Summary
Vi presenterer en praktisk, trinnvis, rask protokoll for fjerning av musehjerne og disseksjon av diskrete regioner fra friskt hjernevev. Innhenting av hjernegrupper for molekylær analyse har blitt rutine i mange nevrovitenskapslaboratorier. Disse hjernegruppene fryses umiddelbart for å oppnå transkriptomiske data av høy kvalitet for analyse på systemnivå.
Abstract
Hjernen er kommandosenteret for pattedyrs nervesystem og et organ med enorm strukturell kompleksitet. Beskyttet i skallen, består hjernen av et ytre dekke av grå substans over halvkule kjent som hjernebarken. Under dette laget ligger mange andre spesialiserte strukturer som er essensielle for flere fenomener som er viktige for eksistensen. Å skaffe prøver av spesifikke brutto hjernegrupper krever raske og presise disseksjonstrinn. Det er forstått at på mikroskopisk nivå eksisterer mange underregioner og sannsynligvis krysser de vilkårlige regionale grensene som vi pålegger med henblikk på denne disseksjonen.
Musemodeller brukes rutinemessig til å studere menneskelige hjernefunksjoner og sykdommer. Endringer i genuttrykksmønstre kan være begrenset til bestemte hjerneområder rettet mot en bestemt fenotype, avhengig av den syke tilstanden. Det er derfor av stor betydning å studere regulering av transkripsjon med hensyn til dens veldefinerte strukturelle organisasjon. En fullstendig forståelse av hjernen krever å studere forskjellige hjernegrupper, definere forbindelser og identifisere viktige forskjeller i aktivitetene til hver av disse hjernegruppene. En mer omfattende forståelse av hver av disse forskjellige regionene kan bane vei for nye og forbedrede behandlinger innen nevrovitenskap. Her diskuterer vi en trinnvis metodikk for å dissekere musehjernen i seksten forskjellige regioner. I denne prosedyren har vi fokusert på mannlig mus C57Bl / 6J (6-8 uker gammel) hjernefjerning og disseksjon i flere regioner ved hjelp av nevroanatomiske landemerker for å identifisere og prøve diskret funksjonelt relevante og atferdsmessig relevante hjernegrupper. Dette arbeidet vil bidra til å legge et sterkt fundament innen nevrovitenskap, noe som fører til mer fokuserte tilnærminger i dypere forståelse av hjernefunksjonen.
Introduction
Hjernen, sammen med ryggmargen og netthinnen, utgjør sentralnervesystemet som utfører kompleks atferd, kontrollert av spesialiserte, nøyaktig plasserte og samvirkende celletyper gjennom hele kroppen1. Hjernen er et komplekst organ med milliarder av sammenkoblede nevroner og glia med presise kretser som utfører mange funksjoner. Det er en bilateral struktur med to forskjellige lober og forskjellige cellulære komponenter2. Ryggmargen forbinder hjernen med omverdenen og er beskyttet av bein, hjernehinner og cerebrospinalvæske og ruter meldinger til og fra hjernen 2,3,4. Overflaten av hjernen, hjernebarken, er ujevn og har forskjellige folder, kalt gyri, og spor, kalt sulci, som skiller hjernen i funksjonelle sentre5. Cortex er glatt hos pattedyr med en liten hjerne 6,7. Det er viktig å karakterisere og studere arkitekturen til den menneskelige hjerne for å forstå lidelsene knyttet til de forskjellige hjernegruppene, samt dens funksjonelle kretser. Nevrovitenskapsforskning har utvidet seg de siste årene, og en rekke eksperimentelle metoder brukes til å studere hjernens struktur og funksjon. Utviklingen innen molekylær- og systemnivåbiologi har innledet en ny epoke med å utforske det komplekse forholdet mellom hjernestrukturer og molekylers funksjon. I tillegg vokser molekylærbiologi, genetikk og epigenetikk raskt, slik at vi kan fremme vår kunnskap om de underliggende mekanismene som er involvert i hvordan systemer fungerer. Disse analysene kan utføres på en mye mer lokalisert basis, for å bidra til å målrette undersøkelsen og utviklingen av mer effektive terapier.
Pattedyrhjernen er strukturelt definert i klart identifiserbare diskrete regioner; Imidlertid er de funksjonelle og molekylære kompleksitetene til disse diskrete strukturer ennå ikke klart forstått. Den flerdimensjonale og flerlags naturen til hjernevevet gjør dette landskapet vanskelig å studere på funksjonsnivå. I tillegg kompliserer det faktum at flere funksjoner utføres av samme struktur og omvendt ytterligere forståelsen av hjernen8. Det er viktig at den eksperimentelle tilnærmingen som utføres for strukturell og funksjonell karakterisering av hjernegrupper, bruker presise forskningsmetoder for å oppnå konsistens i prøvetaking for å korrelere nevroanatomisk arkitektur med funksjon. Kompleksiteten i hjernen har nylig blitt forklart ved hjelp av enkeltcellesekvensering 9,10 som den tidlige gyrus av den menneskelige hjerne som består av 75 forskjellige celletyper 11. Ved å sammenligne disse dataene med de fra en analog region i musehjernen, avslører studien ikke bare likheter i deres arkitektur og celletyper, men presenterer også forskjellene. For å avdekke de komplekse mekanismene er det derfor viktig å studere ulike områder av hjernen med full presisjon. Konserverte strukturer og funksjon mellom en menneske- og musehjerne muliggjør bruk av en mus som et foreløpig surrogat for å belyse menneskelig hjernefunksjon og atferdsutfall.
Med utviklingen av systembiologi tilnærminger, skaffe informasjon fra diskrete hjernegrupper i gnagere har blitt en sentral prosedyre i nevrovitenskap forskning. Mens noen protokoller som laserfangst mikrodisseksjon12 kan være dyre, er mekaniske protokoller billige og utføres ved hjelp av allment tilgjengelige verktøy13,14. Vi har brukt flere hjernegrupper for transkriptomiske analyser15 og har utviklet en praktisk og rask prosedyre for å dissekere musehjernegrupper av interesse på en trinnvis måte på kort tid. Når dissekert, kan disse prøvene lagres umiddelbart under kalde forhold for å bevare nukleinsyrene og proteinene i disse vevene. Vår tilnærming kan utføres raskere, noe som fører til høy effektivitet og tillater mindre sjanser for vevsforringelse. Dette øker til slutt sjansene for å generere reproduserbare eksperimenter av høy kvalitet ved bruk av hjernevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrehåndtering og eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med europeiske, nasjonale og institusjonelle retningslinjer for dyrepleie. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved US Army Center for Environmental Health Research, nå Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) og utført i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
MERK: Prosedyren vil bli utført på seks til åtte uker gamle hannmus av C57BL/6j-stammen avlivet ved cervikal dislokasjon16. Ingen perfusjoner utføres i vårt laboratorium, men denne protokollen kan endres slik at perfusjoner for å fjerne blod fra vaskulaturen kan utføres. Alle forsyninger som kreves for disseksjonen er oppført i materialtabellen. Disseksjonen er delt inn i tre komponenter, inkludert fjerning av hjernen, fjerning av hypofysen og hjernens disseksjon. Hensikten med hjernevevsinnsamling er å behandle dem for transkriptomiske analyser etter RNA-ekstraksjoner. Så snart hjerneområdet er dissekert, overfører vi umiddelbart hver av hjernegruppene til et allerede merket fryseflaske og lagrer deretter hetteglasset i flytende nitrogen eller -80 ° C.
MERK: Grundig kunnskap om nevroanatomi er viktig for å utføre denne prosedyren. Horisontale og langsgående seksjoner, samt de vanlige tverrseksjonene, bør studeres og læres. Siden hjernevev nedbrytes veldig raskt, er det ikke tid til å konsultere et atlas mens du utfører denne prosedyren.
1. Fjerning av musehjerne
- Klem maxillaen til det halshuggede hodet med en hemostat (figur 2i) og bruk en gasbind for å reflektere hodebunnen rostralt videre og skape et tørt felt på dorsum av skallen (figur 2ii).
- Sett den fine buede saksen inn i foramen magnum for å skille de vedheftende meningene. Her setter du saksen ved åpningen på bunnen av skallen er foramen magnum, hvor ryggmargen passerer med bladet pekende vertikalt (klokken 12), men parallelt med og presser mot den indre overflaten av basalplatebenet (dvs. occipital squama) og roterer bladet førtifem ° til venstre side og deretter til høyre side.
- Fortsett å rotere håndleddet for å lirke av basalplatebenet som vil klippe opp midten av det gjenværende beinet som fortsetter inn i oksipitalt bein og intraparietale bein som lirker beinene til venstre og høyre til de fjernes. På lignende måte, fjern occipital bein og intraparietal bein for å eksponere cerebellum.
MERK: På dette tidspunktet kan den hule benete strukturen kalt tympanisk bullae, på den ventrale bakre delen av skallen som omslutter deler av mellom- og indre øret, fjernes med mindre man dissekerer de bakre og fremre lobene av hypofyser (figur 2iii). - Fjern muskelfestene til den tidlige ryggen ved hjelp av et buet skarpt sakseblad. Plasser en lem av den buede skarpe saksen under lambdoid suturen som trer inn i krysset mellom tverrgående og sagittale bihuler (figur 2iv).
- Løft saksen rostralt langs midsagittal suturen opp til bregma og klipp den veldig forsiktig mens du forsiktig løfter oppover for å unngå laceration av cerebrale cortices. Dette er et kritisk trinn i prosedyren (figur 2v).
- På dette trinnet løftes og roteres parietalben og skraper dermed den indre overflaten av beinet for å identifisere og kutte gjenværende meningealfeste. Ta tak i det temporale beinet som lirker utover, vekk fra hjernen. Fjern frontbeinet fra hver side ved hjelp av buet saks eller en rongeur inn i banen og skjær koronalt i rett vinkel mot baneryggen, men ikke lenger enn midtlinjen (figur 2vii).
- Lag to kutt parallelt og ca. 4 mm fra hverandre i sagittalplanet (figur 2viii).
MERK: Ikke klipp begge sider med ett enkelt strøk. - Fjern fragmentene av frontbenet og unngå å såre hjerneoverflaten (figur 2ix). På dette tidspunktet, bruk en fin saks for å kutte dura mater, som skal være tilgjengelig mellom olfaktoriske pærer.
- Inverter skallen forsiktig for å tillate tyngdekraften å hjelpe til med fjerning av hjernen, mens du fortsetter å identifisere og kutte gjenværende meningeale vedlegg og kranialnerver. Hjernen frigjøres ved å kutte den største trigeminusnerven som er festet til hjernen og er tydelig synlig som strekker seg fra bunnen av calvarium (figur 2x).
MERK: Overfør hjernen til en kald saltoppløsning (iskald RNase-fri natriumcitrat (0,9%) eller fysiologisk (0,9%) saltvann) for ytterligere disseksjon.
2. Disseksjon av fremre og bakre hypofyser
MERK: Hypofysen er dekket av en veldig tøff teltlignende membran, med en ås som går lateralt mellom venstre og høyre trigeminusnerver. Disse strukturene er ekstremt myke og delikate, og som sådan anbefales det at de bakre og fremre lobene av hypofysen blir dissekert separat i etapper, in situ, direkte fra skallen. Umiddelbart etter disseksjon, overfør den respektive hypofysen til et forhåndsmerket hetteglass og oppbevar hetteglasset i flytende nitrogen, fortrinnsvis ellers -80 °C. Hypofysen hviler nøyaktig over krysset mellom occipital og basisphenoid bein; Hvis de bøyer seg, forstyrres hypofysearkitekturen.
- Hold den auditive bullae intakt for å sikre at hypofysen anatomi er intakt og lett identifiserbar (figur 2ix).
- Disseker hypofysens bakre lobe etterfulgt av hypofysens fremre lobe, fra resten av skallen.
- Lag et ekstremt lite parasagittalt kutt på begge sider i ryggen av det membranøse teltet og løft hypofysens bakre lobe med ultrafine tang, pass på at du ikke forstyrrer det fremre hypofysevevet (figur 2x).
- Lag et sagittalsnitt mellom sidekantene av hypofysens fremre lobe og nærmeste trigeminusnerve og løft deretter ut hypofysens fremre lobe (figur 2x).
3. Mus Brain Disseksjon
MERK: Umiddelbart etter fjerning av hjerne og hypofyse utføres ytterligere disseksjon på en forkjølt rustfritt stålblokk (figur 3). Etter disseksjon, overfør hjerneområdene til forhåndsmerkede hetteglass og overfør hetteglassene fortrinnsvis til flytende nitrogen ellers -80 °C. Strukturer produsert av top-down-metoden (i kronologisk rekkefølge) inkluderer potensielt følgende: cerebellum (CB), hjernestamme / bakhjerne (pons og medulla oblongata) (HB), olfaktoriske pærer (OB) som tilbehør olfaktoriske pærer, medial prefrontal cortex (MPFC), lateral prefrontal cortex (FCX), anterior og posterior corpus striatum (ST), ventral striatum (VS) bestående av nucleus accumbens (NAC) og olfaktorisk tuberkel (OT), septum (SE), preoptisk område, piriform cortex (PFM), hypothalamus (HY), amygdala (AY), hippocampus (HC), posterior cingulate cortex (CNG), entorhinal cortex (ERC), midbrain (MB) med thalamus og resten av hjernebarken (ROC) (tabell 1). Spesifikke regioner vil bli diskutert i isolasjonsrekkefølge, og arbeider med en enkelt halvkule.
- Vær forsiktig med å fjerne hjernen fra calvariumet, da landemerkene kan bli ødelagt i tilfelle det er noen lacerations. På dette trinnet utfører du alle disseksjoner ved hjelp av ansiktsbeskyttelse, spesielt et 7x gullsmedvisir, og belysning vil bli gitt av kirurgiske lamper plassert over hver av dissectorens skuldre. Mye av disseksjonen vil bli oppnådd ved hjelp av stump modus små buede tang (dvs. Graefe tang).
- Plasser hjernen på en blokk i rustfritt stål (figur 4i og figur 4ii). Hold blokken kald ved å omgi den med is og en iskald saltløsning. Fukt vevet regelmessig med iskald saltoppløsning for å bevare strukturene.
- Plasser hjernen slik at hjernecortices vender oppover. Bruk små buede tang, reflekter CB forsiktig ved å eksponere de overordnede, midtre og nedre cerebellære peduncles og fjern CB (figur 4iii og figur 4iv).
- Lag et midsagittalsnitt fra dorsum og mellom OB og hjernehalvdelene (figur 4v) og pass på at du ikke strekker deg lenger enn den fremre kommisjonen. På dette tidspunktet kan vermis lett skilles fra sidedelene, og HB vil bli oppnådd ved et koronalt kutt ved den fremre marginen av ponsene.
- Skill medullaen med et koronalt kutt i bakre marg på ponsene.
MERK: På dette tidspunktet vil diencephalon, den bakre delen av forhjernen som inneholder epithalamus, thalamus, hypothalamus og ventral thalamus og den tredje ventrikkelen, bli vendt ventral side opp, og et midsagittal kutt vil bli gjort fra optisk chiasm rostralt. Disseksjon av hjernehalvdeler etterfulgt av fjerning av OB fra en av hemisfærene vil være på dette trinnet (figur 4v og figur 4vi). - Skill hjernehalvdelene (figur 4v) før diencephalon dissekeres videre (figur 4v). Den dorsale tilnærmingen vil bli brukt av forsiktig stump disseksjon for å bevare de kritisk fremtredende landemerkene i midtlinjen. Visualiser hver interhemisfærisk forbindelse før du kutter dem, da dette vil minimere muligheten for å avvike fra midtlinjen.
MERK: På dette trinnet kan en av hjernehalvdelene (Hemibrain) bevares og den andre halvkule kan brukes til ytterligere disseksjon - Slip de lukkede bladene på en liten, buet tang, under corpus callosum og spre forsiktig for å trekke neocortex bilateralt. Corpus callosum er et bredt bånd av nervefibre som forbinder de to halvkule som vil bli sløvt dissekert ved å klemme med tangen, uten å forstyrre midtlinjestrukturene som ligger under.
MERK: Mesiale ansikter på halvkulene vil ha flere landemerker synlige, for eksempel myeliniserte strukturer som genu av corpus callosum, fornices og fremre commissure. Også, selv om noen få millimeter lateral til midtlinjen, kan mammillothalamic kanalen og fasciculus retroflexus også være synlig. - Kryss de mange strukturene som krysser midtlinjen. Dette vil omfatte corpus callosum, fremre kommissær, ventral fornix commissure, posterior commissure, dorsal fornix commissure, supra mammillary decussation, superior colliculus commissure, ventral fornix commissure, og periventricular thalamic fibre.
- Vær spesielt forsiktig på dette trinnet i eller nær midtlinjen som kan bli delvis kompromittert av dorsal tilnærmingsmetode. Alle oppfølgingsstrukturer er i fare hvis de ikke utføres nøye.
- Fjern OB (kileformet og lysere farge) og tilbehør olfaktoriske pærer etterfulgt av innsamling av MPFC (cingulate cortex område 1, prelimbic, infralimbic, medial orbital og sekundær motor cortices [M2]) og FCX med et koronalt kutt som er laget 1mm fremre til genu av corpus callosum (figur 4vii). Del den resulterende delen med et parasagittal kutt 1/3 av avstanden fra medial til lateral overflate, noe som gir MPFC medialt og resten av FCX lateralt. Cingulate cortex er museanalogen til MPFC.
MERK: Denne vevskiven vil også inneholde en liten mengde av M2 (sekundær motor cortex) 17 og er uunngåelig. - Lag et koronalt kutt på nivået av den fremre kommissuren som fører til synlighet av pars fremre lem av den fremre kommissuren i tverrsnittet på rostralflaten til den resulterende koronale delen, mens den tverrgående delen vil bli avslørt i det kaudale ansiktet av seksjonen Dette er et bekreftende landemerke for NAC18. VS består av NAC og OT.
MERK: Det er en fremre lem i tillegg til det tverrgående segmentet i den fremre kommisjonen, og den kalles fremre kommissur, pars anterior. - Delvis kuttet horisontalt gjennom den tverrgående delen av den fremre kommissuren fra midtlinjen under det fremre hornet i lateral ventrikel, for å frigjøre septalkjernen dorsalt og VS ventralt. Fjern den lille mengden cortex fra sideflaten der NAC og OT vil bli fjernet.
- Skill rostraldelen av ST fra den overliggende cortex via buet skalpell kuttet like utenfor den eksterne kapselen, og pass på at striatal vev ikke inkluderes i kortikalprøven. På dette tidspunktet vil septalkjernene / SE være synlige og kan lett tas fra denne skiven (figur 4viii).
MERK: De fremre og bakre grensene for PFM er definert av imaginære koronale plan som er i tråd med henholdsvis fremre kommisjon og mammillære legemer. Medialgrensen er definert av den eksterne kapselen18. - På den laterale overflaten av den gjenværende hemi-delen av diencephalon, gjør en delvis horisontal kutt langs rhinal sulcus som strekker seg kaudalt, men bare så langt som det imaginære koronale plannivået med de mammillære legemene. Lag et delvis koronalt kutt, som strekker seg medialt 1 mm fra den laterale kortikale overflaten i planet til de mammillære legemene til HY. Her vil para-sagittal snitt i claustrum-planet frigjøre PFM (figur 4ix og figur 4x).
MERK: På den mediale overflaten av den gjenværende hemi-delen av diencephalon, vil mange anatomiske trekk være synlige, inkludert mammillære legemer, fasciculus retroflexus og stria medullaris. Et halvcirkelformet mønster (dorsal konkav side) vil være synlig, som angir marginen mellom thalamus og HY. HY vil lett bli identifisert på midsagittal seksjonsvisning per optisk chiasm anteroventralt og fremre commissure anterodorsally og mammillary kroppene sammen med fasciculus retroflexus posteriorly. De sistnevnte landemerkene har blitt godt vist i atlas17 så vel som i albino mus forebrain kontekst19. - Lag et delvis koronalt kutt bakre til de mammillære legemene, som bare strekker seg så langt lateralt som hypothalamus sulcus. På dette punktet frigjør en parasagittal kutt langs lengden av hypothalamus sulcus nå HY .
- Medfører eversjon av lateral ventrikel for å avsløre ytterligere intra-limbiske forbindelser og de resterende limbiske systemkomponentene. Når man ser på det mediale ansiktet til den gjenværende hemi-delen av diencephalon, vil buede tang være det beste alternativet, da de tillater teknikeren å manipulere rundt andre delikate deler av det omkringliggende området som brukes til å kutte fornix og settes inn i lateral ventrikel og forsiktig utvides, ved hjelp av stump disseksjon for å åpne ventrikkelen og rotere HC 90° fra vertikal til horisontalplan. Det kan være nødvendig å bruke #11-bladet til å seksjonere arteria choroidalis / choroid plexus, da den spisse spissen kan hjelpe med presise kutt.
- Roter CNG 90 ° (men i motsatt retning fra HC) for å være i horisontalplanet. Bruk tang til å rotere HC-en forsiktig ytterligere 180° utover og lateralt, noe som vil gjøre den indre overflaten av ERC synlig og vendt oppover.
- En viftelignende stråling av myeliniserte fibre som oppstår fra ERC vil bli sett konvergerende for å danne vinkelbunten, inkludert perforantbanen og dens vedlegg til HCen. Roter thalamus og MB 180 ° dorsalt for å avsløre AYen ventralt.
- Løft om nødvendig den optiske kanalen for å avsløre festingen av stria terminalis, da den vil inneholde bånd av fibre som løper langs sidekanten av den ventrikulære overflaten av thalamus til AY og vil gjøre konturene av AY klare.
MERK: HC og fornix vil være godt synlig i sin helhet, nestet i lateral ventrikkel og kan lett løftes ut. Den laterale ventrikkelen vil være foret med pia mater og viftelignende opprinnelse til perforantbanen gjennom det meget gjennomsiktige subpiale aspektet av ERC vil være synlig20. - Den ytre overflaten av mediale ERC vil ha et synlig fremtredende lag av store pyramidale celler. I tillegg vil en tett konvergens av Golgi-fargefibre være en fremtredende funksjon i den mediale ERCen. I denne disseksjonsprosedyren, etter everting av lateral ventrikel, vil disse fibrene være lett synlige på medialoverflaten gjennom pia mater, som strekker de indre overflatene av ventriklene, og danner en meget fremtredende viftelignende struktur.
- Legg merke til at fibrene samler seg subpialt, synker og forlater den ventrale ERCen, strekker seg bakre og deretter stiger vertikalt for å perforere HCen. Denne viftelignende strukturen i ERC vil bli brukt til å definere marginene med henblikk på disseksjon. Identifiser og fjern i rekkefølgen av AY-, ERC-, CNG - og HC-strukturer .
MERK: Å definere et godt landemerke for AY-disseksjon vil være en nøkkel for neste trinn, og krysset på bakre margin der stria terminalis møter AY vil være et godt poeng. - På dette tidspunktet inkluderer de resterende strukturene thalamus og MB. Bekreft identifiseringen av thalamus ved visualisering av stria medullaris på sin dorsale overflate som strekker seg i midtlinjen rostrocaudal plan. Skill thalamus helt fra midthjernen med en koronal kutt caudal til habenula og rostral til superior colliculi. ROC lagres på dette trinnet.
- På dette tidspunktet fullstendig samling av alle hjernegrupper, og umiddelbart (som hver er oppnådd) lagre prøvene flash frosset til videre behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår forståelse av den komplekse hjernestrukturen og funksjonen utvikler seg raskt og forbedres. Hjernen inneholder flere forskjellige regioner, og å bygge et molekylært kart kan hjelpe oss med å bedre forstå hvordan hjernen fungerer. I denne metodeartikkelen har vi diskutert disseksjonen av musehjernen i flere distinkte regioner (tabell 1). I denne protokollen identifiseres strukturene basert på de kritiske landemerkene og oppnås ved å holde vevet fuktig med saltoppløsning ved å beholde stabiliteten for umiddelbar disseksjon. Metoden dekker flere regioner enn andre rapporter21 og er komplementær til disseksjonsmetoder ved bruk av frosne hjerner22,23. Disse dissekerte vevene kan bevares og behandles senere, avhengig av kravene i studien. Metoden som diskuteres her er umiddelbar fjerning av hjernen fra skallen etterfulgt av disseksjon som gir nok vev på en rask måte for nedstrøms analyser gitt størrelsen på musehjernen. Vårt team har ekstrahert RNA fra flere dissekerte vev og analysert for genuttrykksprofilering ved hjelp av mikroarrays for hjernevev; AY, HC, MPFC, septal region, corpus striatum og VS og resultatene er publisert15. Disse høstede hjernene ble lagret ved -80 °C i flere måneder før RNA-ekstraksjon. Denne metoden kan tas i bruk i kombinasjon med andre metoder for å diversifisere nedstrøms nytte av hjernegrupper. Denne disseksjonsmetoden er fokusert på å følge landemerker blant anatomisk distinkte tilstøtende regioner i stedet for å være strengt koronale eller sagittale disseksjoner. De forskjellige hjernegruppene sammen med vektdata ble samlet inn under studien aggressor eksponert sosial stressmodell av PTSD16 og RNA-konsentrasjoner sammen med spektrofotometriske avlesninger er vist som figur 5.
Figur 1: Representasjon av musehjerne med distinkte vevstyper samlet. Dette tallet er en kosmetisk representasjon av strukturene og er ikke skalert til noen kartlagt database. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Hjernefjerning fra kranialhulen etterfulgt av hypofysefjerning. Trinnvis prosedyre for fjerning av hjernen (i) klemming og holding etter hårfjerning (ii) sikring av klemmen med en Kimwipe for å holde håret borte fra vevet (iii) før fjerning av muskler (iv) etter fjerning av muskler (v) separasjon av méninges (vi) fjerning av globus / øye (vii) kuttet på orbital rygg (viii) fjerning av parietale og frontale bein (ix) hjernevisning og fjerning (x) hjerneløsning (xi) hypofysevisning (xii) hypofysefjerning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Disseksjonsoppsettstasjon. Dette bildet viser satt opp for hjernen disseksjon post-hjerne og hypofysen vev fjerning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Hjernedisseksjon. Trinnvis prosedyre for fjerning av hjernen (i) toppvisning av hjernen (ii) dorsal visning av hjernen (iii) fjerning av cerebellum (iv) cerebral separasjon (v) hemisfærer disseksjon (vi) olfaktorisk pære fjerning (vii) MPFC, FCX og tilbehør olfaktorisk disseksjon (viii) SE, VS og ST disseksjon (ix) PFM fjerning (x) Limbic system disseksjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Data generert etter prøvetaking (A) Hjernevevsvekt og (B) RNA-konsentrasjon og (C) OD 260/280 fra hvert av hjernevevet er vist. Her er dataene hentet fra kontrollgrupper (n = 3-6) fra en studiegruppe som rapportert tidligere15,16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| # | Forkortelser | Beskrivelse av hjernegruppe |
| 1 | Cb | Lillehjerne |
| 2 | Hb | Hjernestamme/bakhjerne (pons og medulla oblongata) |
| Separer i de to halvkule | ||
| 3 | Ob | Olfaktoriske pærer og tilbehør olfaktoriske pærer |
| 4 | MPFC | Medial prefrontal cortex |
| 5 | FCX | Lateral prefrontal cortex |
| 6 | SE | Septum eller septal region |
| 7 | Vs | Ventral striatum inkluderer nucleus accumbens (NAC) og olfaktorisk tuberkel (OT) |
| 8 | St | Anterior og posterior corpus striatum |
| 9 | Hy | Hypothalamus |
| 10 | PFM | Piriform cortex |
| 11 | Hc | Hippocampus |
| 12 | ERC | Entorhinal cortex |
| 13 | CNG | Posterior cingulate cortex |
| 14 | Ay | Amygdala |
| 15 | Mb | Midthjerne med thalamus |
| 16 | Roc | Resten av hjernebarken |
Tabell 1: Beskrivelse av distinkte regioner fra musehjernen. Denne tabellen inneholder liste over alle hjernegrupper samlet med forkortelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pattedyrhjernen er et komplekst organ som består av en rekke morfologisk distinkte og funksjonelt unike celler med ulike molekylære signaturer og flere regioner som utfører spesialiserte og diskrete funksjoner. Disseksjonsprosedyren som rapporteres her, kan ha flere mål, avhengig av kravene til laboratoriet. I vårt laboratorium vurderte vi transkripsjon i flere hjernegrupper samlet fra mus utsatt for PTSD som stress16 . Vi ønsker å studere videre virkningen av stammegenetisk bakgrunn24 på ekspresjonsnivåer i flere hjernegrupper. Denne protokollen har flere kritiske trinn som må vurderes for vellykket reproduserbarhet av forsøkene. Hver av de lokaliserte hjerneområdene spiller en distinkt rolle i nevropatologisk tilstand, og detaljert kunnskap om den aktuelle hjernegruppen for å studere mangler. Derfor er det viktig å generere datasettet knyttet til hjernegruppen. Dermed kan dataene ikke bare spørres ved å velge hjernegruppe, men også etter datakategori (f.eks. Transkriptom, protein, celle (cytoarkitektonisk) eller annet) som fører til mer presis informasjon. Tidligere har vev som olfaktorisk pære, frontal cortex, striatum og hippocampus i friskt rottehjernevev vist seg å bli dissekert ved hjelp av et mikroskop25. Alternativt kan seksjoner dissekeres mens hjernen er frosset14 etterfulgt av RNA og proteinekstraksjoner, men denne metoden er begrenset til hjernegrupper som kan identifiseres med klare landemerker. Totale RNA-ekstraksjoner har blitt utført etter mikrodisseksjon25 fra store hjernegrupper, samt ved bruk av ikke-laserfangstmikroskopitilnærming for genuttrykksstudier13. Her fokuserer vi på disseksjon av fersk musehjerne for å skille ut de spesifikke hjernestrukturene som har dedikert kontroll over fysiologiske og atferdsfunksjoner. Vår metode forklarer disseksjonen av flere regioner enn allerede publiserte rapporter, men den er komplementær til andre disseksjonsmetoder som er tilgjengelige. Denne tilnærmingen kan bidra til å gi en omfattende vurdering av vevet og dets tilknytning til svekkende forhold. Denne disseksjonsstrategien gir et levedyktig alternativ til eksisterende prøveinnsamlingsstrategier som åpner muligheter for nye funn.
Med metoden som er beskrevet her, fryses hjernevevet i flytende nitrogen før det overføres til -80 °C for langtidslagring. Det er viktig at verktøyene og vevene holdes kalde under hele prosedyren for bevaring av nukleinsyrer eller proteiner. Disse frosne vevene homogeniseres senere ved hjelp av laboratoriestandard operasjonsprosedyrer. Noen av disse hjernevevene er svært små, og det bør utvises forsiktighet under homogeniserings- og ekstraksjonsprosessen som beskytter målmolekyler mot nedbrytning ved høyere temperaturer.
I denne prosessen er det viktig å identifisere klare landemerker for å finne de spesifikke vevsområdene. Dette oppnås ved å holde vevet fuktig med saltoppløsning for å holde det fra å bli raskt mykt og beholde sin stabilitet for en stund. Våre tidligere studier sammenlignet genuttrykksendringer mellom kontroll- og aggressoreksponert musevev15 og studerte ikke noen endringer forårsaket på grunn av saltvannet som ble brukt under disseksjon. Etter vår erfaring er dette spesielt viktig under snittet som starter fra hypothalamus og 180 ° flipping som det eksponerer og gjør den regionale separasjonsskyggen av de limbiske regionene (AY, HC, ERC) åpenbar og tydeligere. Det limbiske systemet ligger dypt inne i hjernen og blir skadet av en rekke stimuli, og er derfor viktig diagnostisk og terapeutisk. Det limbiske systemet består av hjernegrupper, men det er ingen universell enighet på denne listen26. Selv om det ikke er studert, tror vi at det er minimal eller ingen effekter av saltvannsbruk. Dette skyldes at hele prosedyren varer i omtrent 20 minutter etter kalde forhold under hele prosessen.
Regioner i hjernevev identifiseres ved hjelp av landemerker nevnt i hjerneatlas. Ved hjelp av denne teknikken må landemerkene være klare, og denne prosedyren skal gjøres sekvensielt. Disseksjonen må gjøres mens hjernen fortsatt er frisk og solid; (må gjøres med de første 15 til 20 minuttene) - ellers vil landemerkene ikke være klare og regionene vil ikke være tydelige hvis hjernen forblir lenger og ble mykere.
Som beskrevet ovenfor er det i hjernen underregioner, som inneholder flere funksjonelle områder som virker uavhengig eller i koordinering med inneboende tilkoblingsnettverk. Det er viktig å hente disse regionene med stor presisjon for å studere de brede dimensjonene. Dette vil bidra til å integrere disse konseptene ved å kombinere de spesialiserte regionene der hver serverer en distinkt prosess med et terapeutisk potensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler og Pamela Spellman for eksperimentell assistanse og Dana Youssef for redigering av manuskriptet. Finansieringsstøtten fra USAMRDC er takknemlig anerkjent. Geneva Foundation bidro til dette arbeidet og ble støttet av midler fra Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via US Army Research Office.
Ansvarsfraskrivelse:
Materialet er gjennomgått av Walter Reed Army Institute of Research. Det er ingen innvendinger mot presentasjonen og / eller publiseringen. Meningene eller påstandene heri er forfatterens private synspunkter, og skal ikke tolkes som offisielle, eller som gjenspeiler sanne synspunkter fra Hærdepartementet eller Forsvarsdepartementet. Forskning ble utført under en godkjent dyrebruksprotokoll i et AAALAC-akkreditert anlegg i samsvar med dyrevelferdsloven og andre føderale vedtekter og forskrifter knyttet til dyr og eksperimenter som involverer dyr og overholder prinsippene som er angitt i Veiledning for omsorg og bruk av laboratoriedyr, NRC Publication, 2011-utgaven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
