.
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Protocol
Toutes les procédures et tous les soins aux animaux ont été effectués conformément aux règles et règlements de l’Université de Tohoku.
1. Dissection du calvaire de souris dmp1-topaze nouveau-né
- Pour ce protocole, utilisez des petits de 6 à jours de souris C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Euthanasier les souris avec une inhalation d’isoflurane à 5%, puis transférer les petits dans de l’éthanol à 70%.
- Transférer le chiot euthanasié dans un plat de culture non traité.
- À l’aide de ciseaux et de pincettes, saisissez la peau à la base du crâne et faites une incision.
- En utilisant la première incision comme point de départ, coupez les deux côtés latéraux du crâne devant les oreilles, retirez la peau et exposez le calvaire.
- Tenez la tête de l’arête nasale et coupez le calvaire le long de la suture lambdoïde. Coupez le long des bords latéraux des os pariétaux et étendez-le pour inclure la partie frontale.
- Séparez le calvaire du tissu cérébral sous-jacent.
REMARQUE: Pour assurer un calvaire osseux propre avec une fixation minimale des tissus mous, ne coupez pas profondément dans l’os; Pour référence, on devrait pouvoir voir l’ombre des ciseaux sous l’os. - Transférer le calvaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 tout au long du protocole). Assurez-vous que la partie concave est orientée vers le haut.
2. Fractionnement du calvaire de souris nouveau-né
- Transvaser jusqu’à 5 calvariae dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de solution de collagénase à 2 mg/mL. Utilisez une solution de collagénase fraîche préparée juste avant utilisation.
- Pour préparer une solution de collagénase fraîche, ajouter la poudre de collagénase au tampon d’isolement (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO3, 60 mM de sorbitol, 3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 5 mg/mL de glucose et 25 mM de HEPES) à 2mg/mL. Dissoudre la poudre de collagénase sur un agitateur magnétique.
- Faites passer la solution de collagénase à travers une unité filtrante stérile de 0,22 μm dans un tube de 50 ml et gardez-la sur la glace tout au long du protocole.
- Incuber le calvaire à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm pour obtenir la fraction 1.
- Jeter la digestion de la fraction 1, laver le calvaire avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et jeter le lavage.
- Incuber le calvaire dans 5 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 5 mM contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS, PH 7,4 à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 tr/min.
- Recueillir le digest dans un tube conique de 50 mL. Laver le calvaire avec 5 mL de PBS et ajouter la solution de lavage à la digestion.
NOTE: À chaque étape de la collecte de la digestion et du lavage, pipeter les os dans leur solution pour détacher les cellules de l’os et empêcher les doublets et les agrégats cellulaires. - Pour obtenir la fraction 2, centrifuger le digest à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu essentiel (MEM) α-minimum contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine. Semer sur un plat de culture de 10 cm. Incuber la fraction 2 à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.
- Pour collecter la fraction 3, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 3 à 37 °C sous 5 % de CO2.
REMARQUE: À ce stade, les os deviendront plus petits et ils seront réduits en fragments. Pour vous assurer qu’aucun os n’est accidentellement aspiré dans les digestes, ce qui entraîne une perte de cellules dans le processus, utilisez une petite pipette à pointe pour recueillir les digestes (1000 à 2000 μL d’embouts de pipette). - Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.
- Pour collecter la fraction 4, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 4 à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Incuber le calvaire dans 5 mL de 5 mM d’EDTA contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS (pH 7,4) à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 rpm.
- Pour collecter la fraction 5, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 5 à 37 °C sous 5 % de CO2. Les ostéocytes peuvent être préparés pour le tri le même jour ou cultivés jusqu’à 24 heures avant le tri.
3. Préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence
- Aspirer le milieu de chaque fraction cellulaire et laver doucement avec 10 mL de PBS deux fois.
- Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,5 % dans du PBS et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 5 mL de FBS à 10 % α-MEM et pipette pour détacher délicatement les cellules. Combiner les cellules de chaque fraction en tamisant une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
- Laver les cellules avec 10 ml de PBS et recueillir en tamisant à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et ajouter 10% FBS α-MEM à la pastille. Ajuster la concentration cellulaire à environ 1 x 107 cellules/mL.
- Filtrer les cellules dans un tube à mailles en nylon de 35 μm. Les cellules sont maintenant prêtes pour FACS.
- Pour ce protocole, utilisez une buse de 100 μm. Le liquide de collecte doit être composé de 10% de FBS α-MEM. Maintenir l’échantillon trié sous agitation et à 4 °C pendant toute la durée du tri si possible.
- Avant le tri, optimisez les points de contrôle pour supprimer les artefacts et les cellules en ajustant la zone de diffusion latérale (SSC) et la zone de diffusion vers l’avant (FSC). Éliminez les doublets en ajustant la largeur SSC par rapport à la hauteur SSC et la surface FSC par rapport à la largeur FSC. Les ostéocytes GFP négatifs doivent être utilisés comme contrôle pour ajuster les paramètres de l’instrument de tri.
- Une fois la collecte des cellules terminée, centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 10 min. Lavez les cellules avec du PBS. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
- Remettez les cellules en suspension et ajustez le nombre comme vous le souhaitez en utilisant 10% FBS α-MEM.
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Representative Results
Le but de ce protocole est de démontrer le processus d’obtention de cultures d’ostéocytes primaires à partir de calvaire de souris néonatale dmp1-topaze par un processus de fractionnement utilisant la collagénase pour dégrader la matrice de collagène et l’EDTA pour la chélation du calcium, après quoi les cellules sont préparées pour FACS afin de séparer les ostéocytes des autres populations cellulaires.
Les méthodes d’obtention des ostéocytes primaires du calvaire de souris néonatale décrivent souvent l’utilisation de fractions (1\u20128) pour le tri23. Pour tester l’efficacité de cette méthode, nous avons comparé le rendement des ostéocytes obtenus à partir d’un calvaire de souris dmp1-topaze, à partir des fractions 1 à 8. Les fractions 1\u20128 ont été triées séparément pour déterminer le pourcentage et le rendement des ostéocytes de chaque fraction. Après le tri, nous avons cultivé des ostéocytes pendant 24 h sur une plaque de 96 puits pour comparer la densité des cellules ensemencées. La densité des ostéocytes dans les fractions 2\u20125 est supérieure à celle de la fraction 1, et la densité des ostéocytes commence à diminuer remarquablement dans les fractions 6, 7 et 8 (Figure 1A).
Bien que le pourcentage d’ostéocytes obtenu parmi toutes les fractions ne soit pas statistiquement significatif (Figure 1B), la densité des ostéocytes diffère considérablement. Les chercheurs20 ont rapporté l’utilisation des fractions 2\u20125 pour isoler les ostéocytes via FACS, et nous montrons à la figure 1 que l’utilisation des fractions 2\u20125 optimise le processus d’obtention des ostéocytes et diminue le temps de tri.
La figure 2 montre le nombre de cellules et la stratégie de gating pratiquée pour isoler les cellules GFP-positives des cellules GFP-négatives dans lesquelles les cellules obtenues par fractionnement du calvaria de souris GFP-négatif ont été utilisées comme témoin. Les ostéocytes obtenus par cette méthode ont été analysés pour l’expression génique de Dmp1 et SOST, qui sont des marqueurs d’ostéocytes connus. Les expressions d’ARNm Dmp1 et SOST sont plus élevées dans les ostéocytes par rapport à la fraction pré-triée 2, connue sous le nom de fraction élevée des ostéoblastes (Figure 3A). La figure 3B montre la morphologie d’un ostéocyte GFP-positif conservant une forme étoilée avec des dendrites s’étendant du corps cellulaire cultivé pendant 24 h sur un plat de culture plastique trié.
Figure 1 : Efficacité du fractionnement des ostéocytes. (A) Images microscopiques de la densité des ostéocytes des fractions 1\u20128 ensemencées sur une plaque de 96 puits capturées après 24 h du genre. Les fractions 2\u20125 ont une densité cellulaire plus élevée que les fractions 1 et 6\u20128. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Pourcentage d’ostéocytes obtenus à partir de fractions 1\u20128 mesuré par le logiciel de cytomètre en flux. Les résultats sont dérivés de trois expériences représentatives distinctes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Isolement des ostéocytes GFP-positifs par tri cellulaire activé par fluorescence. Le panneau supérieur représente les cellules isolées du calvaire C57Bl/6J CLP négatif comme contrôle du seuil de GFP. Le panneau inférieur représente le nombre de cellules et le contrôle de gating pratiqués pour isoler les ostéocytes GFP-positifs des cellules GFP-négatives en fraction 2 obtenues à partir de calvaire de souris dmp1-topaze. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation post tri des ostéocytes (A) Expression relative de l’ARNm de Dmp1 et SOST de cellules de fraction 2 cultivées pendant 24 h et d’ostéocytes cultivés pendant 24 h après tri. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Les différences statistiques ont été détectées à l’aide du test t de Student : * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Image microscopique d’un ostéocyte retenant des dendrites s’étendant vers l’extérieur du corps cellulaire cultivé pendant 24 h après le tri. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le premier ostéocyte isolé provenait d’un poulet calvaria7 isolé à l’aide de (OB7.3) ou de la variante aviaire de PHEX; Cependant, cette méthode est limitée par la disponibilité d’anticorps exploitables, car des anticorps spécifiques aux ostéocytes qui sont également spécifiques à l’espèce doivent être fabriqués. Les chercheurs ont utilisé une modification différente du processus enzymatique séquentiel pour obtenir des ostéocytes à partir d’os longs de souris et de rats; La pureté déclarée de ces cultures a été fixée à environ 70%9. Le développement du modèle murin cre a permis d’ingénierie des ostéocytes, qui expriment la GFP à leur surface. Ce modèle murin, associé à FACS, a été utilisé pour obtenir des cultures pures d’ostéocytes primaires20.
Nous omettons l’utilisation des fractions 1 et 6\u20128 car de petites quantités d’ostéocytes se détachent dans ces fractions. L’utilisation des fractions 2\u20125 donne le meilleur rendement possible d’ostéocytes sur le temps de traitement le plus court; Cela limite le temps de manipulation des ostéocytes et permet de prévenir la mort cellulaire ou une éventuelle altération de la signalisation cellulaire en raison du stress auquel la cellule est soumise lors du fractionnement. Nous cultivons également des ostéocytes pendant 24 h de pré-tri, ce qui exclut par défaut les cellules en suspension non adhérentes (cellules hématopoïétiques) lors de la préparation du tri. Cela minimise la contamination par les cellules hématopoïétiques exprimant la GFP22. Le flux de travail fourni dans ce protocole tire parti des méthodes précédemment publiées23 et raccourcit le temps de tri permettant une récupération efficace et rapide des ostéocytes avec une contamination minimale.
Les étapes critiques du protocole comprennent l’obtention d’un calvaire osseux propre et la coupe des tissus mous du cerveau ou du tissu conjonctif attaché à l’os pour limiter la contamination des cellules adhérentes (fibroblastes et cellules neurales). En outre, le pipetage des cellules pendant les étapes qui incluent l’obtention et le lavage des digestions est crucial, car les agrégats cellulaires et les doublets sont lus comme des déchets lors du tri et contribueront à un faible rendement en ostéocytes.
Les ostéocytes peuvent être triés sans culture préalable. Cependant, cela signifie qu’un plus grand nombre de cellules doivent être triées, ce qui augmente le temps de tri et augmente le risque de contamination hématopoïétique. Cela peut être atténué en appliquant un pré-tri de déplétion des cellules hématopoïétiques. Cependant, cela est éprouvant et n’est pas recommandé pour les analyses de routine et de laboratoirepar lots 22. Des problèmes peuvent survenir lors du tri en raison de la présence de gros agrégats de cellules et de doublets obstruant l’écoulement du fluide de la machine de tri. Dans notre protocole, cela n’a pas été un problème, mais cela peut être résolu en réduisant le contenu FBS du tampon de tri (moins de 10%).
Ce protocole n’est pas sans limites. Cette méthode utilise des ostéocytes de souris, qui ne ressemblent pas entièrement aux ostéocytes humains. Cela limite l’extension des résultats obtenus par l’étude des ostéocytes murins à des résultats cliniques significatifs. Des protocoles d’isolement des ostéocytes humains ont été décrits24, et les chercheurs sont encouragés à utiliser les espèces cellulaires qui servent le mieux leurs objectifs. Comme pour d’autres protocoles, les quantités d’ostéocytes obtenues à l’aide de ce protocole sont limitées et un grand nombre de souris sont nécessaires pour une analyse à grande échelle, cependant, en diminuant le temps nécessaire à la préparation et au tri des ostéocytes, des quantités plus élevées de cellules peuvent être acquises en un seul laps de temps.
Les ostéocytes obtenus par ce processus peuvent être utilisés pour d’autres cultures et co-cultures, l’analyse de l’expression génique, l’analyse en aval de l’activation / inhibition du substrat, le sondage moléculaire et les applications de coloration. Les cellules primaires peuvent également être utilisées pour construire un modèle de matrice ostéocytaire 3D ressemblant à l’environnement ostéocytaire natif pour l’étude de la mécanotransduction et de la mécanodétection.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention JSPS KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (n ° 19K10397 à H.K. et n ° 18K09862 à I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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