Summary
从解剖的植入物中分离细胞并通过流式细胞术对其进行表征，可以显著有助于了解针对植入物的免疫反应模式。本文描述了一种从解剖植入物中分离细胞及其染色以进行流式细胞术分析的精确方法。
Abstract
在个体体内植入实验室培养的组织或医疗设备的成功取决于受体宿主的免疫反应。将植入物视为异物，敌对和失调的免疫反应可能导致植入物的排斥反应，而调节反应和稳态的恢复可能导致其接受。分析在 体内 或 离体 环境中解剖的植入物的微环境有助于了解免疫反应的模式，这最终有助于开发新一代生物材料。流式细胞术是一种众所周知的技术，用于根据细胞表面标志物表征免疫细胞及其亚群。本综述描述了一种基于手动切割、酶消化和通过细胞过滤器过滤的方案，用于从解剖的植入物组织中分离均匀的细胞悬浮液。此外，还解释了多色流式细胞术染色方案，以及初始流式细胞仪设置的步骤，以通过流式细胞术表征和定量这些分离的细胞。
Introduction
医学领域的进步导致频繁使用植入材料来支持受损组织的功能或再生长 1,2。这些设备包括起搏器、重建美容植入物和用于骨折固定的骨科板等设备 3,4。然而，用于制造这些植入物的材料及其植入位置在决定这些植入物的成功方面起着重要作用5,6,7。作为异物，这些植入物可以产生来自宿主的免疫反应，从而导致排斥或耐受8.这一因素推动了生物材料研究，以产生能够在植入后吸引所需免疫反应的材料 9,10,11,12。
免疫反应是再生医学领域的基本要求，在再生医学领域，组织或器官在实验室的生物材料骨架（支架）周围生长，以替换受损的组织或器官13,14,15,16。在再生医学中，目标是通过使用细胞、信号和支架来替换缺失或受损的组织，其中每个细胞都可以通过免疫反应极大地调节17。此外，即使需要缺乏免疫反应，也很少缺乏免疫活性，而不是存在所需的调节谱18。流式细胞术等技术可以在表征对用于涂覆植入装置或开发组织工程支架的各种生物材料的免疫反应模式方面发挥重要作用19。
反过来，这些信息最终将有助于开发免疫系统可以很好地耐受的植入物的生物材料，或者开发可以在组织工程中发挥建设性作用的支架。正确制备用于流式细胞术分析的样品是避免通过荧光激活细胞分选进行免疫表征结果不准确的重要步骤20,21。因此，本综述提出了一种详细的方法，可用于从支架组织中分离细胞、对细胞悬液进行染色和流式细胞术分析。
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Protocol
注： 图1 概述了流式细胞术方案。
1）试剂制备
- 准备用于稀释酶和组织培养的培养基。
- 将 5 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） 缓冲溶液加入 500 mL RPMI 培养基中并摇匀。将培养基储存在4°C直至进一步使用。
- 计算酶溶液的体积。
注：酶溶液的体积是含有酶（胶原酶和DNase I）的培养基的体积，该酶在6孔板中消化切块组织所需的酶（胶原酶和DNase I）;这取决于样本的数量。- 使用以下公式计算所需的体积：
（待消化样品数） × 5 mL 无血清 RPMI 和 10 mM HEPES 缓冲液
注：例如，对于 0.1 至 0.3 g 解剖的脾脏，使用 5 mL 培养基制备酶溶液。本手稿中描述的酶消化方案主要用于从小鼠解剖的软组织（范围为0.1至1g），包括大脑，肾脏，皮肤，肝脏，肺，脾脏，肌肉，以及由合成材料或细胞外基质蛋白制成的皮下植入物周围的胶囊。消化坚硬的软骨组织可能需要不同的条件和体积的消化酶，这只能通过优化来确定。 - 计算酶溶液所需的胶原酶和 DNase 的量。
注：在该方案中，使用0.25mg / mL胶原酶和0.2mg / mL DNase I。胶原酶和脱氧核糖核酸酶所需的工作浓度可能因不同类型的组织而异19。
- 使用以下公式计算所需的体积：
- 通过将 1 μL 活性染料（参见 材料表）加入 999 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中来制备 1：1000 的活性染料溶液，并涡旋溶液。将溶液储存在4°C的黑暗中，直至进一步使用。
- 通过将 1 g 牛血清白蛋白 （BSA） 加入 100 mL PBS 中来制备染色缓冲液，并涡旋溶液直至 BSA 完全溶解。将溶液储存在4°C直至进一步使用。
2） 设置酶消化板
- 设置一个 6 孔板，每个孔中装有 70 μm 细胞过滤器。将步骤 1.1.1 中制备的 3 mL 培养基加入每个孔中，并在冰上孵育。
- 将剩余的培养基（2mL /孔）储存在37°C的培养箱或水浴中，以悬浮计算量的胶原酶和DNase I（步骤1.2.2）。
3） 细胞分离
- 将解剖的植入物/组织放入盘子中，然后用剪刀切成细块。或者，使用组织解离器或手持式均质器使用机械破碎方法。由于白细胞数量众多，在每次运行中解剖脾脏以用作染色对照。
注意：由于某些材料会引起更高水平的纤维化，因此该方案适用于高度纤维化和最小纤维化的材料。然而，在染色前，应评估每种处理方法在消化后的细胞产量和活力。避免夹层时外周血污染。 - 将胶原酶和DNase I（在步骤1.2.2中计算的体积）加入已加热至37°C的剩余RPMI（2mL）中。 向每个孔中加入 2 mL 完全酶溶液。
- 将板置于37°C和100rpm的孵育振荡器中45分钟。
注意： 堆叠板时要小心，因为这会抑制适当的热传递。 - 同时，用剪刀从 1000 μL 吸头末端切碎 3-4 mm，准备悬浮液分液吸头。孵育后，将悬浮液在孔中上下移液，使用切碎的尖端彻底混合。将细胞过滤器放在 50 mL 锥形管的顶部，并将消化的溶液通过细胞过滤器。
注意：70 μm 细胞过滤器足以将细胞与植入的生物材料（例如藻酸盐）分离。如果需要更高的纯度，请使用密度梯度分离等工艺来获得富集的白细胞群。 - 用1x PBS溶液冲洗孔，并通过过滤器转移冲洗体积，然后用1x PBS溶液加入过滤器的洗涤液，直到管中的体积达到50mL。
注意：1x PBS必须在室温下，以防止消化物粘度增加，并允许在离心过程中进行细胞沉淀。 - 在室温下以300× g 离心管5分钟。离心后，使用血清移液管小心地吸出上清液，不要干扰沉淀。将沉淀重悬于1000μL的1x PBS中，并将悬浮液转移到微量离心管中。
- 将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合，并将悬浮液加载到计数室载玻片上，以便使用自动细胞计数仪计数细胞，或在血细胞计数器上通过显微镜下的常规方法进行计数。或者，使用流式细胞术细胞计数微球。
4） 流式细胞术染色
- 参见 图 2 ，了解 45 个样品、荧光负一 （FMO） 对照、补偿对照和完全染色脾脏样品对照的 14 色实验的示例板布局。估计细胞总数后，计算每个样品染色1×106 个细胞所需的细胞悬液体积，以及每个补偿和FMO对照染色0.5×106 个细胞所需的细胞悬液体积。将所需体积的细胞悬液分配到 V 形底 96 孔板的孔中，并用 1x PBS 将体积补足至 100 μL。
注：例如，如果在步骤3.6中获得的1000μL细胞悬液含有40×106 个细胞，则对于1×106 个细胞，需要1000/40×106 = 25μL细胞悬液。 - 将板在4°C下以300× g 离心5分钟，吸出上清液，然后用100μL的1：1000活性染料溶液将细胞重悬于样品孔和补偿对照孔中以确定活力（参见 材料表）。
- 对于其他补偿孔以及FMO和未染色孔中的细胞，用100μL 1x PBS重悬它们。
- 将细胞在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
- 同时，制备用于对样品和 FMO 对照进行染色的表面抗体混合物：每个样品 50 μL 或 FMO。有关抗体混合物的示例，请参见 表1 。
- 孵育后，向每个孔中加入100μl1x PBS，在4°C下以300× g 旋转5分钟。
- 吸出上清液并重悬于200μL染色缓冲液（1x PBS + 1%BSA）中;在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 吸出上清液，并用 50 μL 1x PBS 将细胞重悬于补偿、FMO 和未染色孔中。将 50 μL 抗体混合物加入相应的样品孔和 FMO 孔中。将相应的抗体添加到不同的补偿孔中。
- 将板在4°C的黑暗中孵育45分钟。 孵育后，在每个孔中加入150μL染色缓冲液，并在4°C下以300× g 离心细胞悬液5分钟。
- 吸出上清液，用200μL染色缓冲液重悬细胞，并在4°C下以300× g 离心细胞悬液5分钟。
- 如果分析样品时没有固定，请将其重悬于 200 μL 染色缓冲液中，然后继续执行第 6 部分关于细胞仪设置和样品分析的内容。如果固定细胞，洗涤后吸出上清液，并加入 100 μL 固定剂，例如 4% 多聚甲醛。如果对细胞内标志物进行染色，请继续执行关于细胞内染色的第5部分，并固定和透化细胞（参见 材料表）。在4°C的黑暗中孵育细胞20分钟。
注意：由于固定会影响某些荧光团的荧光强度，因此在有固定和没有固定的情况下评估每个panel。 - 孵育后，加入100μL的1x PBS，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 吸出上清液，重悬于1x PBS中，并在4°C下以300× g 离心5分钟。
- 将细胞重悬于200μL染色缓冲液中，并在流式细胞术分析之前储存在4°C。
5） 细胞内染色
- 从步骤4.11继续进行细胞内标志物的固定和通透，加入100μL适当的缓冲液。将细胞在4°C下以350× g 离心5分钟。 吸出上清液，并将沉淀重悬于200μL固定剂透化剂溶液中;将细胞在4°C下以350× g 离心5分钟。 吸出上清液，并用在适当缓冲液中稀释的细胞内抗体重悬沉淀。
注：抗体类型和稀释度将取决于靶细胞。例如，一种常见的细胞内标记物是用于调节性 T 细胞的叉头盒 P3，通常以 1：100 的稀释度使用。 - 将细胞悬浮液在4°C下在黑暗中孵育45分钟。 孵育后，加入150μL适当的缓冲液，并在4°C下以350× g 离心悬浮液5分钟。
- 吸出上清液，将细胞重悬于200μL染色缓冲液中，然后在4°C下以300× g 离心5分钟。 将细胞吸出并重悬于200μL染色缓冲液中，用于流式细胞术分析。
6） 流式细胞仪和补偿设置
- 在运行样品之前，如果使用基于磁珠的补偿而不是基于细胞的补偿，请立即准备补偿磁珠（参见 材料表）。
- 标记每种荧光染料偶联抗体的单独微量离心管，并向每个试管中加入 100 μL 1x PBS，然后加入一整滴抗小鼠阴性对照补偿珠和一滴阳性对照补偿珠。将 1 μL 适当的抗体添加到每个单独的试管中。在采集前涡旋并孵育5分钟。
注意：由于某些染料（如 BUV737）无法与磁珠结合，因此请使用基于细胞的对照。
- 标记每种荧光染料偶联抗体的单独微量离心管，并向每个试管中加入 100 μL 1x PBS，然后加入一整滴抗小鼠阴性对照补偿珠和一滴阳性对照补偿珠。将 1 μL 适当的抗体添加到每个单独的试管中。在采集前涡旋并孵育5分钟。
- 在每次实验之前，通过使用示踪微球运行流式细胞仪设置来校准流式细胞仪，并保持每个实验的流式细胞仪设置。
- 在分析样品之前，通过运行未染色的样品来调整流式细胞仪，以调整侧向散射 （SSC） 与前向散射 （FSC） 图上的细胞群，使细胞群落在图的中心并且不会超出规模。
- 短暂运行染色样品以调整FSC和SSC以及每个通道的电压，以确保没有事件超出每个通道的对数刻度。记录每个补偿对照的 5,000 个事件，然后对阳性和阴性群体进行门控。计算补偿矩阵，然后运行样本，为感兴趣的群体收集至少 1,000 个事件。
注意：应验证较大颜色面板上的补偿，因为自动补偿容易出现补偿过高或不足的情况。每个参数都应与所有其他参数进行对比，以监测过度补偿或补偿不足的迹象，并应评估每个单色对照。较大颜色实验的复杂补偿应在合作者或具有丰富流式细胞术经验的核心设施的协助下进行。新型流式细胞仪（如光谱流式细胞仪）通过称为光谱分离的过程利用荧光团的全光谱，与单独的标准补偿相比，可以更清晰地区分荧光重叠22。
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Representative Results
用于免疫分析的流式细胞术panel的开发过程通常依赖于将结果与现有数据和现场文献进行比较。了解群体在流式细胞术中的呈现方式对于正确解释数据至关重要。无论如何，群体和细胞类型在不同的组织中可能以不同的方式出现，因此可以预料到会有一些变异性。在明确定义的对照组织的背景下，可以针对具有充分研究的细胞类型的已知组织评估这种染色优化。 图 3 显示了 14 色 FACS 对对照小鼠组织的结果。在本例中，脾脏用于识别所有染色的标志物，并表明染色在技术上是有效的。从那时起，在未知条件下进行测试变得更加容易，对荧光团的选择充满信心，并针对不同的组织来源优化方案。 图 3 还显示了从小鼠脾脏中分离出的不同细胞类型的群体19。
在这里，可以观察到几个明显的群体，如Ly6G+中性粒细胞，以及Ly6C在不同单核细胞类别上的不同表达水平。CD11chiMHCII+ 树突状细胞在针对 CD11b 进行门控以排除巨噬细胞和其他髓系细胞（如中性粒细胞和单核细胞）时很容易显现。通过关注该 CD11c+ 群体，可以找到 CD206+CD86+ 树突状细胞的亚群。CD86 和 CD206 被纳入表型髓样细胞，因为它们处于更像 M1 （CD86hi） 而不是更像 M2 （CD206hi） 的极化状态。F4/80 显示出表达梯度，这在各种巨噬细胞群体中很常见。Siglec-F 存在于两个群体中，即 F4/80+ 和 F4/80-，很可能分别对应于巨噬细胞亚群和嗜酸性粒细胞。虽然可以对细胞类型进行这些指定，但重要的是要注意，表达不同标记物的细胞应该以功能性的方式观察，而不是更二元的分类。承认巨噬细胞在脾脏和植入物周围的异物囊中可能有所不同，这很重要，可以避免对结果的潜在误解。
图 1：流式细胞术染色方案概述。 制备包括解剖感兴趣的组织，然后进行 1） 手动切割，2） 酶消化，3） 细胞过滤和洗涤，以及 4） 用荧光标记的抗体染色，然后进行流式细胞术分析。插图是用 Biorender 制作的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：流式细胞术染色的板布局示例。 该布局包括样品、荧光负一 （FMO） 对照、补偿对照和对照组织样品（脾脏）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：对照小鼠组织进行 14 色 FACS 染色的代表性结果。 小鼠脾细胞的髓样细胞表型分析，以手动门控和自动 t 随机邻居嵌入 （t-SNE） 聚类算法为例进行数据显示。这个数字转载自 Sadtler 和 Elisseeff19。缩写：FACS=荧光激活细胞分选;SSC = 侧向散射;CD = 分化簇;PE = 藻红蛋白;CCR = C-C 趋化因子受体类型;MHC = 主要组织相容性复合物;PerCP = peridinin 叶绿素蛋白复合物。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 试剂/抗体 | 每个样品 μL |
| CD86 BUV395型 | 0.25 |
| CD45 BUV737型 | 0.5 |
| CD8a BV421型 | 0.25 |
| LY6克BV510 | 0.125 |
| 西格莱克F BV605 | 0.25 |
| 重工BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488型 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 聚乙烯 | 0.2 |
| CD197 PE/耀眼594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7型 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700型 | 0.25 |
| fc 块 | 1 |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus（BD Brilliant Stain Buffer Plus） | 10 |
| 1 个 PBS | 35.975 |
| 总体积： | 50微升 |
表 1：表面抗体混合物示例。用于小鼠组织骨髓表型分析的抗体混合物示例。
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Discussion
本综述描述了一种从生物材料植入物中分离细胞以获得均匀细胞悬液的详细方法。此外，还提供了用于多色流式细胞术的细胞悬液染色的详细方案，以及配置流式细胞仪以获得最佳结果的步骤。细胞分离方法可能涉及多个步骤，通常利用手动组织解剖，然后用蛋白水解酶进行酶消化，以解离组织中的细胞外基质并破坏细胞-细胞连接，从而将单个细胞从组织中释放出来。消化后，需要进一步处理，例如细胞过滤，以去除剩余的碎片并确保单细胞悬浮液。一些具有高水平碎片或其他细胞类型（如肿瘤）的样品可能需要通过使用密度分离介质进行更彻底的清理23。如果没有适当的样品净化，数据可能会因碎片或其他细胞群遮挡目标细胞群而出现偏差。过多的碎屑也会导致流式细胞仪完全或部分堵塞。
虽然免疫细胞的表征也可以通过其他方法进行，例如光学显微镜，但通过对细胞细胞离心制剂进行差异细胞计数，流式细胞术可以基于细胞表面标志物对细胞进行更准确的表征。此外，流式细胞术数据更精确，因为它们可以表征和量化悬浮液中的数百万个细胞，并且可以提供不同细胞亚群的准确估计，比仅基于 400 个细胞的手动差异计数快得多24。本文显示的结果依赖于迭代panel设计，通过使用多种在线工具进行抗体选择，以比较激发和发射光谱以及理论重叠，具体取决于流式细胞仪配置。在设计较大的颜色实验时，最好从干净的石板开始，而不是添加到较小的颜色面板上，以便充分考虑抗原丰度、荧光团亮度和光谱重叠。
分析特定免疫细胞的不同亚群的研究需要足够数量的整体细胞来进行流式细胞术，因为细胞数量较少可能会在通过细胞分选或获得准确估计值进行分离时构成重大挑战。通过使用磁珠在较短的时间内分离和富集特定的免疫细胞（如中性粒细胞）和有限的洗涤时间，可以克服这一挑战25。从肺等器官组织中分离的细胞可能含有大量粘液，这会使细胞悬液“粘稠”，并导致流式细胞术过程中双峰事件数量增加26,27。在染色缓冲液中加入螯合剂（如2 mM乙二胺四乙酸）可以防止此类样品中细胞聚集。
此外，将细胞悬浮在增加体积的缓冲液中也可以通过减少细胞间相互作用来限制双峰的产生。染色程序应针对每个不同的组织、染色方案、流式细胞仪和抗体组合进行彻底优化。一些荧光基团可能对固定剂更敏感，一些细胞类型对不同的细胞分离和处理方法更敏感，并且许多细胞类型在不同组织和不同位置的表现不同。通过适当的制备和勤奋的分析，流式细胞术可以产生详细的细胞和蛋白质水平分析，以表征支架和生物材料免疫微环境。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院校内研究计划的部分支持，包括国家生物医学成像和生物工程研究所。 免责声明：美国国立卫生研究院、其官员和员工不推荐或认可任何公司、产品或服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
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