Summary
Este protocolo descreve a dissecção neonatal da calvária de camundongos dmp1-topázio e o isolamento de osteócitos expressando a proteína verde fluorescente através da digestão e fracionamento celular, além da preparação de osteócitos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS).
Abstract
O osteócito, antes considerado um residente passivo do osso, dada a função de bastidores de detectar a carga mecânica, agora é trazido à tona e tem sido demonstrado que tem múltiplas funções principais, como modificar ativamente a matriz extracelular e formar um órgão endócrino com o sistema lacunocanalicular que o encerra enviando mensagens para locais distantes. Devido aos métodos que tornaram possível testar o osteócito in vitro a partir do isolamento de osteócitos primários para linhagens celulares semelhantes a osteócitos, os osteócitos estão agora experimentando um interesse retumbante e uma onda de conhecimento sobre estrutura e função. Muitos aspectos da biologia dos osteócitos e da interação com outros componentes moleculares ainda precisam ser descobertos. Neste protocolo, descrevemos em detalhes o eficiente isolamento de osteócitos primários da calvária neonatal dmp1-topázio, que expressam a proteína verde fluorescente nos osteócitos, através do fracionamento celular e posterior aquisição de culturas de osteócitos primários por FACS.
Introduction
Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas dos progenitores osteoblásticos que se incorporaram em sua matrizsecretada1. São as células mais abundantes e de vida mais longa entre as populações de células ósseas. Residem em lacunas e apresentam morfologia estrelada característica, com dendritos que se estendem através de canais denominados canalículos, formando uma extensa rede de comunicação e trocas metabólicas com o meio circundante e a superfícieóssea2. Os osteócitos coreografam tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos na remodelação óssea, são as principais células mecanossensoriais que conferem adaptação à cargamecânica3, estão envolvidos na homeostase dofosfato4 e namineralização da matriz óssea5 e, juntamente com o sistema lacunocanalicular, atuam como órgão endócrino sinalizando tecidosdistantes6.
Os osteócitos situam-se dentro de uma matriz mineralizada, o que limita a acessibilidade e torna seu isolamento desafiador, dificultando a investigação in vitro. Um dos primeiros métodos de isolamento descreveu osteócitos isolados da calvária de galinha usando um anticorpo monoclonal específico para osteócitos (OB7.3)7 que mais tarde foi conhecido por ser a variante aviária do PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)8. Outros pesquisadores usaram a digestão sequencial de ossos longos de ratos 9 oucamundongos 10 para obter frações ricas em osteócitos nas quais a pureza dos osteócitos foi relatada em torno de 70%9. As limitações desse procedimento incluem a pureza sub-ótima de culturas contaminadas com outros tipos celulares além dos osteócitos e que osteócitos poderiam ser potencialmente supercultivados por outras células em cultura, uma vez que os osteócitos perderam a capacidade de se dividir. Esses desafios restringem a usabilidade de culturas de longo prazo.
Para superar essas limitações, diferentes linhagens celulares de osteócitos foram desenvolvidas. A linhagem celular MLO-Y411 e a linhagem celular MLO-A512 são notavelmente as linhagens celulares mais estudadas que são úteis para o estudo dos osteócitos em estágio inicial; entretanto, são menos úteis para estudar a sinalização de osteócitos maduros, pois expressam baixos níveis de esclerostina e FGF2313, ambos marcadores de osteócitos maduros. Outras linhagens celulares, incluindo IDG-SW3 14 e Ocy45415, expressam altos níveis de esclerostina e FGF23 e são úteis no estudo do estágio tardio dos osteócitos. As linhagens celulares mostram-se ferramentas úteis de pesquisa; No entanto, eles não vêm sem limitações, pois não representam totalmente a biologia da célula primária. Diferentes linhagens celulares representam diferentes estágios de desenvolvimento do espectro de maturidade dos osteócitos, e as linhagens celulares não conseguem representar a heterogeneidade dos osteócitosprimários16,17.
Para obter culturas puras de osteócitos primários, os pesquisadores aproveitaram o modelo de camundongo cre, no qual o promotor dmp1 de 8 kb é usado para conduzir a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em osteócitos18,19. Camundongos transgênicos duplos (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topázio) de Paic et al.19 e camundongos transgênicos dmp1-topázio de Nakashima et al.20 têm sido utilizados para obtenção de populações de osteócitos. Em que empregaram digestão sequencial e FACS de osteócitos expressando GFP para aquisição de culturas de osteócitos primários19,20. A direção do cre no camundongo repórter dmp1 Ai9 de 10 kb, que ativa a proteína tdTomato, mostrou-se presente em osteócitos, osteoblastos, músculos e células dentro da medula óssea. O promotor dmp1 de 8 kb apresentou o mesmo padrão de expressão, mas apenas uma proporção de osteoblastos e células da medula óssea expressou a proteína, o que indica que o promotor dmp1 de 8 kb é maisespecífico21. Apesar disso, os resultados obtidos com o promotor dmp1 de 8 kb devem ser interpretados com cautela, e os perfis de expressão gênica devem ser realizados rotineiramente usando marcadores específicos de osteócitos versus osteoblastos para garantir que a população obtida seja de pureza alta o suficiente.
Os marcadores osteoclastos OSCAR e Dcstamp foram encontrados em populações de osteócitos hematopoéticos não depletados vs. depletos, este achado levou os autores a concluir que os digestores obtidos a partir do fracionamento da calvária neonatal de 8 kb dmp1-topázio e da classificação da GFP estão contaminados com células hematopoéticas. A contaminação com células hematopoéticas poderia ter sido atenuada apertando a comporta de classificação da GFP, uma vez que as células hematopoéticas positivas para GFP apresentaram uma intensidade de GFP razoavelmente menor do que as células mesenquimais positivas para GFP (osteócitos)22.
Os métodos de estudo in vitro dos osteócitos têm contribuído para a riqueza recente de informações sobre a biologia dos osteócitos. No entanto, o isolamento de osteócitos continua sendo um procedimento trabalhoso e demorado, com baixo rendimento celular. O método descrito de digestão óssea utilizando colagenase e EDTA, muitas vezes até a fração 823, leva várias horas em que a viabilidade dos osteócitos é taxada. Pesquisadores relataram o uso de frações (2\u20125) para triagem celular20 e mostraram que o perfil de expressão de genes associados a osteócitos versus osteoblastos confirma o sucesso do isolamento de populações de osteócitos puros20. Neste artigo, descrevemos o processo de obtenção das frações (2\u20125) e comparamos o rendimento dos osteócitos de cada fração a partir da fração 1 a 8 para determinar o retorno dos osteócitos em cada fração. Descrevemos também a dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio e a digestão da calvária usando colagenase e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), bem como a preparação de células para FACS.
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Protocol
Todos os procedimentos e cuidados com os animais foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Universidade de Tohoku.
1. Dissecção da calvária de camundongos dmp1-topázio recém-nascidos
- Para este protocolo, use filhotes de 6\u20127 dias de idade de camundongos C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasiar camundongos com inalação de isoflurano a 5% e, em seguida, transferir os filhotes para etanol 70%.
- Transfira o filhote eutanasiado para uma placa de cultura não tratada.
- Usando tesoura e pinça, pegue a pele na base do crânio e faça uma incisão.
- Usando a primeira incisão como ponto de partida, corte em ambos os lados laterais do crânio na frente das orelhas, remova a pele e exponha a calvária.
- Segure a cabeça a partir da ponte nasal e corte a calvária ao longo da sutura lambdoide. Cortar ao longo das bordas laterais dos ossos parietais e estendê-lo para incluir a parte frontal.
- Separe a calvária do tecido cerebral subjacente.
NOTA: Para garantir uma calvária óssea limpa com mínima fixação de tecidos moles, não corte profundamente no osso; Para referência, deve-se ser capaz de ver a sombra da tesoura sob o osso. - Transferir a calvária para solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4 durante todo o protocolo). Certifique-se de que a parte côncava está voltada para cima.
2. Fracionamento da calvária de camundongos recém-nascidos
- Transferir até 5 calvárias para um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de solução de colagenase 2 mg/mL. Use solução de colagenase fresca preparada imediatamente antes do uso.
- Para preparar uma solução fresca de colagenase, adicione colagenase em pó ao tampão de isolamento (NaCl 70 mM, NaHCO3 10 mM, sorbitol 60 mM, 3 mM K 2 HPO4, CaCl2 mM, 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA), 5 mg/mL de glicose e 25 mM HEPES) a2mg/mL. Dissolva o pó de colagenase em um agitador magnético.
- Passar a solução de colagenase através de uma unidade filtrante estéril de 0,22 μm para um tubo de 50 mL e mantê-la congelada durante todo o protocolo.
- Incubar a calvária a 37 °C durante 20 min num agitador a 300 rpm para obter a fracção 1.
- Descarte o digesto da fração 1, lave a calvária com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e descarte a lavagem.
- Incubar a calvária em 5 ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 5 mM contendo 1 mg/ml de BSA em PBS, PH 7,4 a 37 °C durante 15 minutos num agitador a 300 rpm.
- Coletar o digesto em um tubo cônico de 50 mL. Lave a calvária com 5 mL de PBS e adicione a solução de lavagem ao digerimento.
NOTA: Em cada ponto de coleta do digesto e lavagem, pipetar os ossos em sua solução para desprender as células do osso e evitar duplicações e agregados celulares. - Para obter a fração 2, centrifugar o digestor a 300 x g a 4 °C por 5 min. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 8 mL de Meio Essencial α-Mínimo (MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 100 UI/mL de penicilina G e 100 μg/mL de estreptomicina. Semear em uma placa de cultura de 10 cm. Incubar a fracção 2 a 37 °C a 5% de CO2.
- Incubar a calvária em 5 ml de solução de colagenase a 37 °C durante 20 minutos num agitador a 300 rpm.
- Para coletar a fração 3, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 3 a 37 °C a 5% de CO2.
NOTA: Neste ponto, os ossos se tornarão menores, e eles serão reduzidos a fragmentos. Para garantir que nenhum osso seja acidentalmente aspirado para os digestores, o que leva à perda de células no processo, use uma pipeta de ponta pequena para coletar os digestores (pontas de pipeta de 1000 a 2000 μL). - Incubar a calvária em 5 ml de solução de colagenase a 37 °C durante 20 minutos num agitador a 300 rpm.
- Para coletar a fração 4, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 4 a 37 °C a 5% de CO2.
- Incubar a calvária em 5 mL de EDTA 5 mM contendo 1 mg/mL de BSA em PBS (pH 7,4) a 37 °C por 15 min em um agitador a 300 rpm.
- Para coletar a fração 5, repita as etapas 2.5\u20122.6. Incubar a fracção 5 a 37 °C a 5% de CO2. Os osteócitos podem ser preparados para triagem no mesmo dia ou cultivados até 24 h antes da triagem.
3. Preparação de osteócitos para triagem de células ativadas por fluorescência
- Aspirar o meio de cada fração celular e lavar suavemente com 10 mL de PBS duas vezes.
- Adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,5% em PBS e incubar as células por 5 min a 37 °C. Adicionar 5 mL de FBS a 10% α-MEM e pipetar para separar as células suavemente. Combinar as células de cada fracção peneirando um filtro de células de 40 μm num tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
- Lavar as células com 10 mL de PBS e coletar peneirando através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 10% de FBS α-MEM ao pellet. Ajustar a concentração celular para aproximadamente 1 x 107 células/mL.
- Filtrar as células num tubo tampado com malha de nylon de 35 μm. As células já estão prontas para o FACS.
- Para este protocolo, utilizar um bico de 100 μm. O fluido de coleta deve consistir de 10% de SFB α-MEM. Manter a amostra separada por agitação e a 4 °C durante toda a triagem, se possível.
- Antes da classificação, otimize o fechamento para remover artefatos e células ajustando a área de dispersão lateral (SSC) e a área de dispersão direta (FSC). Elimine duplicações ajustando a largura do SSC vs altura do SSC e a área do FSC vs largura do FSC. Os osteócitos GFP-negativos devem ser usados como controle para ajustar os parâmetros do instrumento de classificação.
- Após a conclusão da coleta celular, centrifugar as células a 300 x g a 4 °C por 10 min. Lave as células com PBS. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
- Suspenda novamente as células e ajuste o número conforme desejado usando 10% FBS α-MEM.
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Representative Results
O objetivo deste protocolo é demonstrar o processo de obtenção de culturas de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos dmp1-topázio através de um processo de fracionamento usando colagenase para degradar a matriz de colágeno e EDTA para quelação de cálcio, após o qual as células são preparadas para FACS para separar osteócitos de outras populações celulares.
Métodos para obtenção de osteócitos primários da calvária neonatal de camundongos frequentemente descrevem o uso de frações (1\u20128) para a triagem23. Para testar a eficiência deste método, comparamos o rendimento de osteócitos obtidos de uma calvária de camundongo dmp1-topázio, a partir das frações 1 a 8. As frações 1\u20128 foram classificadas separadamente para determinar a porcentagem e o rendimento de osteócitos de cada fração. Após a triagem, foram cultivados osteócitos por 24 h em uma placa de 96 poços para comparar a densidade das células semeadas. A densidade de osteócitos nas frações 2\u20125 mostra-se maior do que a da fração 1, e a densidade de osteócitos começa a diminuir notavelmente nas frações 6, 7 e 8 (Figura 1A).
Embora a porcentagem de osteócito obtida entre todas as frações não seja estatisticamente significativa (Figura 1B), a densidade de osteócitos difere dramaticamente. Pesquisadores20 relataram o uso das frações 2 a 2 para o isolamento de osteócitos via FACS, e mostramos na Figura 1 que o uso das frações 2 a 2 otimiza o processo de obtenção de osteócitos e diminui o tempo do tipo.
A Figura 2 mostra o número de células e a estratégia de gating praticada para isolar células GFP-positivas de GFP-negativas, nas quais células obtidas por fracionamento da calvária de camundongo GFP-negativo foram usadas como controle. Os osteócitos obtidos por este método foram analisados quanto à expressão gênica de Dmp1 e SOST, conhecidos marcadores de osteócitos. A expressão do mRNA de Dmp1 e SOST é maior nos osteócitos quando comparada à fração 2 pré-sort, conhecida como alta fração osteoblástica (Figura 3A). A Figura 3B mostra a morfologia de um osteócito GFP-positivo retendo uma forma estrelada com dendritos estendendo-se do corpo celular cultivado por 24 h em uma placa de cultura plástica tipo post.
Figura 1: Eficiência do fracionamento dos osteócitos. (A) Imagens microscópicas da densidade de osteócitos das frações 1\u20128 semeadas em uma placa de 96 poços capturadas após 24 h do tipo. As frações 2\u20125 têm uma densidade celular maior do que as frações 1\u20128. Barra de escala = 100 μm. (B) Porcentagem de osteócitos obtidos das frações 1\u20128 medida pelo software do citômetro de fluxo. Os resultados são derivados de três experimentos representativos separados. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento de osteócitos GFP-positivos via triagem celular ativada por fluorescência. O painel superior representa células isoladas da calvária C57Bl/6J littermate negativa para GFP como controle do limiar de GFP. O painel inferior representa o número de células e o controle de gating praticados para isolar osteócitos GFP-positivos de células GFP-negativas na fração 2 obtidas da calvária de camundongos dmp1-topázio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização dos osteócitos pós-classificação. (A) Expressão relativa de RNAm de Dmp1 e SOST de células da fração 2 cultivadas por 24 h e osteócitos cultivados por 24 h pós-classificação. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Diferenças estatísticas foram detectadas pelo teste t de Student: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Imagem microscópica de um osteócito retendo dendritos estendendo-se para fora do corpo celular cultivado por 24 h após a classificação. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O primeiro osteócito isolado foi de uma galinhacalvária 7 isolada usando (OB7.3) ou a variante aviante de PHEX; no entanto, este método é limitado pela disponibilidade de anticorpos viáveis, uma vez que anticorpos osteocito-específicos que também são espécie-específicos têm de ser fabricados. Os pesquisadores usaram uma modificação diferente do processo enzimático sequencial para obter osteócitos de ossos longos de camundongos e ratos; A pureza relatada dessas culturas foi fixada em cerca de 70%9. O desenvolvimento do modelo de camundongos cre permitiu a engenharia de osteócitos, que expressam GFP em sua superfície. Este modelo murino, juntamente com o FACS, foi utilizado para a obtenção de culturas puras de osteócitosprimários20.
Omitimos o uso das frações 1 e 6\u20128, pois pequenas quantidades de osteócitos se desprendem nessas frações. O uso das frações 2\u20125 proporciona o melhor rendimento possível de osteócitos no menor tempo de processamento; Isso limita o tempo de manuseio dos osteócitos e atua no sentido de prevenir a morte celular ou uma possível alteração na sinalização celular como resultado do estresse a que a célula é submetida durante o fracionamento. Também cultivamos osteócitos por 24 h de pré-classificação, o que, por padrão, exclui células em suspensão não aderentes (células hematopoiéticas) durante o preparo da classificação. Isso minimiza a contaminação por células hematopoéticas que expressam GFP22. O fluxo de trabalho proporcionado neste protocolo aproveita métodos previamentepublicados23 e encurta o tempo do tipo, permitindo uma recuperação eficiente e rápida dos osteócitos com o mínimo de contaminação.
As etapas críticas do protocolo incluem a obtenção de uma calvária óssea limpa e o corte de tecidos moles do cérebro ou tecido conjuntivo ligado ao osso para limitar a contaminação de células aderentes (fibroblastos e células neurais). Além disso, pipetar as células durante as etapas que incluem a obtenção e lavagem dos digestores é crucial, uma vez que agregados celulares e duplos são lidos como resíduos durante a triagem e contribuirão para um baixo rendimento de osteócitos.
Os osteócitos podem ser triados sem cultura prévia. No entanto, isso significa que um número maior de células tem que ser triado, aumentando o tempo do tipo e aumentando a chance de contaminação hematopoiética. Isso pode ser atenuado com a aplicação de pré-classificação de depleção de células hematopoiéticas. No entanto, isso é desgastante e não recomendado para análises laboratoriais de rotina e em lote22. Podem surgir problemas durante a triagem devido à presença de agregados de células grandes e duplicatas que obstruem o fluxo de fluido da máquina de classificação. Em nosso protocolo, isso não foi um problema, mas isso pode ser resolvido reduzindo o conteúdo FBS do buffer de classificação (menos de 10%).
Este protocolo não vem sem limitações. Este método utiliza osteócitos de camundongo, que não se assemelham inteiramente aos osteócitos humanos. Isso restringe a extensão dos resultados obtidos pelo estudo de osteócitos murinos a desfechos clínicos significativos. Protocolos para isolamento de osteócitos humanos têm sidodescritos24, e os pesquisadores são encorajados a utilizar a espécie celular que melhor atenda aos seus objetivos. Assim como em outros protocolos, as quantidades de osteócitos obtidas por esse protocolo são limitadas, e um grande número de camundongos é necessário para análise em larga escala, no entanto, diminuindo o tempo necessário para o preparo e classificação dos osteócitos, maiores quantidades de células podem ser adquiridas em um único período de tempo.
Os osteócitos obtidos através deste processo podem ser usados para cultura e co-cultura posteriores, análise de expressão gênica, análise a jusante da ativação/inibição de substratos, sondagem molecular e aplicações de coloração. Células primárias também podem ser usadas para construir um modelo de matriz de osteócitos 3D semelhante ao ambiente osteocítico nativo para o estudo da mecanotransdução e mecanosensing.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa JSPS KAKENHI da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (No. 19K10397 para H.K. e No. 18K09862 para I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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