Summary
हम माउस मस्तिष्क हटाने और ताजा मस्तिष्क के ऊतकों से असतत क्षेत्रों के विच्छेदन के लिए एक हाथ पर, चरण-दर-चरण, तेजी से प्रोटोकॉल पेश करते हैं। आणविक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों को प्राप्त करना कई तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में नियमित हो गया है। सिस्टम स्तर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा प्राप्त करने के लिए इन मस्तिष्क क्षेत्रों को तुरंत जमे हुए हैं।
Abstract
मस्तिष्क स्तनधारी तंत्रिका तंत्र के लिए कमांड सेंटर और भारी संरचनात्मक जटिलता वाला एक अंग है। खोपड़ी के भीतर संरक्षित, मस्तिष्क में गोलार्धों पर ग्रे पदार्थ का एक बाहरी आवरण होता है जिसे सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में जाना जाता है। इस परत के नीचे कई अन्य विशेष संरचनाएं रहती हैं जो अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण कई घटनाओं के लिए आवश्यक हैं। विशिष्ट सकल मस्तिष्क क्षेत्रों के नमूने प्राप्त करने के लिए त्वरित और सटीक विच्छेदन चरणों की आवश्यकता होती है। यह समझा जाता है कि सूक्ष्म स्तर पर, कई उप-क्षेत्र मौजूद हैं और संभवतः मनमानी क्षेत्रीय सीमाओं को पार करते हैं जो हम इस विच्छेदन के उद्देश्य से लगाते हैं।
माउस मॉडल का उपयोग नियमित रूप से मानव मस्तिष्क कार्यों और बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन रोगग्रस्त अवस्था के आधार पर एक विशेष फेनोटाइप को लक्षित करने वाले विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित हो सकता है। इस प्रकार, इसके अच्छी तरह से परिभाषित संरचनात्मक संगठन के संबंध में प्रतिलेखन के विनियमन का अध्ययन करना बहुत महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क की पूरी समझ के लिए अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने, कनेक्शन को परिभाषित करने और इन मस्तिष्क क्षेत्रों में से प्रत्येक की गतिविधियों में महत्वपूर्ण अंतर की पहचान करने की आवश्यकता होती है। इन अलग-अलग क्षेत्रों में से प्रत्येक की अधिक व्यापक समझ तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में नए और बेहतर उपचार का मार्ग प्रशस्त कर सकती है। यहां, हम सोलह अलग-अलग क्षेत्रों में माउस मस्तिष्क को विच्छेदन के लिए एक चरण-दर-चरण पद्धति पर चर्चा करते हैं। इस प्रक्रिया में, हमने पुरुष माउस सी 57 बीएल / 6 जे (6-8 सप्ताह पुराना) मस्तिष्क हटाने और न्यूरोएनाटोमिकल स्थलों का उपयोग करके कई क्षेत्रों में विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि असतत कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक और व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान और नमूना लिया जा सके। यह काम तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में एक मजबूत नींव रखने में मदद करेगा, जिससे मस्तिष्क समारोह की गहरी समझ में अधिक केंद्रित दृष्टिकोण होंगे।
Introduction
रीढ़ की हड्डी और रेटिना के साथ मस्तिष्क में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र शामिल होता है जो जटिल व्यवहार को निष्पादित करता है, पूरे शरीर में विशेष, सटीक रूप से तैनात और बातचीत करने वाले सेलप्रकारों द्वारा नियंत्रित होता है 1. मस्तिष्क एक जटिल अंग है जिसमें अरबों परस्पर जुड़े न्यूरॉन्स और ग्लिया होते हैं, जिसमें सटीक सर्किटरी कई कार्य करती है। यह दो अलग-अलग लोब और विविध सेलुलर घटकों के साथ एक द्विपक्षीय संरचनाहै 2. रीढ़ की हड्डी मस्तिष्क को बाहरी दुनिया से जोड़ती है और हड्डी, मेनिन्जेस और मस्तिष्कमेरु द्रव द्वारा संरक्षित होती है और मस्तिष्क 2,3,4 से संदेश भेजती है। मस्तिष्क की सतह, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, असमान है और इसमें अलग-अलग सिलवटें होती हैं, जिन्हें गायरी कहा जाता है, और खांचे, जिन्हें सल्सी कहा जाता है, जो मस्तिष्क को कार्यात्मक केंद्रों में अलग करते हैं5. कॉर्टेक्स स्तनधारियों में एक छोटे से मस्तिष्क 6,7 के साथ चिकनी है। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से संबंधित विकारों के साथ-साथ इसके कार्यात्मक सर्किट को समझने के लिए मानव मस्तिष्क की वास्तुकला को चिह्नित करना और अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान का विस्तार हुआ है और मस्तिष्क की संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक तरीकों का उपयोग किया जा रहा है। आणविक और सिस्टम-स्तरीय जीव विज्ञान के क्षेत्र में विकास ने मस्तिष्क संरचनाओं और अणुओं के कामकाज के बीच जटिल संबंधों की खोज के एक नए युग की शुरुआत की है। इसके अतिरिक्त, आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी और एपिजेनेटिक्स तेजी से विस्तार कर रहे हैं, जिससे हमें सिस्टम कैसे कार्य करने में शामिल अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने में सक्षम बनाता है। इन विश्लेषणों को अधिक प्रभावी उपचारों की जांच और विकास को लक्षित करने में मदद करने के लिए बहुत अधिक स्थानीयकृत आधार पर किया जा सकता है।
स्तनधारी मस्तिष्क को संरचनात्मक रूप से स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य असतत क्षेत्रों में परिभाषित किया गया है; हालाँकि, इन असतत संरचनाओं की कार्यात्मक और आणविक जटिलताओं को अभी तक स्पष्ट रूप से समझा नहीं गया है। मस्तिष्क के ऊतकों की बहु-आयामी और बहु-स्तरीय प्रकृति इस परिदृश्य को कार्यात्मक स्तर पर अध्ययन करना मुश्किल बनाती है। इसके अलावा, तथ्य यह है कि एक ही संरचना द्वारा कई कार्य किए जाते हैं और इसके विपरीत मस्तिष्क8 की समझ को और जटिल बनाता है। यह महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क क्षेत्रों के संरचनात्मक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए निष्पादित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण फ़ंक्शन के साथ न्यूरोएनाटोमिकल आर्किटेक्चर को सहसंबंधित करने के लिए नमूने में स्थिरता प्राप्त करने के लिए सटीक अनुसंधान पद्धतियों का उपयोग करता है। मस्तिष्क की जटिलता को हाल ही में एकल कोशिका अनुक्रमण 9,10 का उपयोग करके समझाया गया है जैसे कि मानव मस्तिष्क का लौकिक गाइरस जो 75 अलग-अलग सेल प्रकार11 से बना है। माउस मस्तिष्क के अनुरूप क्षेत्र से उन लोगों के लिए इस डेटा की तुलना करके, अध्ययन न केवल उनके वास्तुकला और सेल प्रकारों में समानता का पता चलता है, बल्कि मतभेदों को भी प्रस्तुत करता है। जटिल तंत्र को उजागर करने के लिए, इसलिए पूरी सटीकता के साथ मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। मानव और माउस मस्तिष्क के बीच संरक्षित संरचनाएं और कार्य मानव मस्तिष्क समारोह और व्यवहार परिणामों को स्पष्ट करने के लिए प्रारंभिक सरोगेट के रूप में माउस के उपयोग को सक्षम करते हैं।
सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण की उन्नति के साथ, कृन्तकों में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों से जानकारी प्राप्त करना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया बन गई है। जबकि लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन12 जैसे कुछ प्रोटोकॉल महंगे हो सकते हैं, यांत्रिक प्रोटोकॉल सस्ते हैं और आमतौर पर उपलब्ध टूल13,14 का उपयोग करके किए जाते हैं। हमने ट्रांसक्रिप्टोमिक परख15 के लिए कई मस्तिष्क क्षेत्रों का उपयोग किया है और थोड़े समय में चरण-दर-चरण तरीके से रुचि के माउस मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदन करने के लिए एक हाथ से और तेजी से प्रक्रिया विकसित की है। एक बार विच्छेदित होने के बाद, इन नमूनों को इन ऊतकों के न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को संरक्षित करने के लिए ठंड की स्थिति में तुरंत संग्रहीत किया जा सकता है। हमारे दृष्टिकोण को तेजी से उच्च दक्षता के लिए अग्रणी किया जा सकता है और ऊतक गिरावट के लिए कम संभावना की अनुमति देता है। यह अंततः, मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों को उत्पन्न करने की संभावना को बढ़ाता है।
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Protocol
पशु देखभाल के लिए यूरोपीय, राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार पशु हैंडलिंग और प्रायोगिक प्रक्रियाएं आयोजित की गईं। सभी पशु प्रयोगों को यूएस आर्मी सेंटर फॉर एनवायरनमेंटल हेल्थ रिसर्च में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था अब वाल्टर रीड आर्मी इंस्टीट्यूट ऑफ रिसर्च (डब्ल्यूआरएआईआर) और एसोसिएशन फॉर द असेसमेंट एंड एक्रिडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल (एएएएलएसी) द्वारा मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया गया था।
नोट: प्रक्रिया गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था16 द्वारा इच्छामृत्यु सी 57 बीएल / 6 जे तनाव के छह से आठ सप्ताह के पुरुष चूहों पर की जाएगी। हमारी प्रयोगशाला में कोई छिड़काव नहीं किया जाता है लेकिन इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है जिससे वास्कुलचर से रक्त को साफ करने के लिए छिड़काव किया जा सकता है। विच्छेदन के लिए आवश्यक सभी आपूर्ति सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। विच्छेदन को तीन घटकों में विभाजित किया गया है, जिसमें मस्तिष्क को हटाना, पिट्यूटरी ग्रंथि को हटाना और मस्तिष्क विच्छेदन शामिल हैं। मस्तिष्क ऊतक संग्रह का इरादा उन्हें आरएनए निष्कर्षण के बाद ट्रांसक्रिप्टोमिक परख के लिए संसाधित करना है। जैसे ही मस्तिष्क क्षेत्र विच्छेदित होता है, हम तुरंत प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र को पहले से लेबल किए गए फ्रीजर शीशी में स्थानांतरित करते हैं और फिर शीशी को तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत करते हैं।
नोट: इस प्रक्रिया को करने के लिए न्यूरोएनाटॉमी का गहन ज्ञान आवश्यक है। क्षैतिज और अनुदैर्ध्य वर्गों, साथ ही सामान्य अनुप्रस्थ वर्गों का अध्ययन और सीखा जाना चाहिए। चूंकि मस्तिष्क के ऊतक बहुत जल्दी खराब हो जाते हैं, इसलिए इस प्रक्रिया को करते समय एटलस से परामर्श करने का कोई समय नहीं होता है।
1. माउस मस्तिष्क हटाने
- एक हेमोस्टैट (चित्रा 2i) के साथ विघटित सिर के मैक्सिला को क्लैंप करें और खोपड़ी को प्रतिबिंबित करने के लिए एक धुंध पैड का उपयोग करें और खोपड़ी के डोरसम (चित्रा 2ii) पर एक शुष्क क्षेत्र बनाने के लिए।
- पालन करने वाले मेनिन्जेस को अलग करने के लिए रंध्र मैग्नम में ठीक घुमावदार कैंची डालें। यहां, खोपड़ी के आधार पर उद्घाटन पर कैंची डालें रंध्र मैग्नम है, जहां रीढ़ की हड्डी लंबवत (12 बजे की स्थिति) की ओर इशारा करते हुए ब्लेड के साथ गुजरती है, लेकिन बेसल प्लेट हड्डी (यानी, ओसीसीपटल स्क्वैमा) की आंतरिक सतह के समानांतर और दबाने और ब्लेड पैंतालीस ° को बाईं ओर और फिर दाईं ओर घुमाते हुए।
- बेसल प्लेट की हड्डी को बंद करने के लिए कलाई को घुमाना जारी रखें जो शेष हड्डी के बीच को पश्चकपाल हड्डी में जारी रखेगा और इंट्रापेरिएटल हड्डियों को हड्डियों को बाएं और दाएं घुमाते हुए जब तक कि उन्हें हटा नहीं दिया जाता। इसी तरह, सेरिबैलम को उजागर करने के लिए पश्चकपाल हड्डी और इंट्रापेरिएटल हड्डी को हटा दें।
नोट: इस बिंदु पर, खोखले बोनी संरचना जिसे टिम्पैनिक बुले कहा जाता है, खोपड़ी के उदर पीछे के हिस्से पर जो मध्य और आंतरिक कान के कुछ हिस्सों को घेरता है, को तब तक हटाया जा सकता है जब तक कि कोई पिट्यूटरी के पीछे और पूर्वकाल लोब को विच्छेदित नहीं कर रहा हो (चित्रा 23)। - एक घुमावदार तेज कैंची ब्लेड का उपयोग कर अस्थायी रिज के लिए मांसपेशियों के संलग्नक निकालें। अनुप्रस्थ और धनु साइनस (चित्रा 2iv) के जंक्शन में प्रवेश लैम्ब्डॉइड सिवनी के तहत घुमावदार तेज कैंची के एक अंग रखें।
- ब्रेग्मा तक मिडसैजिटल सिवनी के साथ कैंची को आगे बढ़ाएं और सेरेब्रल कॉर्टिस के लैकरेशन से बचने के लिए सावधानीपूर्वक ऊपर की ओर उठाते हुए इसे बहुत धीरे से काट लें। यह प्रक्रिया (चित्रा 2 वी) में एक महत्वपूर्ण कदम है।
- इस चरण में, पार्श्विका हड्डियों को उठाया जाता है और घुमाया जाता है, इस प्रकार शेष मेनिंजियल संलग्नकों की पहचान करने और काटने के लिए हड्डी की आंतरिक सतह को स्क्रैप किया जाता है। मस्तिष्क से दूर, बाहरी रूप से अस्थायी हड्डी को समझें। कक्षा में घुमावदार कैंची या एक रोंगेर का उपयोग करके प्रत्येक तरफ से ललाट की हड्डी को हटा दें और कक्षीय रिज के समकोण पर कोरोनली काटें, लेकिन मिडलाइन (चित्रा 2vii) से आगे नहीं।
- धनु विमान (चित्रा 2viii) में दो कटौती समानांतर और लगभग 4 मिमी अलग करें।
नोट: एक ही स्ट्रोक के साथ दोनों पक्षों को न काटें। - मस्तिष्क की सतह (चित्रा 2ix) से बचने ललाट हड्डी के टुकड़े निकालें। इस बिंदु पर, ड्यूरा मेटर को काटने के लिए एक ठीक कैंची का उपयोग करें, जो घ्राण बल्बों के बीच सुलभ होना चाहिए।
- मस्तिष्क को हटाने में गुरुत्वाकर्षण की सहायता करने के लिए खोपड़ी को धीरे-धीरे उलटा करें, जबकि शेष मेनिंजियल संलग्नक और कपाल तंत्रिकाओं की पहचान और कटौती करना जारी रखें। मस्तिष्क मस्तिष्क से जुड़ी सबसे बड़ी ट्राइजेमिनल तंत्रिका को काटकर जारी किया जाएगा और कैल्वेरियम (चित्रा 2एक्स) के आधार से स्पष्ट रूप से दिखाई देता है।
नोट: मस्तिष्क को आगे विच्छेदन के लिए ठंडे खारा समाधान (बर्फ ठंडा आरएनएएसई मुक्त सोडियम साइट्रेट (0.9%) या शारीरिक (0.9%) खारा) में स्थानांतरित करें।
2. पूर्वकाल और पीछे पिट्यूटरी का विच्छेदन
नोट: पिट्यूटरी ग्रंथियों को एक बहुत ही कठिन तम्बू जैसी झिल्ली द्वारा कवर किया जाता है, जिसमें एक रिज होता है जो बाएं और दाएं ट्राइजेमिनल नसों के बीच पार्श्व रूप से चलता है। ये संरचनाएं बेहद नरम और नाजुक हैं और, जैसे, पिट्यूटरी ग्रंथियों के पीछे और पूर्वकाल लोब को चरणों में अलग-अलग विच्छेदित करने की सिफारिश की जाती है, सीटू में, सीधे खोपड़ी से। विच्छेदन के तुरंत बाद, संबंधित पिट्यूटरी ग्रंथि को पूर्व-लेबल वाली शीशी में स्थानांतरित करें और शीशी को तरल नाइट्रोजन में अधिमानतः अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें। पिट्यूटरी ग्रंथि पश्चकपाल और बेसफेनोइड हड्डियों के जंक्शन पर बिल्कुल टिकी हुई है; यदि वे फ्लेक्स करते हैं, तो पिट्यूटरी वास्तुकला बाधित हो जाती है।
- यह सुनिश्चित करने के लिए श्रवण बुल्ले को बरकरार रखें कि पिट्यूटरी शरीर रचना विज्ञान बरकरार है और आसानी से पहचानने योग्य है (चित्रा 2ix)।
- पिट्यूटरी के पीछे के लोब को खोपड़ी के शेष भाग से पिट्यूटरी के पूर्वकाल लोब के बाद विच्छेदित करें।
- झिल्लीदार तम्बू के रिज में दोनों तरफ एक अत्यंत छोटे परजीवी कटौती करें और अल्ट्रा-फाइन संदंश के साथ पिट्यूटरी के पीछे के लोब को उठाएं, पूर्वकाल पिट्यूटरी ऊतक (चित्रा 2 एक्स) को बाधित न करने का ध्यान रखें।
- पिट्यूटरी के पूर्वकाल लोब और निकटतम ट्राइजेमिनल तंत्रिका के पार्श्व मार्जिन के बीच एक धनु कटौती करें और उसके बाद पिट्यूटरी के पूर्वकाल लोब को उठाएं (चित्रा 2एक्स)।
3. माउस मस्तिष्क विच्छेदन
नोट: मस्तिष्क और पिट्यूटरी हटाने के तुरंत बाद, आगे विच्छेदन एक पूर्व ठंडा स्टेनलेस स्टील ब्लॉक (चित्रा 3) पर किया जाता है। विच्छेदन के बाद, मस्तिष्क क्षेत्रों को पूर्व-लेबल शीशियों में स्थानांतरित करें और शीशियों को अधिमानतः तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस। टॉप-डाउन विधि (कालानुक्रमिक क्रम में) द्वारा उत्पादित संरचनाओं में संभावित रूप से निम्नलिखित शामिल हैं: सेरिबैलम (सीबी), मस्तिष्क स्टेम / हिंद मस्तिष्क (पोंस और मज्जा आयताकार) (एचबी), घ्राण बल्ब (ओबी) गौण घ्राण बल्ब के रूप में, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी), पार्श्व प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एफसीएक्स), पूर्वकाल और पीछे कॉर्पस स्ट्रिएटम (एसटी), वेंट्रल स्ट्रिएटम (वीएस) शामिल हैं सेप्टम (एसई), प्रीऑप्टिक क्षेत्र, पिरिफॉर्म कॉर्टेक्स (पीएफएम), हाइपोथैलेमस (एचवाई), अमिगडाला (एवाई), हिप्पोकैम्पस (एचसी), पीछे सिंगुलेट कॉर्टेक्स (सीएनजी), एंटोराइनल कॉर्टेक्स (ईआरसी), थैलेमस के साथ मिडब्रेन (एमबी) और बाकी सेरेब्रल कॉर्टेक्स (आरओसी) (तालिका 1)। अलगाव के क्रम में विशिष्ट क्षेत्रों पर चर्चा की जाएगी, एक एकल गोलार्ध के साथ काम करना।
- मस्तिष्क को कैल्वेरियम से हटाने में बहुत सावधानी बरतें क्योंकि किसी भी घाव होने पर स्थलों को नष्ट किया जा सकता है। इस चरण में, चेहरे की सुरक्षा का उपयोग करके सभी विच्छेदन करें, विशेष रूप से, एक 7x जौहरी छज्जा, और रोशनी प्रत्येक विच्छेदन के कंधों पर तैनात सर्जिकल लैंप द्वारा प्रदान की जाएगी। विच्छेदन के अधिकांश कुंद मोड छोटे घुमावदार संदंश (यानी, ग्रेफ संदंश) का उपयोग कर पूरा किया जाएगा।
- मस्तिष्क को स्टेनलेस स्टील ब्लॉक (चित्रा 4 आई और चित्रा 4ii) पर रखें। बर्फ और बर्फ-ठंडे खारे घोल के साथ इसे घेरकर ब्लॉक को ठंडा रखें। संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए समय-समय पर बर्फ-ठंडे खारा समाधान के साथ ऊतक को नम करें।
- मस्तिष्क को ऐसी स्थिति दें कि सेरेब्रल कॉर्टिस ऊपर की ओर सामना कर रहे हों। छोटे घुमावदार संदंश का उपयोग करके, धीरे बेहतर, मध्यम और अवर अनुमस्तिष्क पेडुनकल्स को उजागर करके सीबी को प्रतिबिंबित करें और सीबी (चित्रा 43 और चित्रा 4 आईवी) को हटा दें।
- डोरसम से शुरू होने वाला और ओबी और सेरेब्रल गोलार्धों (चित्रा 4 वी) के बीच एक मिडसैगिटल कट बनाएं और सुनिश्चित करें कि पूर्वकाल कमीशन की तुलना में आगे न बढ़ें। इस बिंदु पर, वर्मिस को पार्श्व भागों से आसानी से अलग किया जा सकता है और एचबी को पोंस के पूर्वकाल मार्जिन पर कोरोनल कट द्वारा प्राप्त किया जाएगा।
- पोंस के पीछे के मार्जिन पर एक कोरोनल कट द्वारा मज्जा को अलग करें।
नोट: इस बिंदु पर, डाइएन्सेफलॉन, एपिथैलेमस, थैलेमस, हाइपोथैलेमस और वेंट्रल थैलेमस और तीसरे वेंट्रिकल वाले अग्रमस्तिष्क के पीछे के हिस्से को उदर की ओर मोड़ दिया जाएगा, और ऑप्टिक चियास्म रोस्ट्रली से एक मिडसैजिटल कट बनाया जाएगा। सेरेब्रल गोलार्द्धों का विच्छेदन गोलार्ध में से एक से ओबी को हटाने के बाद इस चरण (चित्रा 4 वी और चित्रा 4वीआई) पर होगा। - आगे डाइएन्सेफलॉन को विच्छेदन करने से पहले सेरेब्रल गोलार्द्धों (चित्रा 4 वी) को अलग करें। पृष्ठीय दृष्टिकोण को गंभीर रूप से प्रमुख मिडलाइन स्थलों को संरक्षित करने के लिए सावधानीपूर्वक कुंद विच्छेदन द्वारा नियोजित किया जाएगा। उन्हें तोड़ने से पहले हर इंटरहेमिस्फेरिक कनेक्शन की कल्पना करें क्योंकि यह मिडलाइन से विचलित होने की संभावना को कम करेगा।
नोट: इस चरण में सेरेब्रल गोलार्ध (हेमिब्रेन) में से एक को संरक्षित किया जा सकता है और दूसरे गोलार्ध का उपयोग आगे विच्छेदन के लिए किया जा सकता है - कॉर्पस कॉलोसम के नीचे एक छोटे, घुमावदार संदंश के बंद ब्लेड को स्लिप करें और धीरे-धीरे नियोकॉर्टेक्स को द्विपक्षीय रूप से वापस लेने के लिए फैलाएं। कॉर्पस कॉलोसम तंत्रिका तंतुओं का एक व्यापक बैंड है जो दो गोलार्धों में शामिल होता है जो नीचे झूठ बोलने वाली मिडलाइन संरचनाओं को परेशान किए बिना संदंश के साथ चुटकी लेकर स्पष्ट रूप से विच्छेदित किया जाएगा।
नोट: गोलार्धों के मेसियल चेहरों में कई स्थल दिखाई देंगे जैसे कि कॉर्पस कॉलोसम के जीनू, फोर्निस और पूर्वकाल कमीशन जैसे माइलिनेटेड संरचनाएं। इसके अलावा, हालांकि मिडलाइन के लिए कुछ मिलीमीटर पार्श्व, मैमिलोथैलेमिक ट्रैक्ट और फासीकुलस रेट्रोफ्लेक्सस भी दिखाई दे सकते हैं। - मध्य रेखा को पार करने वाली कई संरचनाओं को विभाजित करें। इसमें कॉर्पस कॉलोसम, पूर्वकाल कमिशर, वेंट्रल फोर्निक्स कमिशर, पोस्टीरियर कमिशर, पृष्ठीय फोर्निक्स कमिशर, सुप्रा मैमिलरी डिकसेशन, सुपीरियर कोलिकुलस कमिशर, वेंट्रल फोर्निक्स कमिशर और पेरिवेंट्रिकुलर थैलेमिक फाइबर शामिल होंगे।
- मध्य रेखा में या उसके पास इस चरण में विशेष ध्यान रखें जिसे पृष्ठीय दृष्टिकोण विधि द्वारा आंशिक रूप से समझौता किया जा सकता है। सभी अनुवर्ती संरचनाएं जोखिम में हैं यदि सावधानीपूर्वक प्रदर्शन नहीं किया जाता है।
- एमपीएफसी (सिंगुलेट कॉर्टेक्स एरिया 1, प्रिलिम्बिक, इन्फ्रालिम्बिक, औसत दर्जे का कक्षीय, और माध्यमिक मोटर कॉर्टिस [एम 2]) और एफसीएक्स के संग्रह के बाद ओबी (वेज आकार और हल्का रंग) और गौण घ्राण बल्बों को निकालें, जो कॉर्पस कॉलोसम (चित्रा 4vii) के जीनू के लिए 1 मिमी पूर्वकाल बनाया जाता है। परिणामी अनुभाग को औसत दर्जे का से पार्श्व सतह तक की दूरी के 1/3 परासाजिटल कट द्वारा विभाजित करें, जिससे एमपीएफसी औसत दर्जे का और शेष एफसीएक्स पार्श्व रूप से उपज हो। सिंगुलेट कॉर्टेक्स एमपीएफसी का माउस एनालॉग है।
नोट: इस ऊतक टुकड़ा भी एम 2 (माध्यमिक मोटर प्रांतस्था) 17 की एक छोटी राशि होगी और अपरिहार्य है। - परिणामी कोरोनल सेक्शन के रोस्ट्रल चेहरे पर क्रॉस-सेक्शन में पूर्वकाल कमीशन के पार्स पूर्वकाल अंग की दृश्यता के लिए अग्रणी पूर्वकाल कमिशर के स्तर पर एक कोरोनल कट बनाएं, जबकि अनुप्रस्थ भाग अनुभाग के दुम चेहरे में प्रकट होगा यह एनएसी18 के लिए एक पुष्टिकरण मील का पत्थर है। वीएस एनएसी और ओटी से बना है।
नोट: पूर्वकाल कमीशन में अनुप्रस्थ खंड के अलावा एक पूर्वकाल अंग है और इसे पूर्वकाल कमिशर, पार्स पूर्वकाल कहा जाता है। - पार्श्व वेंट्रिकल के पूर्वकाल सींग के नीचे मिडलाइन से पूर्वकाल कमीशन के अनुप्रस्थ भाग के माध्यम से आंशिक रूप से क्षैतिज रूप से काटें, सेप्टल नाभिक को पृष्ठीय रूप से और वीएस वेंट्रली मुक्त करने के लिए। पार्श्व सतह से प्रांतस्था की छोटी मात्रा को हटा दें जहां एनएसी और ओटी को हटा दिया जाएगा।
- कॉर्टिकल नमूने में स्ट्रेटल ऊतक को शामिल न करने के लिए बाहरी कैप्सूल के ठीक बाहर घुमावदार स्केलपेल कट के माध्यम से एसटी के रोस्ट्रल भाग को ओवरलाइंग कॉर्टेक्स से अलग करें। इस बिंदु पर, सेप्टल नाभिक / एसई दिखाई देगा और आसानी से इस टुकड़े (चित्रा 4viii) से लिया जा सकता है।
नोट: पीएफएम की पूर्वकाल और पीछे की सीमाओं को काल्पनिक कोरोनल विमानों द्वारा परिभाषित किया गया है जो क्रमशः पूर्वकाल कमीशन और स्तनधारी निकायों के अनुरूप हैं। औसत दर्जे की सीमा बाहरी कैप्सूल18 द्वारा परिभाषित की गई है। - डाइएन्सेफलॉन के शेष हेमी-सेक्शन की पार्श्व सतह पर, राइनल सल्कस के साथ आंशिक क्षैतिज कटौती करें, लेकिन केवल स्तनधारी निकायों के साथ काल्पनिक कोरोनल प्लेन स्तर तक। एचवाई के स्तनधारी निकायों के विमान में पार्श्व कॉर्टिकल सतह से औसत दर्जे का 1 मिमी विस्तार करते हुए, एक आंशिक कोरोनल कट बनाएं। यहां, क्लॉस्ट्रम के विमान में पैरा-धनु चीरा पीएफएम (चित्रा 4ix और चित्रा 4x) को मुक्त कर देगा।
नोट: डाइएन्सेफलॉन के शेष हेमी-सेक्शन की औसत दर्जे की सतह पर, स्तनधारी निकायों, फासीकुलस रेट्रोफ्लेक्सस और स्ट्रिया मेडुलारिस सहित कई शारीरिक विशेषताएं दिखाई देंगी। एक अर्धवृत्ताकार पैटर्न (पृष्ठीय अवतल पक्ष) दिखाई देगा, जो थैलेमस और एचवाई के बीच के मार्जिन को दर्शाता है। एचवाई को आसानी से ऑप्टिक चियास्म एंटरोवेंट्रल और पूर्वकाल कमिश्नर एंटीओडोर्सली और स्तनधारी निकायों के साथ-साथ फासीकुलस रेट्रोफ्लेक्सस के अनुसार मिडसैगिटल सेक्शन व्यू पर पहचाना जाएगा। बाद के स्थलों को एटलस17 के साथ-साथ अल्बिनो माउस अग्रमस्तिष्क संदर्भ19 में अच्छी तरह से प्रदर्शित किया गया है। - स्तनधारी निकायों के पीछे एक आंशिक कोरोनल कट बनाएं, केवल हाइपोथैलेमिक सल्कस के रूप में पार्श्व तक फैला हुआ है। इस बिंदु पर हाइपोथैलेमिक सल्कस की लंबाई के साथ एक परजीवी कटौती अब एचवाई को मुक्त करती है।
- अतिरिक्त इंट्रा-लिम्बिक कनेक्शन और शेष लिम्बिक सिस्टम घटकों को प्रकट करने के लिए पार्श्व वेंट्रिकल के विचलन को शामिल करें। डाइएन्सेफलॉन के शेष हेमी-सेक्शन के औसत दर्जे का चेहरा देखना, घुमावदार संदंश सबसे अच्छा विकल्प होगा क्योंकि वे तकनीशियन को फोर्निक्स को तोड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले आसपास के क्षेत्र के अन्य नाजुक वर्गों के आसपास हेरफेर करने की अनुमति देते हैं और पार्श्व वेंट्रिकल में डाला जाता है और धीरे-धीरे विस्तारित होता है, वेंट्रिकल खोलने और एचसी को घुमाने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करके ऊर्ध्वाधर से क्षैतिज विमान तक 90 ° । कोरॉइड प्लेक्सस को खंडित करने के लिए # 11 ब्लेड का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है क्योंकि नुकीली नोक सटीक कटौती के साथ मदद कर सकती है।
- क्षैतिज विमान में होने के लिए सीएनजी 90 ° (लेकिन एचसी से विपरीत दिशा में) घुमाएं। संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे एचसी को एक और 180 ° बाहर की ओर घुमाएं और पार्श्व रूप से घुमाएं, जो ईआरसी की आंतरिक सतह को दृश्यमान और ऊपर की ओर सामना करेगा।
- ईआरसी से उत्पन्न होने वाले माइलिनेटेड फाइबर का एक पंखा जैसा विकिरण कोणीय बंडल बनाने के लिए अभिसरण देखा जाएगा, जिसमें छिद्रित पथ और एचसी के लिए इसका लगाव शामिल है। एवाई को प्रकट करने के लिए थैलेमस और एमबी 180 ° पृष्ठीय रूप से घुमाएं।
- यदि आवश्यक हो, तो स्ट्रिया टर्मिनलिस के लगाव को प्रकट करने के लिए ऑप्टिक ट्रैक्ट को उठाएं क्योंकि इसमें एवाई के लिए थैलेमस की वेंट्रिकुलर सतह के पार्श्व मार्जिन के साथ चलने वाले फाइबर के बैंड होंगे और एवाई की रूपरेखा स्पष्ट कर देंगे।
नोट: एचसी और फोर्निक्स अपनी संपूर्णता में स्पष्ट रूप से दिखाई देंगे, पार्श्व वेंट्रिकल में नेस्टेड और, आसानी से बाहर निकाला जा सकता है। पार्श्व वेंट्रिकल पिया मेटर के साथ पंक्तिबद्ध किया जाएगा और ईआरसी के बहुत पारदर्शी सबपियल पहलू के माध्यम से छिद्रित पथ के प्रशंसक जैसी उत्पत्तिदिखाई देगी 20. - औसत दर्जे का ईआरसी की बाहरी सतह में बड़ी पिरामिड कोशिकाओं की एक दृश्यमान प्रमुख परत होगी। इसके अलावा, गोल्गी-धुंधला फाइबर का एक घना अभिसरण औसत दर्जे का ईआरसी में एक प्रमुख विशेषता होगी। इस विच्छेदन प्रक्रिया में, पार्श्व वेंट्रिकल को अनन्त करने के बाद, ये फाइबर पिया मेटर के माध्यम से औसत दर्जे की सतह पर आसानी से दिखाई देंगे, जो वेंट्रिकल्स की आंतरिक सतहों को रेखांकित करता है, जिससे एक बहुत ही प्रमुख प्रशंसक जैसी संरचना बनती है।
- ध्यान दें कि फाइबर उप-इकट्ठा हो रहे हैं, अवरोही और उदर ईआरसी छोड़ रहे हैं, पीछे की ओर बढ़ रहे हैं और फिर एचसी को छिद्रित करने के लिए लंबवत रूप से आरोही हैं। ईआरसी में इस पंखे जैसी संरचना का उपयोग विच्छेदन के उद्देश्य से मार्जिन को परिभाषित करने के लिए किया जाएगा। एवाई, ईआरसी, सीएनजी और एचसी संरचनाओं के क्रम में पहचानें और हटाएं।
नोट: एवाई विच्छेदन के लिए एक अच्छा मील का पत्थर परिभाषित करना अगले चरण के लिए एक कुंजी होगी और पीछे के मार्जिन पर जंक्शन जहां स्ट्रिया टर्मिनल एवाई से मिलता है, एक अच्छा बिंदु होगा। - इस बिंदु पर, शेष संरचनाओं में थैलेमस और एमबी शामिल हैं। मिडलाइन रोस्ट्रोकॉडल प्लेन में फैली अपनी पृष्ठीय सतह पर स्ट्रिया मेडुलारिस के दृश्य द्वारा थैलेमस की पहचान की पुष्टि करें। थैलेमस को मिडब्रेन से पूरी तरह से कोरोनल कट पुच्छल से हैबेनुला और रोस्ट्रल को बेहतर कोलिकुली में अलग करें। आरओसी इस चरण में सहेजा जाता है।
- इस बिंदु पर सभी मस्तिष्क क्षेत्रों का पूरा संग्रह और, तुरंत (जैसा कि प्रत्येक प्राप्त किया जाता है) नमूनों को आगे की प्रक्रिया तक जमे हुए फ्लैश को स्टोर करें।
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Representative Results
जटिल मस्तिष्क संरचना और कार्य की हमारी समझ तेजी से विकसित और सुधार कर रही है। मस्तिष्क में कई अलग-अलग क्षेत्र होते हैं और एक आणविक मानचित्र बनाने से हमें बेहतर ढंग से समझने में मदद मिल सकती है कि मस्तिष्क कैसे काम करता है। इस विधि पत्र में, हमने माउस मस्तिष्क के विच्छेदन पर कई अलग-अलग क्षेत्रों (तालिका 1) में चर्चा की है। इस प्रोटोकॉल में, संरचनाओं को महत्वपूर्ण स्थलों के आधार पर पहचाना जाता है और तत्काल विच्छेदन के लिए इसकी मजबूती को बनाए रखकर खारा समाधान के साथ ऊतक को नम रखकर प्राप्त किया जाता है। विधि अन्य रिपोर्ट21 की तुलना में अधिक क्षेत्रों को कवर करती है और जमे हुए दिमाग22,23 का उपयोग करके विच्छेदन विधियों के पूरक है। अध्ययन की आवश्यकताओं के आधार पर इन विच्छेदित ऊतकों को संरक्षित और संसाधित किया जा सकता है। यहां चर्चा की गई विधि खोपड़ी से मस्तिष्क को तत्काल हटाने के बाद विच्छेदन है जो माउस मस्तिष्क के आकार को देखते हुए डाउनस्ट्रीम परख के लिए त्वरित तरीके से पर्याप्त ऊतक प्रदान करता है। हमारी टीम ने कई विच्छेदित ऊतकों से आरएनए निकाला है और मस्तिष्क के ऊतकों के लिए माइक्रोएरे का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए परख की है; एवाई, एचसी, एमपीएफसी, सेप्टल क्षेत्र, कॉर्पस स्ट्रिएटम और वीएस औरपरिणाम प्रकाशित किए गए हैं। इन कटाई दिमाग को आरएनए निष्कर्षण से पहले कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। मस्तिष्क क्षेत्रों की डाउनस्ट्रीम उपयोगिता में विविधता लाने के लिए अन्य तरीकों के संयोजन में इस पद्धति को अपनाया जा सकता है। यह विच्छेदन विधि कड़ाई से कोरोनल या धनु विच्छेदन होने के बजाय शारीरिक रूप से अलग-अलग आस-पास के क्षेत्रों के बीच स्थलों का पालन करने पर केंद्रित है। वजन डेटा के साथ अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों को अध्ययन के तहत एकत्र किया गया था और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग के साथ पीटीएसडी16 और आरएनए सांद्रता के सामाजिक तनाव मॉडल को चित्रा 5 के रूप में दिखाया गया है।
चित्रा 1: अलग ऊतक प्रकार एकत्र के साथ माउस मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा संरचनाओं का एक कॉस्मेटिक प्रतिनिधित्व है और इसे किसी भी मैप किए गए डेटाबेस में स्केल नहीं किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पिट्यूटरी हटाने के बाद कपाल गुहा से मस्तिष्क हटाना। मस्तिष्क को हटाने के लिए चरणबद्ध प्रक्रिया (i) बालों को हटाने के बाद क्लैंपिंग और पकड़ना (ii) मांसपेशियों को हटाने से पहले (iv) मांसपेशियों को हटाने से पहले (v) मेनिंग्स को अलग करना (vi) ग्लोब / आंखों को हटाने (vii) कक्षीय रिज पर कटौती (viii) पार्श्विका और ललाट हड्डियों को हटाने (9) मस्तिष्क प्रदर्शन और हटाने (x) मस्तिष्क टुकड़ी (xi) पिट्यूटरी दृश्य कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: विच्छेदन सेटअप स्टेशन। यह छवि मस्तिष्क विच्छेदन पोस्ट-मस्तिष्क और पिट्यूटरी ऊतकों को हटाने के लिए सेट अप दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: मस्तिष्क विच्छेदन। मस्तिष्क हटाने के लिए चरणबद्ध प्रक्रिया (i) मस्तिष्क का शीर्ष दृश्य (ii) मस्तिष्क का पृष्ठीय दृश्य (iii) सेरिबैलम हटाने (iv) सेरेब्रल पृथक्करण (v) गोलार्ध विच्छेदन (vi) घ्राण बल्ब हटाने (vii) एमपीएफसी, एफसीएक्स और गौण घ्राण विच्छेदन (viii) एसई, वीएस और एसटी विच्छेदन (ix) पीएफएम हटाने (x) लिम्बिक प्रणाली विच्छेदन कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: नमूना संग्रह (ए) मस्तिष्क ऊतक वजन और (बी) आरएनए एकाग्रता और (सी) मस्तिष्क के ऊतकों में से प्रत्येक से आयुध डिपो 260/280 के बाद उत्पन्न डेटा दिखाया गया है। यहां डेटा एक अध्ययन समूह से नियंत्रण समूहों (एन = 3-6) से एकत्र किया जाता है जैसा कि पहले15,16 की सूचना दी गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| # | संक्षिप्त रूप | मस्तिष्क क्षेत्र का विवरण |
| 1 | सीबी | सेरिबैलम |
| 2 | एचबी | मस्तिष्क स्टेम / हिंद मस्तिष्क (पोंस और मज्जा आयताकार) |
| दो गोलार्द्धों में अलग | ||
| 3 | ओबी | घ्राण बल्ब और गौण घ्राण बल्ब |
| 4 | एमपीएफसी | औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स |
| 5 | एफसीएक्स | पार्श्व प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स |
| 6 | एसई | सेप्टम या सेप्टल क्षेत्र |
| 7 | बनाम | वेंट्रल स्ट्रिएटम में न्यूक्लियस एकम्बेंस (एनएसी) और घ्राण ट्यूबरकल (ओटी) शामिल हैं |
| 8 | सेंट | पूर्वकाल और पीछे कॉर्पस स्ट्रिएटम |
| 9 | हाय | हाइपोथैलेमस |
| 10 | पीएफएम | पिरीफॉर्म कॉर्टेक्स |
| 11 | कोर्ट | हिप्पोकैम्पस |
| 12 | ईआरसी | एंटोराइनल कॉर्टेक्स |
| 13 | सीएनजी | पीछे सिंगुलेट कॉर्टेक्स |
| 14 | प्र | अमिगडाला |
| 15 | एमबी | थैलेमस के साथ मिडब्रेन |
| 16 | आरओसी | सेरेब्रल कॉर्टेक्स के शेष |
तालिका 1: माउस मस्तिष्क से अलग क्षेत्रों का विवरण। इस तालिका में इसके संक्षिप्त नाम के साथ एकत्र किए गए सभी मस्तिष्क क्षेत्रों की सूची शामिल है।
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Discussion
स्तनधारी मस्तिष्क एक जटिल अंग है जो विभिन्न आणविक हस्ताक्षरों और कई क्षेत्रों के साथ रूपात्मक रूप से अलग और कार्यात्मक रूप से अद्वितीय कोशिकाओं की एक सरणी से बना है जो विशेष और असतत कार्य करते हैं। यहां बताई गई विच्छेदन प्रक्रिया में प्रयोगशाला की आवश्यकताओं के आधार पर कई लक्ष्य हो सकते हैं। हमारी प्रयोगशाला में हमने तनाव16 जैसे PTSD के संपर्क में आने वाले चूहों से एकत्र किए गए कई मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रतिलेखन का मूल्यांकन किया। हम कई मस्तिष्क क्षेत्रों में अभिव्यक्ति के स्तर पर तनाव आनुवंशिक पृष्ठभूमि24 के प्रभाव का अध्ययन करना चाहते हैं। इस प्रोटोकॉल प्रयोगों के सफल प्रजनन क्षमता के लिए विचार किया जा करने के लिए आवश्यक है कि कई महत्वपूर्ण कदम है। मस्तिष्क के स्थानीयकृत क्षेत्रों में से प्रत्येक न्यूरोपैथोलॉजिकल स्थिति में एक अलग भूमिका निभाता है और अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मस्तिष्क क्षेत्र के विस्तृत ज्ञान की कमी है। इसलिए मस्तिष्क क्षेत्र से संबंधित डेटासेट उत्पन्न करना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, डेटा को न केवल मस्तिष्क क्षेत्र का चयन करके बल्कि डेटा श्रेणी (जैसे, ट्रांसक्रिप्टोम, प्रोटीन, सेल (साइटोआर्किटेक्चरल), या अन्य) द्वारा भी पूछताछ की जा सकती है जिससे अधिक सटीक जानकारी मिलती है। इससे पहले, ताजा चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में घ्राण बल्ब, ललाट प्रांतस्था, स्ट्रिएटम और हिप्पोकैम्पस जैसे ऊतकों को माइक्रोस्कोप25 का उपयोग करके विच्छेदित दिखाया गया है। वैकल्पिक रूप से वर्गों को विच्छेदित किया जा सकता है जबकि मस्तिष्क आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के बाद जमे हुए14 है लेकिन यह विधि मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित है जिन्हें स्पष्ट स्थलों द्वारा पहचाना जा सकता है। कुल आरएनए निष्कर्षण प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों से माइक्रोडिसेक्शन25 के बाद के साथ-साथ जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए गैर-लेजर कैप्चर माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग करके किया गयाहै 13. यहां हम विशिष्ट मस्तिष्क संरचनाओं को अलग करने के लिए ताजा माउस मस्तिष्क के विच्छेदन पर ध्यान केंद्रित करते हैं जिनके पास शारीरिक और व्यवहारिक कार्यों पर समर्पित नियंत्रण है। हमारी विधि पहले से प्रकाशित रिपोर्टों की तुलना में अधिक क्षेत्रों के विच्छेदन की व्याख्या करती है, हालांकि यह उपलब्ध अन्य विच्छेदन विधियों के पूरक है। यह दृष्टिकोण ऊतकों का व्यापक मूल्यांकन और दुर्बल करने वाली स्थितियों के साथ इसके सहयोग को प्रदान करने में मदद कर सकता है। यह विच्छेदन रणनीति मौजूदा नमूना संग्रह रणनीतियों को नई खोजों के लिए संभावनाएं खोलने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करती है।
यहां वर्णित विधि के साथ, मस्तिष्क के ऊतकों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करने से पहले तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्नैप किया जाता है। यह महत्वपूर्ण है कि न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन के संरक्षण के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान उपकरण और ऊतकों को ठंडा रखा जाए। इन जमे हुए ऊतकों को बाद में प्रयोगशाला मानक संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग करके समरूप किया जाता है। इनमें से कुछ मस्तिष्क के ऊतक बहुत छोटे होते हैं और उच्च तापमान पर गिरावट से लक्ष्य अणुओं की रक्षा करने वाली होमोजेनाइजेशन और निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान देखभाल की जानी चाहिए।
इस प्रक्रिया में, विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों को इंगित करने के लिए स्पष्ट स्थलों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। यह नमकीन घोल के साथ ऊतक को नम रखकर प्राप्त किया जाता है ताकि इसे जल्दी से नरम होने से बचाया जा सके और थोड़ी देर के लिए इसकी मजबूती को बनाए रखा जा सके। हमारे पिछले अध्ययनों ने नियंत्रण और हमलावर उजागर माउसऊतकों 15 के बीच जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों की तुलना की और विच्छेदन के दौरान उपयोग किए जाने वाले खारा के कारण होने वाले किसी भी परिवर्तन का अध्ययन नहीं किया। हमारे अनुभव में, यह हाइपोथैलेमस और 180 ° फ़्लिपिंग से शुरू होने वाले चीरा के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि यह लिम्बिक क्षेत्रों (एवाई, एचसी, ईआरसी) के क्षेत्रीय पृथक्करण छायांकन को उजागर करता है और स्पष्ट और अधिक स्पष्ट बनाता है। लिम्बिक प्रणाली मस्तिष्क के भीतर गहरी स्थित है और विभिन्न उत्तेजनाओं से क्षतिग्रस्त हो जाती है, और इसलिए नैदानिक और चिकित्सीय रूप से महत्वपूर्ण है। लिम्बिक प्रणाली में मस्तिष्क क्षेत्र होते हैं, हालांकि इस सूची26 पर कोई सार्वभौमिक समझौता नहीं है। हालांकि अध्ययन नहीं किया गया है, हमें लगता है कि खारा उपयोग के न्यूनतम या कोई प्रभाव नहीं हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंड की स्थिति के बाद पूरी प्रक्रिया लगभग 20 मिनट तक चलती है।
मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर के क्षेत्रों को मस्तिष्क एटलस में उल्लिखित स्थलों का उपयोग करके पहचाना जाता है। इस तकनीक का उपयोग करके, स्थलों को स्पष्ट करने की आवश्यकता है और इस प्रक्रिया को क्रमिक रूप से किया जाना चाहिए। विच्छेदन किया जाना चाहिए जबकि मस्तिष्क अभी भी ताजा और मजबूत है; (पहले 15 से 20 मिनट के साथ किया जाना चाहिए) - अन्यथा स्थलों को स्पष्ट नहीं किया जाएगा और यदि मस्तिष्क लंबे समय तक रहता है और नरम हो जाता है तो क्षेत्र अलग नहीं होंगे।
जैसा कि ऊपर वर्णित है, मस्तिष्क के भीतर उप क्षेत्र हैं, जिनमें कई कार्यात्मक क्षेत्र होते हैं जो स्वतंत्र रूप से या आंतरिक संयोजी नेटवर्क के समन्वय में कार्य करते हैं। इसके व्यापक आयामों का अध्ययन करने के लिए इन क्षेत्रों को बड़ी सटीकता के साथ पुनः प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यह विशेष क्षेत्रों के संयोजन से इन अवधारणाओं को एकीकृत करने में मदद करेगा जहां प्रत्येक चिकित्सीय क्षमता के साथ एक अलग प्रक्रिया की सेवा कर रहा है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम प्रायोगिक सहायता के लिए सुश्री शेषमालिनी श्रीनिवासन, श्री स्टीफन बटलर और सुश्री पामेला स्पेलमैन और पांडुलिपि के संपादन के लिए सुश्री दाना यूसुफ को धन्यवाद देते हैं। यूएसएएमआरडीसी से वित्त पोषण सहायता कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार की जाती है। जिनेवा फाउंडेशन ने इस काम में योगदान दिया और अमेरिकी सेना अनुसंधान कार्यालय के माध्यम से सैन्य और परिचालन चिकित्सा अनुसंधान क्षेत्र निदेशालय III से धन द्वारा समर्थित किया गया।
अस्वीकरण:
वाल्टर रीड आर्मी इंस्टीट्यूट ऑफ रिसर्च द्वारा सामग्री की समीक्षा की गई है। इसकी प्रस्तुति और/या प्रकाशन पर कोई आपत्ति नहीं है। यहां निहित राय या दावे लेखक के निजी विचार हैं, और इसे आधिकारिक के रूप में नहीं माना जाना चाहिए, या सेना विभाग या रक्षा विभाग के सच्चे विचारों को प्रतिबिंबित करने के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। पशु कल्याण अधिनियम और जानवरों से संबंधित अन्य संघीय क़ानूनों और नियमों के अनुपालन में एएएएलएसी मान्यता प्राप्त सुविधा में एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान आयोजित किया गया था और जानवरों से जुड़े प्रयोगों और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में बताए गए सिद्धांतों का पालन करता है, एनआरसी प्रकाशन, 2011 संस्करण।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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