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Behavior

Évaluation comportementale de la fonction visuelle via la réponse optomotrice et de la fonction cognitive via Y-Maze chez les rats diabétiques

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

La dégénérescence neuronale dans les yeux et le cerveau à la suite du diabète peut être observée grâce à des tests comportementaux effectués sur des rongeurs. Le labyrinthe Y, une mesure de la cognition spatiale, et la réponse optomotrice, une mesure de la fonction visuelle, fournissent tous deux un aperçu des diagnostics et des traitements potentiels.

Abstract

La réponse optomotrice et le labyrinthe en Y sont des tests comportementaux utiles pour évaluer respectivement la fonction visuelle et cognitive. La réponse optomotrice est un outil précieux pour suivre les changements dans les seuils de fréquence spatiale (SF) et de sensibilité au contraste (CS) au fil du temps dans un certain nombre de modèles de maladies de la rétine, y compris la rétinopathie diabétique. De même, le labyrinthe Y peut être utilisé pour surveiller la cognition spatiale (mesurée par l’alternance spontanée) et le comportement exploratoire (mesuré par un certain nombre d’entrées) dans un certain nombre de modèles de maladies qui affectent le système nerveux central. Les avantages de la réponse optomotrice et du labyrinthe en Y comprennent la sensibilité, la vitesse des tests, l’utilisation de réponses innées (l’entraînement n’est pas nécessaire) et la capacité d’être effectué sur des animaux éveillés (non anesthésiés). Ici, des protocoles sont décrits à la fois pour la réponse optomotrice et le labyrinthe Y et des exemples de leur utilisation montrés dans des modèles de diabète de type I et de type II. Les méthodes comprennent la préparation des rongeurs et de l’équipement, la performance de la réponse optomotrice et du labyrinthe en Y, et l’analyse des données post-test.

Introduction

Plus de 463 millions de personnes vivent avec le diabète, ce qui en fait l’une des plus grandes épidémies mondiales1. L’une des complications graves qui découlent du diabète est la rétinopathie diabétique (DR), l’une des principales causes de cécité chez les adultes américains en âge de travailler2. Au cours des 30 prochaines années, le pourcentage de la population à risque de RD devrait doubler, il est donc crucial de trouver de nouvelles façons de diagnostiquer la RD à ses premiers stades afin de prévenir et d’atténuer le développement de la RD3. On pense traditionnellement que la RD est une maladie vasculaire4,5,6. Cependant, maintenant avec des preuves de dysfonctionnement neuronal et d’apoptose dans la rétine qui précèdent la pathologie vasculaire, la DR est définie comme ayant des composants neuronaux et vasculaires4,5,6,7,8,9. Une façon de diagnostiquer la RD serait d’examiner les anomalies neuronales de la rétine, un tissu qui peut être plus vulnérable au stress oxydatif et à la tension métabolique due au diabète que d’autres tissus neuronaux10.

Les déclins de la fonction cognitive et motrice se produisent également avec le diabète et sont souvent corrélés avec des changements rétiniens. Les personnes âgées atteintes de diabète de type II présentent des performances cognitives de base moins bonnes et présentent un déclin cognitif plus exacerbé que les participants témoins11. De plus, la rétine a été établie comme une extension du système nerveux central et des pathologies peuvent se manifester dans la rétine12. Cliniquement, la relation entre la rétine et le cerveau a été étudiée dans le contexte de la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies, mais n’est pas couramment explorée avec le diabète12,13,14,15,16. Les changements dans le cerveau et la rétine au cours de la progression du diabète peuvent être explorés à l’aide de modèles animaux, y compris le rat STZ (un modèle de diabète de type I dans lequel la toxine, la streptozotocine ou STZ, est utilisée pour endommager les cellules bêta pancréatiques) et le rat Goto-Kakizaki (un modèle polygénique du diabète de type II dans lequel les animaux développent une hyperglycémie spontanément vers l’âge de 3 semaines). Dans ce protocole, une description du labyrinthe Y et de la réponse optomotrice pour évaluer les changements cognitifs et visuels chez les rongeurs diabétiques, respectivement, est fournie. La réponse optomotrice (OMR) évalue la fréquence spatiale (similaire à l’acuité visuelle) et la sensibilité au contraste en surveillant les mouvements réflexifs caractéristiques de suivi de la tête pour évaluer les seuils visuels pour chaque œil17. La fréquence spatiale fait référence à l’épaisseur ou à la finesse des barres, et la sensibilité au contraste fait référence au contraste entre les barres et l’arrière-plan (Figure 1E). Pendant ce temps, le labyrinthe en Y teste la mémoire spatiale à court terme et la fonction exploratoire, observées à travers des alternances spontanées et des entrées à travers les bras du labyrinthe.

Les deux tests peuvent être effectués chez des animaux éveillés et non anesthésiés et ont l’avantage de capitaliser sur les réponses innées des animaux, ce qui signifie qu’ils ne nécessitent pas de formation. Les deux sont relativement sensibles, en ce sens qu’ils peuvent être utilisés pour détecter les déficits au début de la progression du diabète chez les rongeurs, et fiables, en ce sens qu’ils produisent des résultats en corrélation avec d’autres tests visuels, rétiniens ou comportementaux. De plus, l’utilisation de l’OMR et du labyrinthe Y en conjonction avec des tests tels que l’électrorétinogramme et la tomographie par cohérence optique peut fournir des informations sur le moment où des changements rétiniens, structurels et cognitifs se développent les uns par rapport aux autres dans les modèles de maladie. Ces recherches pourraient être utiles pour identifier les dégénérescences neuronales dues au diabète. En fin de compte, cela pourrait conduire à de nouvelles méthodes de diagnostic qui identifient efficacement la RD dans les premiers stades de la progression.

Les systèmes OMR et Y-maze utilisés pour développer ce protocole sont décrits dans la Table des matériaux. Des recherches antérieures sur l’OMR, par Prusky et al.18, et le labyrinthe Y, par Maurice et al.19, ont été utilisées comme point de départ pour développer ce protocole.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par l’Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee et conformes au guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications, 8e édition, mise à jour 2011).

1. La réponse optomotrice (OMR)

  1. Configurer l’appareil OMR (détails sur l’appareil et le logiciel dans la table des matériaux)
    1. Choisissez la plate-forme de taille appropriée pour le rongeur : souris, rat ou rat grand ou grand rat (Figure 1A).
    2. Ouvrez le logiciel OMR, qui devrait s’ouvrir sur une fenêtre avec plusieurs onglets d’options et un flux vidéo en direct de l’intérieur de l’OMR / tambour virtuel (Figure 1B). Effectuez un zoom avant ou arrière avec la caméra vidéo selon les besoins afin que la plate-forme et son environnement soient visibles.
    3. Notez les icônes le long du côté gauche de l’image en direct (Figure 1C). Cliquez sur l’icône d’astérisque et l’icône de bandes rotatives afin que l’astérisque vert et les bandes tournantes vertes disparaissent du flux en direct.
    4. Cliquez sur l’icône de la boussole pour qu’un cercle vert et deux lignes perpendiculaires apparaissent. Étirez le cercle vert pour qu’il s’aligne parfaitement avec le cercle noir sur la plate-forme, ce qui garantira que l’OMR est parfaitement aligné.
    5. Cliquez sur l’icône de la boussole car il n’est pas nécessaire de voir le cercle pendant le test. Cliquez sur l’icône d’astérisque vert et l’icône de bandes tournantes vertes pour les faire réapparaître. Notez que les bandes vertes tournent dans la même direction que les rayures dans le tambour, ce qui permet au chercheur de connaître la direction des rayures.
    6. Cliquez sur l’onglet Test . Sous Tests, cliquez sur l’onglet Psychophysique . Sous Seuil, sélectionnez Fréquence pour mesurer la fréquence spatiale.
      REMARQUE: Le logiciel OMR utilise un paradigme d’escalier pour calculer automatiquement la fréquence spatiale (SF). Le contraste sera maintenu à 100%.
    7. Sous Test, cliquez sur l’onglet Préréglages . Sélectionnez les paramètres par défaut pour Mouse18 ou Rat20.
    8. Sous Test, cliquez sur l’onglet Occultation . Cochez la case Vide lors du suivi , qui mettra en pause les rayures / videra les écrans d’ordinateur dans le tambour chaque fois que la souris est cliquée avec le bouton droit de la souris.
    9. Cliquez sur l’onglet Résultats , où les résultats du test seront affichés.
  2. Évaluer la fréquence spatiale
    1. Placez le rongeur sur la plate-forme circulaire au centre de la chambre de réalité virtuelle comprenant quatre écrans d’ordinateur montrant des caillebotis sinusoïdaux verticaux entourant la chambre à une vitesse de 12 ° / s (Figure 1D).
    2. Notez que la caméra vidéo positionnée en haut de la chambre projette le comportement du rongeur en direct sur l’écran de l’ordinateur.
    3. Recherchez la présence ou l’absence d’actions réflexives par la tête du rongeur lorsque les caillebotis se déplacent dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que les barres illustrées sont visibles dans le programme, elles montreront la direction du mouvement du caillebotis.
      1. Surveillez la tête du rongeur pour qu’elle se déplace dans la même direction que les caillebotis. Attendez qu’il y ait une poursuite en douceur, pas des rafales erratiques de mouvement de la tête, pour le compter comme un suivi.
      2. Cliquez sur Oui ou Non selon le cas. Notez que SF commencera avec 0,042 cyc/deg et s’ajustera avec chaque oui et non pour devenir plus facile ou plus difficile (Figure 1E). Cliquez sur Réinitialiser si le test doit être réinitialisé en raison d’un clic accidentel ou incorrect sur oui et non.
    4. Pendant que le rongeur est testé, assurez-vous de garder l’astérisque positionné sur la tête du rongeur.
      REMARQUE: Cela a deux effets: 1) Il maintient la fréquence spatiale correcte. Si l’astérisque est positionné entre les épaules, par exemple, la fréquence spatiale sera plus basse et les barres seront plus faciles à voir, ce qui entraînera un score faussement élevé. 2) Pour les rongeurs avec de légers mouvements de la tête, l’astérisque permet de mesurer plus facilement si la tête bouge réellement.
    5. Surveillez le système pour dire « Terminé » lorsque la fréquence spatiale du rongeur est atteinte. Notez que les boutons Oui et Non ne seront plus cliquables.
    6. Cliquez sur l’onglet Résultats , qui affichera la fréquence spatiale pour l’œil gauche, l’œil droit et les yeux combinés.
      REMARQUE: Parfois, le logiciel est configuré de telle sorte que les résultats sont inversés, c’est-à-dire que l’œil droit est signalé comme l’œil gauche et l’œil gauche est signalé comme l’œil droit. Cela a été découvert lors de l’évaluation de rongeurs qui n’avaient qu’un seul œil blessé dans un modèle de glaucome.
  3. Évaluer la sensibilité au contraste
    REMARQUE: Les tests de sensibilité au contraste peuvent être effectués immédiatement après l’étape de mesure de la fréquence spatiale ou seuls le même jour ou un jour différent si le rongeur semble fatigué après un test de fréquence spatiale (suivez les étapes 1 à 2.2 si vous ne testez que la sensibilité au contraste).
    1. Cliquez sur l’onglet Tests , puis sur l’onglet Psychophysique . Sous Seuil, sélectionnez Contraste (unique) pour mesurer la sensibilité au contraste.
    2. En utilisant également un paradigme d’escalier, commencez les caillebotis avec une constante SF au sommet de la courbe de sensibilité au contraste (CS). Pour ce faire, cliquez sur l’onglet Stimulus puis sur l’onglet Caillebotis . Dans la zone Fréquence spatiale , tapez 0,064 pour les rats et 0,103 pour les souris.
    3. Commencez le contraste à 100% et recherchez les mêmes mouvements réflexifs de la tête que ceux observés lors des tests de fréquence spatiale. Notez que le contraste diminuera au fur et à mesure que le test progresse jusqu’à ce que le rongeur n’ait plus de mouvements réflexifs de la tête en réponse au stimulus (Figure 1E).
    4. Surveillez le système pour dire « Terminé » et les boutons Oui et Non ne sont plus cliquables une fois que le rongeur ne répond plus au stimulus visuel et que le seuil de sensibilité au contraste a été atteint. Cliquez sur l’onglet Résultats , où la sensibilité au contraste de l’œil gauche, de l’œil droit et des yeux combinés sera répertoriée.
  4. Effectuer une analyse post-test
    1. Pour les études sur la rétinopathie diabétique, où les deux yeux devraient présenter des déficits similaires, utilisez le score combiné (moyenne des yeux droit et gauche) pour l’analyse. Pour les modèles qui causent des dommages différentiels aux yeux (c.-à-d. une blessure par explosion ou un glaucome), conservez les données de l’œil gauche et de l’œil droit séparées.
    2. Pour la fréquence spatiale, utilisez les scores bruts (les données de l’onglet Résultats ) pour l’analyse et faites la moyenne de ces scores ensemble par groupe (c.-à-d. diabétique, témoin, etc.).
    3. Pour Sensibilité au contraste, utilisez la valeur brute pour calculer la sensibilité au contraste rapportée par le contraste de Michelson à partir d’une mesure précédente de la luminance de l’écran.

2. Le labyrinthe en Y

  1. Préparer les rongeurs pour les tests
    1. Adaptez les rongeurs à la pièce pendant 30 minutes avant le test.
      REMARQUE: Le chercheur peut rester dans la pièce avec les lumières allumées, mais doit rester silencieux pendant ce temps.
    2. Nettoyez le labyrinthe en Y avec une solution désinfectante sans danger pour les animaux et essuyez toute solution désinfectante avec des serviettes en papier. Assurez-vous que le labyrinthe est sec.
  2. Conduisez le labyrinthe en Y
    1. Étiquetez le bras initial du labyrinthe en Y comme B et les 2 autres bras comme A et C (Figure 2A). Placez un rongeur dans le bras le plus proche du chercheur (bras B) près du centre du labyrinthe en Y. Une fois le rongeur placé, démarrez la minuterie (détails sur le labyrinthe et la minuterie dans la table des matériaux).
      1. Laissez chaque rongeur explorer le labyrinthe en Y pendant 8 min. Prenez des enregistrements pendant cette période et notez toutes les observations. Asseyez-vous à plusieurs mètres du labyrinthe tout en le gardant en vue et évitez de faire du bruit.
      2. Enregistrez l’emplacement de départ comme A, et chaque fois que le rongeur fait une entrée dans un nouveau bras, enregistrez le nouvel emplacement du rongeur (Figure 2B). Définissez une entrée comme les quatre membres du rongeur se trouvant dans l’un des bras.
      3. Surveillez les rongeurs pour qu’ils se cachent et restent immobiles dans un bras du labyrinthe. Si le rongeur reste au même endroit pendant plus de 60 s et ne semble pas montrer de comportement exploratoire, déplacez le rongeur vers le centre du labyrinthe Y et continuez l’essai.
    2. Après chaque rongeur, enlevez les excréments et nettoyez le labyrinthe avec une solution désinfectante.
      1. Assurez-vous que toute la solution désinfectante est essuyée avec des serviettes en papier et que le labyrinthe est complètement sec avant de placer le prochain rongeur dans le labyrinthe.
  3. Calculer l’alternance spontanée et le comportement exploratoire
    1. Calculez le comportement exploratoire comme le nombre total d’entrées effectuées pendant 8 min.
    2. Calculer la cognition spatiale mesurée par l’alternance spontanée :
      le nombre d’alternances réussies/(le nombre total d’entrées - 2)
      1. Définissez une alternance réussie lorsque le rongeur se déplace séquentiellement dans trois endroits différents (exemple: ABC, CAB, BCA, etc.). Notez chaque alternance réussie (Figure 2B).
      2. Si les mouvements ont été enregistrés comme ACABCABABCABC, ne tenez pas compte des deux emplacements de départ initiaux lors du calcul de l’alternance spontanée (de sorte qu’il y ait 11 mouvements dans le dénominateur). Comptez le nombre de mouvements précis (mouvements précis = 8). Calculez le pourcentage de précision comme suit : 8/(13 - 2) = 72,7 %.

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Representative Results

L’OMR est considéré comme réussi si des seuils de sensibilité à la fréquence spatiale et au contraste peuvent être obtenus à partir d’un rongeur. Ici, l’utilisation de l’OMR pour évaluer la fréquence spatiale est illustrée chez des rats témoins naïfs Brown-Norway et Long-Evans, tous deux jeunes (3-6 mois) et âgés (9-12 mois). Les rats bruns-norvégiens montrent généralement une fréquence spatiale de base plus élevée que les rats Long-Evans. De plus, un effet du vieillissement sur la fréquence spatiale a été observé chez les rats Long-Evans (Figure 3A). Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie de comparaisons post-hoc Holms-Sidak, car les résultats pour les jeunes et les personnes âgées provenaient de différentes cohortes.

L’utilisation de l’OMR pour évaluer la sensibilité au contraste est illustrée dans le modèle STZ du diabète de type I qui a reçu un traitement d’intervention par l’exercice. Les rats Long-Evans ont été assignés à l’un des quatre groupes: témoin, contrôle + actif, diabétique et diabétique + actif. Des rats diabétiques ont reçu des injections intraveineuses de la toxine STZ pour endommager les cellules bêta pancréatiques et induire une hyperglycémie. Les rats actifs ont reçu 30 minutes d’exercice sur tapis roulant, 5 jours par semaine. Les rats inactifs avaient un tapis roulant verrouillé. Des déficits significatifs de sensibilité au contraste (figure 3B) ont été observés chez les rats diabétiques. Le traitement par l’exercice a réduit ces déficits (figure 3B). Ces résultats démontrent que l’OMR est utile à la fois pour détecter et suivre les déficits rétiniens au fil du temps et pour évaluer les effets des traitements et des interventions sur la maladie rétinienne22. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles suivie de comparaisons post-hoc Holms-Sidak. Notez que les résultats peuvent être présentés sous forme de données normalisées pour contrôler (Figure 3B) ou sous forme de valeurs brutes (Figure 3A; pour la fréquence spatiale: en cycles/degré ou c/d; pour la sensibilité au contraste: unités arbitraires ou a.u.). En règle générale, 6 à 10 animaux, selon la gravité de la blessure, sont nécessaires pour trouver une différence significative avec l’OMR.

Le labyrinthe en Y est considéré comme réussi si le rongeur entre dans au moins 5 bras du labyrinthe dans les 8 minutes. Ici, la capacité du labyrinthe Y à évaluer la fonction cognitive et le comportement exploratoire est illustrée dans le rat Goto-Kakizaki, un modèle polygénique et non obèse du diabète de type II qui développe une hyperglycémie modérée à partir de l’âge de 2 à 3 semaines et ne nécessite pas de supplémentation en insuline. Des déficits significatifs de la cognition spatiale, mesurés par l’alternance spontanée (Figure 4A), et le comportement exploratoire, mesuré par le nombre d’entrées (Figure 4B), ont été observés chez les rats Goto-Kakizaki par rapport aux témoins Wistar à partir de l’âge de 7 semaines. Les rats témoins semblent montrer une diminution du comportement exploratoire de 4 à 8 semaines. Cette tendance est également observée dans les études à long terme (8 mois et plus). La diminution du mouvement pourrait être due à un manque de nouveauté avec une exposition répétée au labyrinthe ou à une diminution générale des mouvements avec l’âge. Les rats témoins semblent montrer une augmentation de la cognition spatiale de 4 à 8 semaines. Cette tendance n’est pas observée dans les études à long terme dans lesquelles les animaux sont exécutés mensuellement plutôt qu’hebdomadairement (en fait, un déclin avec le vieillissement est souvent observé), et donc, cette augmentation de la cognition spatiale peut être due à un effet d’apprentissage de la course du labyrinthe une fois par semaine. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles suivie de comparaisons post-hoc Holms-Sidak. Un minimum de 10 animaux, selon la gravité de la blessure, sont généralement nécessaires pour trouver une différence significative avec le labyrinthe en Y.

Ce protocole a généré des données sur la fonction visuelle et la fonction cognitive dans des modèles de diabète de type I et de type II. Les scores pour les animaux individuels ont été moyennés ensemble et utilisés pour détecter des différences significatives entre les groupes de traitement au début de la progression du diabète. La réalisation d’évaluations rétiniennes et cognitives au fil du temps dans des modèles de maladies systémiques telles que le diabète permet de surveiller l’apparence temporelle des déficits au fil du temps. Par exemple, dans le modèle de Goto-Kakizaki, il a été démontré que les déficits de la fonction rétinienne précédaient les déficits comportementaux cognitifs et exploratoires23 (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Configuration de l’équipement OMR. (A) Image de souris, de rats et de plates-formes de rats de grande taille ou altérées. (B) Image de l’écran de l’ordinateur pendant le test. (C) Panneau de boutons pendant le test. (D) Schéma du rat sur la plate-forme dans la chambre. (E) Exemples de gradients montrant une augmentation de la fréquence spatiale et de la sensibilité au contraste. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Configuration de l’équipement Y-maze. (A) Image du labyrinthe en Y avec les bras étiquetés. (B) Image d’un cahier de laboratoire avec exemple de l’enregistrement du labyrinthe en Y. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Utilisation de l’OMR pour suivre la fonction visuelle. (A) Seuils de fréquence spatiale pour les rats jeunes (n = 11) et âgés (n = 15), bruns de Norvège (BN) et jeunes (n = 20) et âgés (n = 13) longs-Evans (LE). Cette figure présente les données Brown-Norway de Feola et al., 201921. (B) Utilisation de l’OMR pour suivre la fonction rétinienne réduite au fil du temps et les effets protecteurs de l’exercice dans un modèle de diabète de type I chez un rat STZ. Seuils de sensibilité au contraste pour les rats diabétiques inactifs par rapport aux rats diabétiques actifs et aux rats témoins. Les astérisques gris foncé représentent des différences entre les deux groupes témoins et les deux groupes diabétiques. Les astérisques orange représentent des différences entre les rats diabétiques inactifs et les rats diabétiques actifs. Cette figure présente les données d’un sous-ensemble de rats d’Allen et al., 201822. Moyenne ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Utilisation du labyrinthe Y pour suivre la fonction cognitive et le comportement exploratoire au fil du temps dans le modèle Goto-Kakizaki du diabète de type II par rapport aux témoins Wistar. (A) Fonction cognitive (alternance spontanée) chez les rats Goto-Kakizaki (diabétiques) et Wistar (témoins) âgés de 4 à 8 semaines. (B) Comportement exploratoire (nombre d’entrées) de 4 à 8 semaines. Moyenne ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Les astérisques représentent les différences entre les rats Goto-Kakizaki et Wistar à chaque point temporel. Une seule cohorte de rats a été exécutée de 4 semaines à 8 semaines (GK: n = 7; Wistar : n = 10). Toutes les autres cohortes ont été exécutées de 5 semaines à 8 semaines (GK: n = 22; Wistar : n = 23) pour un total de n de 29 (GK) et 33 (Wistar) aux semaines 5 à 8. Cette figure a été modifiée par rapport à Allen et al., 201923. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Chronologie des changements fonctionnels dans le modèle Goto-Kakizaki du diabète de type II. Après l’apparition de l’hyperglycémie, les premiers changements observés chez le rat Goto-Kakizaki étaient dans la fonction rétinienne, mesurée par électrorétinogramme (ERG), apparaissant à l’âge de 4 semaines. Des changements de comportement cognitifs et exploratoires sont apparus après l’âge de 6 semaines. Cette figure a été modifiée par rapport à Allen et al., 201923. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’OMR et le labyrinthe en Y permettent l’évaluation non invasive des déficits de la fonction visuelle et de la fonction cognitive chez les rongeurs au fil du temps. Dans ce protocole, il a été démontré que l’OMR et le labyrinthe en Y suivent les déficits visuels et cognitifs dans les modèles de diabète chez les rongeurs.

Étapes critiques du protocole

L’OMR

Certains points importants à considérer lors de l’exécution de l’OMR pour évaluer la fonction visuelle sont les paramètres de test utilisés, la conception expérimentale et le moment des tests, et l’expérience du chercheur effectuant les mesures. L’une des étapes les plus critiques du protocole consiste à s’assurer que les paramètres sont correctement définis. De plus, dans le cadre de l’installation, la chambre OMR doit être nettoyée avec une solution désinfectante ou un autre désinfectant approuvé avant et après chaque rongeur. Il est également important que le chercheur qui effectue les mesures ait été formé et qu’il ait de l’expérience dans l’exécution des mesures. Les meilleurs résultats sont observés lorsque les rongeurs sont calmes et acclimatés à la pièce en les laissant dans leurs cages pendant 30 minutes avant de commencer l’expérience. Il est également important de déterminer la fréquence spatiale de base et la sensibilité au contraste chaque fois que vous commencez à travailler avec une nouvelle souche et de noter que toutes les souches ne présenteront pas les mêmes niveaux de base. Les rats bruns de Norvège ont une fréquence spatiale de base plus élevée que les rats longs-Evans. Pendant ce temps, certaines souches de rats albinos semblent avoir compromis la fréquence spatiale24, tandis que d’autres souches de rats albinos ne présentent aucun comportement de suivi. De nombreux facteurs peuvent contribuer à la réponse limitée des animaux albinos sur l’OMR: binocularité perturbée due à la décussation différentielle des fibres du nerf optique, manque de mélanine à l’arrière de l’œil et grande proportion de cônes d’opsine doubles. Quoi qu’il en soit, les rats albinos peuvent ne pas être des sujets appropriés pour le test OMR car leur performance pourrait être trop proche de la limite de détection.

Le labyrinthe en Y

Un élément essentiel de l’exécution du labyrinthe en Y consiste à minimiser les perturbations pendant la période d’enregistrement. Le placement initial du rongeur dans le labyrinthe ne doit être effectué qu’après avoir permis au rongeur de s’acclimater à la pièce pendant 30 minutes. Cela permet au rongeur de s’adapter au nouvel environnement et empêche tout facteur de confusion d’avoir un impact sur le comportement normal du rongeur. Il est très important de minimiser les perturbations au cours de chaque essai. Cela inclut d’éviter les bruits forts et de s’assurer que le chercheur est hors de vue du rongeur. Ces distractions peuvent causer du stress au rongeur. Il est également important de noter que les murs de la pièce doivent rester aussi nus que possible avec une couleur neutre. Toutes les couleurs vives sur les murs ou les affiches peuvent distraire le rongeur et peuvent avoir un impact sur leur modèle de comportement exploratoire.

Limitations de la méthode et modifications et dépannage de la méthode

L’OMR

Une limitation potentielle de l’OMR est qu’il peut être affecté par le biais de l’expérimentateur, et différents expérimentateurs peuvent avoir des résultats légèrement différents puisque la notation OMR est subjective. Il peut être facile de manquer un mouvement de la tête trop subtil ou de classer le comportement exploratoire comme un mouvement de la tête. Étant donné que le biais peut affecter les résultats de l’OMR, il est préférable que l’expérimentateur soit masqué au groupe de traitement et à la conception de l’étude lorsque cela est possible. Le développement d’un OMR automatique ou la comparaison des résultats de deux testeurs pourrait également aider à réduire le biais de l’expérimentateur.

Un problème courant qui peut se produire pendant les tests OMR est lorsque le rongeur saute à plusieurs reprises de la plate-forme, ce qui rend difficile l’obtention d’un seuil visuel. Si cela se produit, prenez-en note et replacez doucement le rat sur la plate-forme; il peut également être nécessaire de mesurer à nouveau le rat le lendemain. De plus, les rats qui n’ont jamais été mesurés auparavant peuvent adopter des comportements exploratoires lorsqu’ils sont placés dans l’OMR. S’il s’agit d’un problème, le fait d’avoir une mesure de base supplémentaire environ une semaine après la première mesure peut aider à améliorer la précision. Les tests avec des quantités excessives de ces comportements doivent être ignorés.

D’autres facteurs tels que l’âge ou les indices olfactifs pourraient également contribuer à une activité indésirable. Par conséquent, il est important de concevoir des expériences conformément à la chronologie du développement du système visuel chez le rat et de nettoyer en profondeur la plate-forme et la chambre avant et après avoir testé chaque rongeur. L’heure à laquelle les mesures OMR sont effectuées doit également être prise en compte, car des études antérieures ont montré qu’il existe des rythmes circadiens dans la fréquence spatiale25. Courir les rats avant midi semble être le meilleur pour leur concentration (laboratoire de Rachael Allen - observations personnelles). Si les rats deviennent trop distraits, il peut être utile de taper doucement sur l’extérieur de l’OMR.

La rapidité avec laquelle les tests sont effectués peut également affecter les résultats. Les mesures peuvent devenir moins précises après environ 30 minutes si les rongeurs perdent tout intérêt pour le stimulus. Par conséquent, des résultats plus précis peuvent être obtenus lorsque les mesures sont prises en environ ≤20 minutes. La durée d’un seul essai (pour SF ou CS) est de 5 à 10 minutes pour un expert et de 30 minutes pour un débutant. Si un rongeur montre peu de mouvement, passe la plupart de son temps à se toiletter ou ne regarde pas dans la direction des barres, il peut être fatigué. Le rongeur peut être couru à nouveau un autre jour. De plus, les tests SF et CS peuvent être effectués à des jours différents, en particulier pour les nouveaux testeurs qui peuvent être plus lents. La fréquence à laquelle le test est effectué peut également affecter les résultats – le faire chaque semaine ou toutes les deux semaines aide les animaux à rester acclimatés au test, mais le faire tous les jours ou tous les deux jours peut provoquer une hyperacuité26. Nous n’organisons pas plus d’un essai par jour, bien que nous exécutions souvent à la fois SF et CS le même jour ou même dans la même séance. Le temps quotidien cumulé pour exécuter une cohorte de rats (n = 10) est de 2 h pour un expert.

L’OMR mesure chaque œil indépendamment, ce qui donne des scores visuels distincts pour chaque œil. Dans les modèles morrison et microbilles du glaucome et dans un modèle d’écrasement du nerf optique, notre laboratoire n’a observé aucun impact de l’œil endommagé sur l’œil non endommagé27. Dans un modèle de souffle, avec l’explosion dirigée vers un œil, l’œil controlatéral a montré des dommages, mais cela pourrait également être dû à un effet de souffle partiel28. Chez les rats témoins, il ne devrait pas y avoir de différence de résultats entre les directions dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, mais certains rongeurs pourraient avoir un biais; il serait donc préférable d’alterner les directions29, si le système OMR n’alterne pas automatiquement.

Selon le modèle de la maladie, les différences de fonction visuelle des groupes de traitement peuvent varier en fonction des paramètres utilisés. Par exemple, lors du test de la sensibilité au contraste, si la fréquence spatiale est réglée à un niveau supérieur au seuil de fréquence spatiale normal et difficile à résoudre, les différences de sensibilité au contraste entre les groupes seront faibles. Cependant, si la fréquence spatiale est réglée à un niveau normalement facile à voir pour les rats, les différences de sensibilité au contraste entre les groupes seront plus grandes30. Par conséquent, il est important de tenir compte de la conception de l’étude et des seuils de fréquence spatiale normaux des rongeurs lors de la définition des paramètres d’exécution de l’OMR.

Le labyrinthe en Y

Si un animal a peur, il peut geler dans un coin du labyrinthe. De plus, si un bruit fort se produit à l’extérieur de la pièce, un animal peut avoir peur et ne pas bouger dans le labyrinthe. Pour tenir compte de ces problèmes, les chercheurs peuvent d’abord acclimater les rats à la pièce, déplacer un animal congelé à un point de choix, faire courir un animal à nouveau un jour différent ou faire courir les animaux à la lumière rouge, ce qui les rendrait moins nerveux car ils sont normalement actifs dans l’obscurité (Rachael Allen’s Lab - communication personnelle). Il est également recommandé de courir le labyrinthe Y à la même heure chaque jour pour tenir compte des changements dans les niveaux d’activité tout au long de la journée en raison des rythmes circadiens. Nous faisons généralement courir les rats avant midi (Rachael Allen’s Lab – observations personnelles). La durée d’un seul essai est de 8 min (10 min, avec nettoyage). Nous n’effectuons jamais plus d’un essai par jour. Si un essai supplémentaire est nécessaire, l’essai est effectué un autre jour. Le temps quotidien cumulé pour l’exécution d’une cohorte de rats (n = 10) est de 2 à 3 h. Des diminutions liées à l’âge de l’alternance spatiale ont été observées chez les rats âgés de 9 à 12 mois et dans le comportement exploratoire à l’âge de 12 mois28.

Bien que le comportement exploratoire et la cognition spatiale diminuent chez les rongeurs diabétiques, les deux ne semblent pas être étroitement corrélés, et par conséquent, nous n’évaluons pas indépendamment l’activité locomotrice avant le test du labyrinthe en Y.

L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives

L’OMR

D’autres méthodes de test de la fonction visuelle, telles que le suivi optocinétique, reposent sur la fixation de la tête de l’animal en place et le suivi des mouvements oculaires. Les tests de réponse optomotrice non maîtrisée (OMR) permettent une mesure longitudinale, non invasive et fiable de la fonction visuelle chez les rongeurs. Dans ce protocole, il a été décrit comment l’OMR peut être utilisé pour quantifier à la fois la fréquence spatiale et les seuils de sensibilité au contraste pour chaque œil. Cette méthode peut être très utile pour détecter le dysfonctionnement neuronal à un stade précoce dans des maladies telles que le diabète. D’autres tests tels que la tâche visuelle de l’eau peuvent également être utilisés pour mesurer la fréquence spatiale31, mais comme il s’agit d’entraîner des rongeurs à nager vers un gradient dans un labyrinthe en Y modifié, la tâche prend beaucoup de temps et implique beaucoup d’entraînement. De plus, l’OMR mesure les valeurs pour chaque œil indépendamment, ce qui est utile dans les modèles où la blessure est dirigée vers un œil et l’autre œil sert de contrôle controlatéral (par exemple, de nombreux modèles de glaucome). De plus, OMR est une évaluation sensible, capable de détecter les changements dès 3 à 4 semaines après le diabète, ce qui est plus tôt que les autres évaluations visuelles. Les tests électrophysiologiques sont une alternative aux tests visuels comportementaux. L’électrorétinographie (ERG) est plus disponible que l’OMR et peut déterminer des déficits dans des types de cellules précis en utilisant différents composants de l’onde ERG32 (les ondes a- représentent la fonction des cellules photoréceptrices, les ondes b- représentent la fonction cellulaire bipolaire). Pendant ce temps, l’OMR peut être utilisé pour déterminer un déficit de la fonction visuelle, sans révéler le point précis de rupture le long de la voie. Cependant, l’OMR est une mesure plus sensible de la RD que l’ERG, les déficits OMR étant généralement observés entre 2 et 4 semaines après l’hyperglycémie et les déficits ERG généralement observés 4 à 8 semaines après l’hyperglycémie chez les rongeurs. Les cataractes diabétiques sévères peuvent affecter l’OMR. Cependant, les cataractes diabétiques chez les rongeurs apparaissent et / ou s’aggravent sous anesthésie, et donc, les tests tels que l’ERG et la tomographie par cohérence optique qui nécessitent une anesthésie sont affectés beaucoup plus souvent que l’OMR, qui est effectué chez les animaux éveillés.

Le labyrinthe en Y

Le labyrinthe en Y repose sur la cognition spatiale comme le labyrinthe d’eau de Morris, mais n’utilise pas de fort stimulus négatif (c’est-à-dire l’eau) pour motiver l’animal à effectuer la tâche. Ainsi, le labyrinthe en Y est moins stressant pour les animaux et est également plus facile à réaliser. Cependant, il est possible que le labyrinthe en Y ne soit pas aussi sensible que le labyrinthe d’eau de Morris ou le labyrinthe de Barnes. Contrairement au labyrinthe d’eau de Morris, le labyrinthe en Y est un comportement automatique et ne nécessite pas de formation. Ainsi, la charge de temps impliquée dans l’exécution du labyrinthe en Y est beaucoup plus faible.

Conclusions et applications ou orientations futures de la méthode

L’OMR

L’OMR est utile pour prendre des mesures de la fonction visuelle chez les rongeurs en suivant les mouvements de la tête. C’est une méthode efficace, mais il y a des mises à jour et des ajouts qui sont continuellement faits pour améliorer le protocole. Certaines nouvelles méthodes utilisent le rongeur mettant sa tête en pause comme indicateur OMR négatif combiné avec le suivi de la tête comme indicateur positif33. Cela permet des mesures plus rapides et plus précises de la fonction visuelle34. Une autre façon dont ce processus a été modifié est de développer un système qui suivra automatiquement la tête sans marqueurs artificiels pour réduire les incohérences qui pourraient résulter de testeurs humains35. Depuis 2016, un système OMR automatisé ou quantitatif appelé qOMR a été bien développé et est disponible dans le commerce. Dans le protocole ci-dessus, l’OMR a pu détecter des déficits de fréquence spatiale et de sensibilité au contraste chez les rats diabétiques, ainsi qu’une protection contre les déficits avec un traitement (exercice).

Le labyrinthe en Y

Le labyrinthe en Y révèle des informations sur le comportement exploratoire et la cognition spatiale et a été utilisé ici pour détecter les déficits comportementaux chez les rongeurs diabétiques à 7 semaines. D’autres tests pour observer la fonction cognitive existent (c.-à-d. labyrinthe d’eau de Morris, labyrinthe de Barnes, reconnaissance de nouveaux objets), et il est possible que ces tests puissent être en mesure de révéler le déclin cognitif plus tôt ou de fournir des informations sur différents aspects de la cognition. Les orientations futures du labyrinthe en Y comprennent le placement d’un nouvel objet ou d’un stimulus alimentaire dans l’un des bras et l’observation du modèle exploratoire du rongeur36. Une variante de ceci consiste à bloquer l’un des bras du labyrinthe en Y, permettant au rongeur d’explorer les deux bras restants, puis à rouvrir l’accès au troisième bras et à évaluer combien de temps le rongeur passe dans le troisième bras roman. Une autre amélioration précieuse qui pourrait être apportée concernant le labyrinthe en Y est le développement du suivi automatique des rongeurs afin d’enregistrer leurs mouvements. Cela éliminerait le besoin d’enregistrement manuel des mouvements des rongeurs et rendrait les calculs des alternances spontanées plus précis et plus efficaces.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par les Prix de développement de carrière du service de réadaptation et de réadaptation du ministère des Anciens Combattants (ADC-1, RX002111; CDA-2; RX002928) à RSA et (CDA-2, RX002342) à AJF et aux National Institutes of Health (NIH-NICHD F31 HD097918 à DACT et NIH-NIEHS T32 ES012870 à DACT) et NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

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Comportement Numéro 164 rétinopathie diabétique rétine labyrinthe Y réponse optomotrice comportement exploratoire fréquence spatiale sensibilité au contraste mémoire spatiale alternance spontanée

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Évaluation comportementale de la fonction visuelle via la réponse optomotrice et de la fonction cognitive via Y-Maze chez les rats diabétiques
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Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

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