Summary
Vi presenterar ett praktiskt, steg-för-steg, snabbt protokoll för borttagning av mushjärnor och dissektion av diskreta regioner från färsk hjärnvävnad. Att få hjärnregioner för molekylär analys har blivit rutin i många neurovetenskapliga laboratorier. Dessa hjärnregioner fryses omedelbart för att erhålla transkriptomiska data av hög kvalitet för analys på systemnivå.
Abstract
Hjärnan är kommandocentralen för däggdjurens nervsystem och ett organ med enorm strukturell komplexitet. Skyddad i skallen består hjärnan av ett yttre täcke av grå substans över halvklotet som kallas hjärnbarken. Under detta lager finns många andra specialiserade strukturer som är väsentliga för flera fenomen som är viktiga för existensen. Att förvärva prover av specifika grova hjärnregioner kräver snabba och exakta dissektionssteg. Det är underförstått att på mikroskopisk nivå finns många delregioner och sannolikt korsar de godtyckliga regionala gränser som vi inför för denna dissektion.
Musmodeller används rutinmässigt för att studera mänskliga hjärnfunktioner och sjukdomar. Förändringar i genuttrycksmönster kan begränsas till specifika hjärnområden som riktar sig mot en viss fenotyp beroende på det sjuka tillståndet. Således är det av stor betydelse att studera reglering av transkription med avseende på dess väldefinierade strukturella organisation. En fullständig förståelse av hjärnan kräver att man studerar distinkta hjärnregioner, definierar anslutningar och identifierar viktiga skillnader i aktiviteterna i var och en av dessa hjärnregioner. En mer omfattande förståelse av var och en av dessa distinkta regioner kan bana väg för nya och förbättrade behandlingar inom neurovetenskap. Häri diskuterar vi en steg-för-steg-metod för att dissekera mushjärnan i sexton distinkta regioner. I denna procedur har vi fokuserat på manlig mus C57Bl / 6J (6-8 veckor gammal) hjärnborttagning och dissektion i flera regioner med hjälp av neuroanatomiska landmärken för att identifiera och prova diskreta funktionellt relevanta och beteenderelevanta hjärnregioner. Detta arbete kommer att bidra till att lägga en stark grund inom neurovetenskap, vilket leder till mer fokuserade tillvägagångssätt för den djupare förståelsen av hjärnans funktion.
Introduction
Hjärnan, tillsammans med ryggmärgen och näthinnan, utgör centrala nervsystemet som utför komplexa beteenden, styrda av specialiserade, exakt positionerade och interagerande celltyper i hela kroppen1. Hjärnan är ett komplext organ med miljarder sammankopplade neuroner och glia med exakta kretsar som utför många funktioner. Det är en bilateral struktur med två distinkta lober och olika cellulära komponenter2. Ryggmärgen förbinder hjärnan med omvärlden och skyddas av ben, hjärnhinnor och ryggmärgsvätska och leder meddelanden till och från hjärnan 2,3,4. Hjärnans yta, hjärnbarken, är ojämn och har distinkta veck, kallade gyri, och spår, kallade sulci, som separerar hjärnan i funktionella centra5. Cortex är slät hos däggdjur med en liten hjärna 6,7. Det är viktigt att karakterisera och studera den mänskliga hjärnans arkitektur för att förstå störningarna relaterade till de olika hjärnregionerna, liksom dess funktionella kretsar. Neurovetenskaplig forskning har expanderat de senaste åren och en mängd experimentella metoder används för att studera hjärnans struktur och funktion. Utvecklingen inom molekylär- och systembiologi har inlett en ny era av att utforska det komplexa förhållandet mellan hjärnstrukturer och molekylers funktion. Dessutom expanderar molekylärbiologi, genetik och epigenetik snabbt, vilket gör det möjligt för oss att öka vår kunskap om de underliggande mekanismerna som är involverade i hur system fungerar. Dessa analyser kan utföras på en mycket mer lokaliserad basis för att hjälpa till att rikta in sig på utredning och utveckling av effektivare terapier.
Däggdjurshjärnan är strukturellt definierad i tydligt identifierbara diskreta regioner; De funktionella och molekylära komplexiteterna hos dessa diskreta strukturer är emellertid ännu inte klart förstådda. Hjärnvävnadens flerdimensionella och flerskiktade natur gör detta landskap svårt att studera på funktionell nivå. Dessutom komplicerar det faktum att flera funktioner utförs av samma struktur och vice versa ytterligare förståelsen av hjärnan8. Det är viktigt att det experimentella tillvägagångssättet som utförs för strukturell och funktionell karakterisering av hjärnregioner använder exakta forskningsmetoder för att uppnå konsistens i provtagning för att korrelera neuroanatomisk arkitektur med funktion. Hjärnans komplexitet har nyligen förklarats med hjälp av encellssekvensering 9,10, såsom den mänskliga hjärnans temporala gyrus som består av 75 distinkta celltyper 11. Genom att jämföra dessa data med dem från en analog region i mushjärnan avslöjar studien inte bara likheter i deras arkitektur och celltyper utan presenterar också skillnaderna. För att reda ut de komplexa mekanismerna är det därför viktigt att studera olika regioner i hjärnan med full precision. Bevarade strukturer och funktion mellan en mänsklig och mushjärna möjliggör användning av en mus som ett preliminärt surrogat för att belysa mänsklig hjärnfunktion och beteendemässiga resultat.
Med utvecklingen av systembiologiska tillvägagångssätt har det blivit ett nyckelförfarande inom neurovetenskaplig forskning att få information från diskreta hjärnregioner hos gnagare. Medan vissa protokoll som laserfångstmikrodissektion12 kan vara dyra, är mekaniska protokoll billiga och utförs med hjälp av allmänt tillgängliga verktyg13,14. Vi har använt flera hjärnregioner för transkriptomiska analyser15 och har utvecklat en praktisk och snabb procedur för att dissekera mushjärnregioner av intresse steg för steg på kort tid. När de har dissekerats kan dessa prover lagras omedelbart under kalla förhållanden för att bevara nukleinsyrorna och proteinerna i dessa vävnader. Vårt tillvägagångssätt kan utföras snabbare vilket leder till hög effektivitet och tillåter mindre risk för vävnadsförsämring. Detta ökar i slutändan chanserna att generera högkvalitativa, reproducerbara experiment med hjärnvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurhantering och försöksförfaranden genomfördes i enlighet med europeiska, nationella och institutionella riktlinjer för djurvård. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid US Army Center for Environmental Health Research nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) och utfördes i en anläggning ackrediterad av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
OBS: Proceduren kommer att utföras på sex till åtta veckor gamla hanmöss av C57BL/6j-stammen som avlivats av livmoderhalsförskjutning16. Inga perfusioner utförs i vårt laboratorium men detta protokoll kan modifieras varigenom perfusioner för att rensa blod från kärlen kan utföras. Alla leveranser som krävs för dissektion listas i materialförteckningen. Dissektionen är indelad i tre komponenter, inklusive avlägsnande av hjärnan, avlägsnande av hypofysen och hjärndissektion. Avsikten med insamling av hjärnvävnad är att bearbeta dem för transkriptomiska analyser efter RNA-extraktioner. Så snart hjärnregionen dissekeras överför vi omedelbart var och en av hjärnregionerna till en redan märkt frysflaska och förvarar sedan injektionsflaskan i flytande kväve eller -80 °C.
OBS: Grundlig kunskap om neuroanatomi är avgörande för att utföra denna procedur. Horisontella och längsgående sektioner, liksom de vanliga tvärgående sektionerna, bör studeras och läras. Eftersom hjärnvävnad försämras mycket snabbt finns det ingen tid att konsultera en atlas när du utför denna procedur.
1. Borttagning av mushjärna
- Kläm fast maxillan på det halshuggna huvudet med en hemostat (figur 2i) och använd en gasbinda för att reflektera hårbotten rostralt och ytterligare skapa ett torrt fält på skallens dorsum (figur 2ii).
- Sätt in den fina böjda saxen i foramen magnum för att separera de vidhäftande hjärnhinnorna. Här sätter du in saxen vid öppningen på basen av skallen är foramen magnum, där ryggmärgen passerar med bladet pekande vertikalt (klockan 12), men parallellt med och pressar mot den inre ytan av basalplattans ben (dvs occipital squama) och roterar bladet fyrtiofem ° till vänster sida och sedan till höger sida.
- Fortsätt att rotera handleden för att bända bort basalplattbenet som kommer att klippa upp mitten av det återstående benet som fortsätter in i det occipitala benet och intraparietala ben som bänder benen åt vänster och höger tills de tas bort. På liknande sätt, ta bort det occipitala benet och det intraparietala benet för att exponera cerebellum.
OBS: Vid denna tidpunkt kan den ihåliga beniga strukturen som kallas tympanisk bullae, på den ventrala bakre delen av skallen som omsluter delar av mellan- och innerörat, tas bort om man inte dissekerar hypofysens bakre och främre lober (figur 2iii). - Ta bort muskelfästena till den temporala åsen med ett krökt vasst saxblad. Placera en lem av den böjda vassa saxen under lambdoidsuturen som tränger in i korsningen mellan de tvärgående och sagittala bihålorna (figur 2iv).
- För saxen rostralt längs midsagittal sutur upp till bregma och skär den mycket försiktigt medan du försiktigt lyfter uppåt för att undvika laceration av cerebrala kortikaler. Detta är ett kritiskt steg i proceduren (figur 2v).
- Vid detta steg lyfts och roteras parietala ben och skrapar därmed benets inre yta för att identifiera och skära återstående meningealfästen. Ta tag i det temporala benet som bänder utåt, bort från hjärnan. Ta bort frontbenet från varje sida med hjälp av böjd sax eller en rongeur i omloppsbanan och skär koronalt i rätt vinkel mot orbitalryggen, men inte längre än mittlinjen (figur 2vii).
- Gör två snitt parallellt och ca 4 mm från varandra i sagittalplanet (figur 2viii).
OBS: Skär inte båda sidor med ett enda slag. - Ta bort fragmenten av frontbenet och undvik att skada hjärnytan (figur 2ix). Använd nu en fin sax för att klippa dura mater, som ska vara tillgänglig mellan luktlökarna.
- Vänd försiktigt skallen så att tyngdkraften kan hjälpa till att ta bort hjärnan, samtidigt som du fortsätter att identifiera och skära återstående meningealfästen och kranialnerver. Hjärnan kommer att frigöras genom att skära den största trigeminusnerven som är fäst vid hjärnan och är tydligt synlig som sträcker sig från basen av kalvarium (figur 2x).
OBS: Överför hjärnan till en kall saltlösning (iskall RNas-fritt natriumcitrat (0,9%) eller fysiologisk (0,9%) saltlösning) för ytterligare dissektion.
2. Dissektion av de främre och bakre hypofyserna
OBS: Hypofysen är täckta av ett mycket tufft tältliknande membran, med en ås som löper i sidled mellan vänster och höger trigeminusnerv. Dessa strukturer är extremt mjuka och känsliga och som sådana rekommenderas hypofysens bakre och främre lober dissekeras separat i steg, in situ, direkt från skallen. Omedelbart efter dissektion, överför respektive hypofysen till en förmärkt injektionsflaska och förvara injektionsflaskan i flytande kväve, helst annars -80 °C. Hypofysen vilar exakt över korsningen av occipital och basisfenoid ben; Om de flexar störs hypofysarkitekturen.
- Håll hörselbullorna intakta för att se till att hypofysens anatomi är intakt och lätt identifierbar (figur 2ix).
- Dissekera hypofysens bakre lob följt av hypofysens främre lob, från resten av skallen.
- Gör ett extremt litet parasagittalt snitt på båda sidor i åsen på det membranösa tältet och lyft hypofysens bakre lob med ultrafina pincett, var noga med att inte störa den främre hypofysvävnaden (Figur 2x).
- Gör ett sagittalt snitt mellan sidokanterna på hypofysens främre lob och närmaste trigeminusnerv och lyft ut hypofysens främre lob därefter (figur 2x).
3. Mushjärndissektion
OBS: Omedelbart efter borttagning av hjärna och hypofys utförs ytterligare dissektion på ett förkylt rostfritt stålblock (figur 3). Efter dissektion, överför hjärnregionerna till förmärkta injektionsflaskor och överför injektionsflaskorna helst till flytande kväve annars -80 °C. Strukturer som produceras med top-down-metoden (i kronologisk ordning) inkluderar potentiellt följande: cerebellum (CB), hjärnstam / bakhjärna (pons och medulla oblongata) (HB), luktlökar (OB) som tillbehör olfaktoriska lökar, medial prefrontal cortex (MPFC), lateral prefrontal cortex (FCX), främre och bakre corpus striatum (ST), ventral striatum (VS) bestående av kärnan accumbens (NAC) och lukttuberkel (OT), septum (SE), preoptiskt område, piriform cortex (PFM), hypotalamus (HY), amygdala (AY), hippocampus (HC), posterior cingulate cortex (CNG), entorhinal cortex (ERC), midbrain (MB) med thalamus och resten av hjärnbarken (ROC) (Tabell 1). Specifika regioner kommer att diskuteras i isoleringsordning och arbeta med en enda halvklot.
- Var mycket försiktig med att ta bort hjärnan från calvarium eftersom landmärkena kan förstöras om det finns några lacerations. I detta steg, utför alla dissektioner med ansiktsskydd, specifikt ett 7x juvelerarvisir, och belysning kommer att tillhandahållas av kirurgiska lampor placerade över var och en av dissektorns axlar. Mycket av dissektion kommer att åstadkommas med trubbigt läge små böjda pincett (dvs Graefe pincett).
- Placera hjärnan på ett block av rostfritt stål (figur 4i och figur 4ii). Håll blocket kallt genom att omge det med is och en iskall saltlösning. Fukta vävnaden regelbundet med iskall saltlösning för att bevara strukturerna.
- Placera hjärnan så att hjärnkortikerna är vända uppåt. Använd små böjda pincett, reflektera försiktigt CB genom att exponera de överlägsna, mellersta och underlägsna cerebellära pedunclesna och ta bort CB (figur 4iii och figur 4iv).
- Gör ett midsagittalsnitt med början från dorsum och mellan OB och hjärnhalvorna (figur 4v) och se till att inte sträcka dig längre än den främre kommissuren. Vid denna tidpunkt kan vermis lätt separeras från sidodelarna och HB kommer att erhållas genom ett koronalt snitt vid pons främre marginal.
- Separera medulla med ett koronalsnitt vid pons bakre marginal.
OBS: Vid denna tidpunkt kommer diencephalon, den bakre delen av framhjärnan som innehåller epithalamus, thalamus, hypotalamus och ventral thalamus och den tredje ventrikeln, att vändas ventral sida uppåt, och en midsagittal skärning kommer att göras från den optiska chiasm rostralt. Dissektion av hjärnhalvor följt av avlägsnande av OB från en av halvklotet kommer att ske i detta steg (figur 4v och figur 4vi). - Separera hjärnhalvorna (figur 4v) innan diencephalon dissekeras ytterligare (figur 4v). Dorsalmetoden kommer att användas genom noggrann trubbig dissektion för att bevara de kritiskt framträdande mittlinjens landmärken. Visualisera varje interhemisfärisk anslutning innan du avbryter dem eftersom detta minimerar möjligheten att avvika från mittlinjen.
OBS: I detta steg kan en av hjärnhalvorna (Hemibrain) bevaras och den andra halvklotet kan användas för ytterligare dissektion - Släpp de slutna bladen på en liten, krökt tång, under corpus callosum och sprid försiktigt för att dra tillbaka neocortex bilateralt. Corpus callosum är ett brett band av nervfibrer som förenar de två halvkloten som kommer att dissekeras trubbigt genom att klämma med pincetten utan att störa mittlinjestrukturerna som ligger under.
NOTERA: Mesiala ansikten på halvklotet kommer att ha flera landmärken synliga, såsom myeliniserade strukturer som genu of the corpus callosum, fornices och den främre kommissuren. Även om det är några millimeter i sidled till mittlinjen kan mammillothalamic tract och fasciculus retroflexus också vara synliga. - Bisekera de flera strukturerna som korsar mittlinjen. Detta kommer att inkludera corpus callosum, främre kommissur, ventral fornix commissure, posterior commissure, dorsal fornix commissure, supra mammillary decussation, superior colliculus commissure, ventral fornix commissure och periventrikulära thalamiska fibrer.
- Var särskilt försiktig vid detta steg i eller nära mittlinjen som delvis kan äventyras av dorsalmetoden. Alla uppföljningsstrukturer är i fara om de inte utförs noggrant.
- Ta bort OB (kilformad och ljusare färg) och tillbehör olfaktoriska glödlampor följt av insamling av MPFC (cingulate cortex area 1, prelimbic, infralimbic, mediala orbital och sekundära motorkortiker [M2]) och FCX genom ett koronalt snitt som görs 1 mm främre till genu av corpus callosum (figur 4vii). Dela den resulterande sektionen med en parasagittal skuren 1/3 av avståndet från den mediala till laterala ytan, vilket ger MPFC medialt och resten av FCX i sidled. Den cingulära cortexen är musanalogen till MPFC.
OBS: Denna vävnadsskiva kommer också att innehålla en liten mängd av M2 (sekundär motorcortex) 17 och är oundviklig. - Gör ett koronalt snitt på nivån av den främre kommisssuren som leder till synlighet av pars främre lem i den främre kommissuren i tvärsnittet på rostralytan av den resulterande koronala sektionen medan den tvärgående delen kommer att avslöjas i sektionens kaudala ansikte Detta är ett bekräftande landmärke för NAC18. VS består av NAC och OT.
OBS: Det finns en främre lem förutom det tvärgående segmentet i den främre kommissuren och det kallas främre kommissur, pars främre. - Skär delvis horisontellt genom den tvärgående delen av den främre kommissuren från mittlinjen under det främre hornet i sidokammaren, för att frigöra septalkärnan dorsalt och VS ventralt. Ta bort den lilla mängden cortex från sidoytan där NAC och OT kommer att tas bort.
- Separera den rostrala delen av ST från den överliggande cortexen via krökt skalpellskärning strax utanför den yttre kapseln och var noga med att inte inkludera striatal vävnad i det kortikala provet. Vid denna tidpunkt kommer septalkärnorna / SE att vara synliga och kan enkelt tas från denna skiva (figur 4viii).
OBS: De främre och bakre gränserna för PFM definieras av imaginära koronalplan som är i linje med den främre kommissuren respektive mammillärkropparna. Den mediala gränsen definieras av den yttre kapseln18. - På sidoytan av den återstående hemi-sektionen av diencephalon, gör ett partiellt horisontellt snitt längs rhinal sulcus som sträcker sig kaudalt, men endast så långt som det imaginära koronalplanet nivå med mammillärkropparna. Gör ett partiellt koronalsnitt som sträcker sig medialt 1 mm från den laterala kortikala ytan i planet för HY: s mammillära kroppar. Här kommer para-sagittal snitt i claustrumplanet att frigöra PFM (figur 4ix och figur 4x).
OBS: På den mediala ytan av den återstående hemi-sektionen av diencephalon kommer många anatomiska egenskaper att vara synliga, inklusive mammillärkropparna, fasciculus retroflexus och stria medullaris. Ett halvcirkelformat mönster (dorsal konkav sida) kommer att vara synligt, vilket betecknar marginalen mellan thalamus och HY. HY kommer lätt att identifieras på midsagittalsektionsvyn enligt den optiska chiasmen anteroventralt och främre kommissurerande anterodorsalt och mammillärkropparna tillsammans med fasciculus retroflexus bakre. De senare landmärkena har visats väl i atlas17 samt i albinomusens framhjärna sammanhang19. - Gör ett partiellt koronalt snitt bakom mammillärkropparna, som sträcker sig endast så långt i sidled som hypotalamisk sulcus. Vid denna tidpunkt frigör en parasagittal skärning längs längden på den hypotalamiska sulcusen nu HY .
- Medför eversion av lateral ventrikel för att avslöja ytterligare intra-limbiska anslutningar och de återstående limbiska systemkomponenterna. Titta på den mediala ytan av den återstående hemi-sektionen av diencephalon, böjda pincett är det bästa alternativet eftersom de tillåter teknikern att manipulera runt andra känsliga delar av det omgivande området som används för att skära fornix och sätts in i sidokammaren och försiktigt expanderas, med trubbig dissektion för att öppna ventrikeln och rotera HC 90° från vertikalplanet till horisontalplanet. Det kan vara nödvändigt att använda bladet #11 för att sektionera den koroidala artären / choroid plexus eftersom den spetsiga spetsen kan hjälpa till med exakta snitt.
- Vrid CNG 90° (men i motsatt riktning från HC) för att vara i horisontalplanet. Använd pincett och rotera försiktigt HC ytterligare 180 ° utåt och i sidled, vilket gör ERC : s inre yta synlig och vänd uppåt.
- En fläktliknande strålning av myeliniserade fibrer som härrör från ERC kommer att ses konvergera för att bilda vinkelbunten, inklusive perforantvägen och dess fastsättning på HC. Rotera thalamus och MB 180 ° dorsalt för att ventralt avslöja AY.
- Om det behövs, lyft optikkanalen för att avslöja fastsättningen av stria terminalis eftersom den kommer att innehålla band av fibrer som löper längs sidokanten på thalamusens ventrikulära yta till AY och kommer att göra konturerna av AY tydliga.
HC och fornix kommer att vara tydligt synliga i sin helhet, kapslade i sidokammaren och kan lätt lyftas ut. Den laterala ventrikeln kommer att fodras med pia mater och fläktliknande ursprung av perforantvägen genom den mycket transparenta subpiala aspekten av ERC kommer att vara synlig20. - Den yttre ytan av medial ERC kommer att ha ett synligt framträdande lager av stora pyramidala celler. Dessutom kommer en tät konvergens av Golgi-färgningsfibrer att vara en framträdande egenskap i den mediala ERC. I denna dissektionsprocedur, efter att ha everting den laterala ventrikeln, kommer dessa fibrer att vara lätt synliga på den mediala ytan genom pia mater, som leder ventriklarnas inre ytor och bildar en mycket framträdande fläktliknande struktur.
- Lägg märke till att fibrerna samlas subpially, faller ner och lämnar ventral ERC, sträcker sig bakåt och sedan stiger vertikalt för att perforera HC. Denna fläktliknande struktur i ERC kommer att användas för att definiera marginalerna för dissektion. Identifiera och ta bort i ordningen AY-, ERC-, CNG- och HC-strukturer.
OBS: Att definiera ett bra landmärke för AY-dissektion kommer att vara en nyckel för nästa steg och korsningen på bakre marginalen där stria terminalis möter AY kommer att vara en bra punkt. - Vid denna tidpunkt innefattar de återstående strukturerna thalamus och MB. Bekräfta identifieringen av thalamus genom visualisering av stria medullaris på dess dorsala yta som sträcker sig i mittlinjen rostrocaudalplanet. Separera thalamus helt från mellanhjärnan med en koronal skuren caudal till habenula och rostral till överlägsen colliculi. ROC sparas i det här steget.
- Vid denna tidpunkt fullständig insamling av alla hjärnregioner och omedelbart (som var och en erhålls) lagra proverna blinka frysta tills vidare bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår förståelse av hjärnans komplexa struktur och funktion utvecklas och förbättras snabbt. Hjärnan innehåller flera distinkta regioner och att bygga en molekylär karta kan hjälpa oss att bättre förstå hur hjärnan fungerar. I detta metoddokument har vi diskuterat dissektion av mushjärnan i flera distinkta regioner (tabell 1). I detta protokoll identifieras strukturerna baserat på de kritiska landmärkena och uppnås genom att hålla vävnaden fuktig med saltlösning genom att behålla dess robusthet för omedelbar dissektion. Metoden täcker fler regioner än andra rapporter21 och kompletterar dissektionsmetoder med frysta hjärnor22,23. Dessa dissekerade vävnader kan bevaras och bearbetas senare beroende på studiens krav. Metoden som diskuteras här är omedelbar borttagning av hjärnan från skallen följt av dissektion som ger tillräckligt med vävnad på ett snabbt sätt för nedströms analyser med tanke på mushjärnans storlek. Vårt team har extraherat RNA från flera dissekerade vävnader och analyserat för genuttrycksprofilering med hjälp av mikroarrayer för hjärnvävnader; AY, HC, MPFC, septal region, corpus striatum och VS och resultaten har publicerats15. Dessa skördade hjärnor lagrades vid -80 ° C i flera månader före RNA-extraktion. Denna metod kan antas i kombination med andra metoder för att diversifiera nedströms nyttan av hjärnregioner. Denna dissektionsmetod är inriktad på att följa landmärken bland anatomiskt distinkta angränsande regioner istället för att vara strikt koronala eller sagittala dissektioner. De distinkta hjärnregionerna tillsammans med viktdata samlades in under studien aggressorexponerad social stressmodell av PTSD16 och RNA-koncentrationer tillsammans med spektrofotometriska avläsningar visas som figur 5.
Figur 1: Representation av mushjärna med distinkta vävnadstyper som samlats in. Den här siffran är en kosmetisk representation av strukturerna och skalas inte till någon mappad databas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Hjärnborttagning från kranialhålan följt av hypofysborttagning. Stegvis procedur för borttagning av hjärnan (i) fastspänning och hållning efter hårborttagning (ii) säkring av klämman med en Kimwipe för att hålla håret borta från vävnaden (iii) innan musklerna tas bort (iv) efter avlägsnande av muskler (v) separation av méninges (vi) avlägsnande av jordklot / öga (vii) snitt på orbital ås (viii) avlägsnande av parietal och frontben (ix) hjärndisplay och borttagning (x) hjärnavskiljning (xi) hypofysvy (xii) hypofysborttagning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Installationsstation för dissektion. Denna bild visar upplägget för hjärndissektion efter hjärnan och hypofysen vävnader avlägsna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Hjärndissektion. Stegvis förfarande för borttagning av hjärnan (i) ovanifrån av hjärnan (ii) dorsalvy av hjärnan (iii) borttagning av lillhjärnan (iv) cerebral separation (v) halvklotsdissektion (vi) borttagning av luktbulber (vii) MPFC, FCX och tillbehör luktdissektion (viii) SE, VS och ST dissektion (ix) PFM-borttagning (x) Limbisk systemdissektion Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Data som genereras efter provinsamling (A) Hjärnvävnadsvikt och (B) RNA-koncentration och (C) OD 260/280 från var och en av hjärnvävnaden visas. Här samlas data in från kontrollgrupper (n= 3-6) från en studiegrupp som tidigare rapporterats15,16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| # | Förkortningar | Beskrivning av hjärnregionen |
| 1 | Cb | Cerebellum |
| 2 | Hb | Hjärnstam/bakhjärna (pons och medulla oblongata) |
| Separera i de två halvklotet | ||
| 3 | Ob | Luktlökar och tillbehör luktlampor |
| 4 | Mpfc | Medial prefrontal cortex |
| 5 | FCX | Lateral prefrontal cortex |
| 6 | SE | Septum eller septal region |
| 7 | Vs | Ventral striatum inkluderar kärnan accumbens (NAC) och olfaktorisk tuberkel (OT) |
| 8 | Sankt | Främre och bakre corpus striatum |
| 9 | HY | Hypotalamus |
| 10 | PFM | Piriform cortex |
| 11 | Hc | Hippocampus |
| 12 | Erc | Entorhinal cortex |
| 13 | CNG | Bakre cingulate cortex |
| 14 | Ay | Amygdala |
| 15 | MB | Midbrain med thalamus |
| 16 | Roc | Resten av hjärnbarken |
Tabell 1: Beskrivning av distinkta regioner från mushjärnan. Denna tabell innehåller en lista över alla hjärnregioner som samlats in med förkortningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Däggdjurshjärnan är ett komplext organ som består av en rad morfologiskt distinkta och funktionellt unika celler med olika molekylära signaturer och flera regioner som utför specialiserade och diskreta funktioner. Dissektionsproceduren som rapporteras här kan ha flera mål beroende på labbets krav. I vårt laboratorium bedömde vi transkription i flera hjärnregioner som samlats in från möss som utsatts för PTSD som stress16 . Vi vill studera vidare effekterna av stamgenetisk bakgrund24 på uttrycksnivåer i flera hjärnregioner. Detta protokoll har flera kritiska steg som måste övervägas för framgångsrik reproducerbarhet av experimenten. Var och en av de lokaliserade regionerna i hjärnan spelar en distinkt roll i neuropatologiskt tillstånd och detaljerad kunskap om lämplig hjärnregion att studera saknas. Därför är det viktigt att generera datasetet som rör hjärnregionen. Således kan data inte bara frågas genom att välja hjärnregion utan också efter datakategori (t.ex. transkriptom, protein, cell (cytoarkitektur) eller annat) vilket leder till mer exakt information. Tidigare har vävnader som luktlampa, frontal cortex, striatum och hippocampus i färska råtthjärnvävnader visat sig dissekeras med hjälp av ett mikroskop25. Alternativt kan sektioner dissekeras medan hjärnan fryses14 följt av RNA- och proteinextraktioner men denna metod är begränsad till hjärnregioner som kan identifieras av tydliga landmärken. Totala RNA-extraktioner har genomförts efter mikrodissektion25 från större hjärnregioner samt med hjälp av icke-laserfångningsmikroskopimetod för genuttrycksstudier13. Här fokuserar vi på dissektion av färsk mushjärna för att skilja ut de specifika hjärnstrukturerna som har dedikerad kontroll över fysiologiska och beteendemässiga funktioner. Vår metod förklarar dissekeringen av fler regioner än redan publicerade rapporter, men den kompletterar andra dissektionsmetoder som finns tillgängliga. Detta tillvägagångssätt kan bidra till att ge en omfattande bedömning av vävnaderna och dess samband med försvagande tillstånd. Denna dissektionsstrategi ger ett genomförbart alternativ till befintliga provinsamlingsstrategier som öppnar möjligheter för nya upptäckter.
Med den metod som beskrivs häri fryses hjärnvävnaderna i flytande kväve innan de överförs till -80 °C för långvarig lagring. Det är viktigt att verktygen och vävnaderna hålls kalla under hela proceduren för konservering av nukleinsyror eller proteiner. Dessa frysta vävnader homogeniseras senare med hjälp av laboratoriestandardprocedurer. Några av dessa hjärnvävnader är mycket små och försiktighet bör iakttas under homogeniserings- och extraktionsprocessen som skyddar målmolekyler från nedbrytning vid högre temperaturer.
I denna process är det viktigt att identifiera tydliga landmärken för att hitta de specifika vävnadsregionerna. Detta uppnås genom att hålla vävnaden fuktig med saltlösning för att förhindra att den snabbt blir mjuk och behåller sin robusthet ett tag. Våra tidigare studier jämförde genuttrycksförändringar mellan kontroll och aggressorexponerade musvävnader15 och studerade inte några förändringar orsakade på grund av saltlösningen som användes under dissektion. Enligt vår erfarenhet är detta särskilt viktigt under snittet med början från hypotalamus och 180 ° vändning eftersom det exponerar och gör den regionala separationsskuggningen av de limbiska regionerna (AY, HC, ERC) uppenbar och tydligare. Det limbiska systemet ligger djupt inne i hjärnan och skadas av en mängd olika stimuli, och är därför viktigt diagnostiskt och terapeutiskt. Det limbiska systemet består av hjärnregioner men det finns ingen universell överenskommelse om denna lista26. Även om det inte studeras tror vi att det finns minimala eller inga effekter av saltlösning. Detta beror på att hela proceduren varar cirka 20 minuter efter kalla förhållanden under hela processen.
Regioner inom hjärnvävnad identifieras med hjälp av landmärken som nämns i hjärnatlaser. Med hjälp av denna teknik måste landmärkena vara tydliga och denna procedur bör göras i följd. Dissektion måste göras medan hjärnan fortfarande är fräsch och robust; (måste göras med de första 15 till 20 minuterna) - annars kommer landmärkena inte att vara tydliga och regionerna kommer inte att vara distinkta om hjärnan stannar längre tid och blev mjukare.
Som beskrivits ovan är i hjärnan delregioner, som innehåller flera funktionella områden som verkar oberoende eller i samordning med inneboende anslutningsnät. Det är viktigt att hämta dessa regioner med stor precision för att studera dess breda dimensioner. Detta kommer att bidra till att integrera dessa begrepp genom att kombinera de specialiserade regionerna där var och en tjänar en distinkt process med en terapeutisk potential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler och Pamela Spellman för experimentell hjälp och Dana Youssef för redigering av manuskriptet. Finansieringsstödet från USAMRDC erkänns tacksamt. Genèvestiftelsen bidrog till detta arbete och stöddes av medel från direktoratet för militär- och operativ medicinforskning (Military and Operational Medicine Research Area Directorate III) via US Army Research Office.
Friskrivning:
Materialet har granskats av Walter Reed Army Institute of Research. Det finns inga invändningar mot dess presentation och / eller publicering. De åsikter eller påståenden som finns häri är författarens privata åsikter och ska inte tolkas som officiella eller som återspeglar sanna åsikter från armédepartementet eller försvarsdepartementet. Forskning utfördes under ett godkänt protokoll för djuranvändning i en AAALAC-ackrediterad anläggning i enlighet med djurskyddslagen och andra federala lagar och förordningar som rör djur och experiment med djur och följer principerna som anges i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC Publication, 2011-upplagan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
