Summary
Presentiamo un protocollo pratico, passo-passo, rapido per la rimozione del cervello del topo e la dissezione di regioni discrete dal tessuto cerebrale fresco. Ottenere regioni cerebrali per l'analisi molecolare è diventato routine in molti laboratori di neuroscienze. Queste regioni cerebrali vengono immediatamente congelate per ottenere dati trascrittomici di alta qualità per l'analisi a livello di sistema.
Abstract
Il cervello è il centro di comando per il sistema nervoso dei mammiferi e un organo con un'enorme complessità strutturale. Protetto all'interno del cranio, il cervello è costituito da un rivestimento esterno di materia grigia sopra gli emisferi noto come corteccia cerebrale. Sotto questo strato risiedono molte altre strutture specializzate che sono essenziali per molteplici fenomeni importanti per l'esistenza. L'acquisizione di campioni di specifiche regioni cerebrali lorde richiede passaggi di dissezione rapidi e precisi. Resta inteso che a livello microscopico, esistono molte sottoregioni e probabilmente attraversano i confini regionali arbitrari che imponiamo ai fini di questa dissezione.
I modelli murini sono abitualmente utilizzati per studiare le funzioni e le malattie del cervello umano. I cambiamenti nei modelli di espressione genica possono essere limitati a specifiche aree cerebrali mirate a un particolare fenotipo a seconda dello stato patologico. Pertanto, è di grande importanza studiare la regolazione della trascrizione rispetto alla sua organizzazione strutturale ben definita. Una comprensione completa del cervello richiede lo studio di regioni cerebrali distinte, la definizione di connessioni e l'identificazione delle differenze chiave nelle attività di ciascuna di queste regioni cerebrali. Una comprensione più completa di ciascuna di queste regioni distinte può aprire la strada a trattamenti nuovi e migliori nel campo delle neuroscienze. Qui, discutiamo una metodologia passo-passo per sezionare il cervello del topo in sedici regioni distinte. In questa procedura, ci siamo concentrati sulla rimozione cerebrale del topo maschio C57Bl / 6J (6-8 settimane) e sulla dissezione in più regioni utilizzando punti di riferimento neuroanatomici per identificare e campionare regioni cerebrali discrete funzionalmente rilevanti e comportamentali. Questo lavoro contribuirà a gettare solide basi nel campo delle neuroscienze, portando ad approcci più mirati nella comprensione più profonda della funzione cerebrale.
Introduction
Il cervello, insieme al midollo spinale e alla retina, comprende il sistema nervoso centrale che esegue comportamenti complessi, controllati da tipi di cellule specializzate, posizionate con precisione e interagenti in tutto il corpo1. Il cervello è un organo complesso con miliardi di neuroni interconnessi e glia con circuiti precisi che svolgono numerose funzioni. È una struttura bilaterale con due lobi distinti e diversi componenti cellulari2. Il midollo spinale collega il cervello al mondo esterno ed è protetto da ossa, meningi e liquido cerebrospinale e indirizza i messaggi da e verso il cervello 2,3,4. La superficie del cervello, la corteccia cerebrale, è irregolare e presenta pieghe distinte, chiamate gyri, e solchi, chiamati solchi, che separano il cervello in centri funzionali5. La corteccia è liscia nei mammiferi con un piccolo cervello 6,7. È importante caratterizzare e studiare l'architettura del cervello umano al fine di comprendere i disturbi legati alle diverse regioni del cervello, nonché i suoi circuiti funzionali. La ricerca neuroscientifica si è espansa negli ultimi anni e una varietà di metodi sperimentali vengono utilizzati per studiare la struttura e la funzione del cervello. Gli sviluppi nel campo della biologia molecolare e a livello di sistema hanno inaugurato una nuova era di esplorazione della complessa relazione tra le strutture cerebrali e il funzionamento delle molecole. Inoltre, la biologia molecolare, la genetica e l'epigenetica si stanno rapidamente espandendo, permettendoci di far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi sottostanti coinvolti nel funzionamento dei sistemi. Queste analisi possono essere effettuate su una base molto più localizzata, per aiutare a indirizzare la ricerca e lo sviluppo di terapie più efficaci.
Il cervello dei mammiferi è strutturalmente definito in regioni discrete chiaramente identificabili; Tuttavia, le complessità funzionali e molecolari di queste strutture discrete non sono ancora chiaramente comprese. La natura multidimensionale e multistrato del tessuto cerebrale rende questo paesaggio difficile da studiare a livello funzionale. Inoltre, il fatto che più funzioni siano eseguite dalla stessa struttura e viceversa complica ulteriormente la comprensione del cervello8. È fondamentale che l'approccio sperimentale eseguito per la caratterizzazione strutturale e funzionale delle regioni cerebrali utilizzi precise metodologie di ricerca per ottenere coerenza nel campionamento per correlare l'architettura neuroanatomica con la funzione. La complessità del cervello è stata recentemente spiegata utilizzando il sequenziamento a singola cellula 9,10 come il giro temporale del cervello umano che è composto da 75 tipi di cellule distinte 11. Confrontando questi dati con quelli provenienti da una regione analoga del cervello del topo, lo studio non solo rivela somiglianze nella loro architettura e nei tipi di cellule, ma presenta anche le differenze. Per svelare i complessi meccanismi, è quindi importante studiare diverse regioni del cervello con la massima precisione. Le strutture e le funzioni conservate tra un cervello umano e quello di topo consentono l'uso di un topo come surrogato preliminare per chiarire la funzione cerebrale umana e i risultati comportamentali.
Con il progresso degli approcci di biologia dei sistemi, ottenere informazioni da regioni cerebrali discrete nei roditori è diventata una procedura chiave nella ricerca neuroscientifica. Mentre alcuni protocolli come la microdissezione a cattura laser12 possono essere costosi, i protocolli meccanici sono economici ed eseguiti utilizzando strumenti comunemente disponibili13,14. Abbiamo utilizzato più regioni cerebrali per i saggi trascrittomici15 e abbiamo sviluppato una procedura pratica e rapida per sezionare le regioni cerebrali di topo di interesse in modo passo-passo in breve tempo. Una volta sezionati, questi campioni possono essere conservati immediatamente in condizioni fredde per preservare gli acidi nucleici e le proteine di questi tessuti. Il nostro approccio può essere eseguito più velocemente portando ad un'elevata efficienza e consentendo meno possibilità di deterioramento dei tessuti. Questo in definitiva, aumenta le possibilità di generare esperimenti di alta qualità e riproducibili utilizzando tessuti cerebrali.
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Protocol
La manipolazione degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida europee, nazionali e istituzionali per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Centro dell'esercito americano per la ricerca sulla salute ambientale ora Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) ed eseguiti in una struttura accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International (AAALAC).
NOTA: La procedura verrà eseguita su topi maschi di età compresa tra sei e otto settimane del ceppo C57BL / 6j eutanasia per lussazione cervicale16. Non vengono eseguite perfusioni nel nostro laboratorio, ma questo protocollo potrebbe essere modificato in modo da poter eseguire perfusioni per eliminare il sangue dal sistema vascolare. Tutte le forniture necessarie per la dissezione sono elencate nella tabella dei materiali. La dissezione è suddivisa in tre componenti, tra cui la rimozione del cervello, la rimozione della ghiandola pituitaria e la dissezione del cervello. L'intento della raccolta del tessuto cerebrale è quello di elaborarli per saggi trascrittomici dopo estrazioni di RNA. Non appena la regione del cervello viene sezionata, trasferiamo immediatamente ciascuna delle regioni cerebrali in una fiala di congelatore già etichettata e quindi conserviamo la fiala in azoto liquido o -80 ° C.
NOTA: Una conoscenza approfondita della neuroanatomia è essenziale per eseguire questa procedura. Le sezioni orizzontali e longitudinali, così come le solite sezioni trasversali, dovrebbero essere studiate e apprese. Poiché il tessuto cerebrale si degrada molto rapidamente, non c'è tempo per consultare un atlante durante l'esecuzione di questa procedura.
1. Rimozione del cervello del topo
- Bloccare la mascella della testa decapitata con un emostato (Figura 2i) e utilizzare una garza per riflettere il cuoio capelluto rostralmente creando ulteriormente un campo asciutto sul dorso del cranio (Figura 2ii).
- Inserire le sottili forbici curve nel forame magno per separare le meningi aderenti. Qui, inserire le forbici all'apertura sulla base del cranio è il forame magno, dove il midollo spinale passa con la lama rivolta verticalmente (posizione a ore 12), ma parallela e premendo contro la superficie interna dell'osso della piastra basale (cioè squama occipitale) e ruotando la lama di quarantacinque ° verso il lato sinistro e poi verso il lato destro.
- Continuare a ruotare il polso per sollevare l'osso della piastra basale che taglierà il centro dell'osso rimanente continuando nell'osso occipitale e nelle ossa intraparietali facendo leva sulle ossa a sinistra ea destra fino a quando non vengono rimosse. In modo simile, rimuovere l'osso occipitale e l'osso intraparietale per esporre il cervelletto.
NOTA: A questo punto, la struttura ossea cava chiamata bolle timpaniche, sulla porzione posteriore ventrale del cranio che racchiude parti dell'orecchio medio e interno, può essere rimossa a meno che non si sezionino i lobi posteriori e anteriori delle ipofisi (Figura 2iii). - Rimuovere gli attacchi muscolari alla cresta temporale usando una lama a forbice affilata curva. Posizionare un arto delle forbici affilate curve sotto la sutura lambdoide che penetra nella giunzione dei seni trasversali e sagittali (Figura 2iv).
- Avanzare le forbici rostralmente lungo la sutura mediosagittale fino al bregma e tagliarlo molto delicatamente sollevandolo con cura verso l'alto per evitare la lacerazione delle cortecce cerebrali. Si tratta di una fase critica della procedura (Figura 2v).
- In questa fase, le ossa parietali vengono sollevate e ruotate raschiando così la superficie interna dell'osso per identificare e tagliare gli attaccamenti meningei rimanenti. Afferrare l'osso temporale facendo leva verso l'esterno, lontano dal cervello. Rimuovere l'osso frontale da ciascun lato usando forbici curve o un rongeur nell'orbita e tagliare coronalmente ad angolo retto rispetto alla cresta orbitale, ma non oltre la linea mediana (Figura 2vii).
- Effettuare due tagli paralleli e distanti circa 4 mm nel piano sagittale (Figura 2viii).
NOTA: non tagliare entrambi i lati con un solo tratto. - Rimuovere i frammenti dell'osso frontale evitando di lacerare la superficie cerebrale (Figura 2ix). A questo punto, utilizzate una forbice fine per tagliare la dura madre, che dovrebbe essere accessibile tra i bulbi olfattivi.
- Capovolgere delicatamente il cranio per consentire alla gravità di aiutare nella rimozione del cervello, continuando a identificare e tagliare i restanti attaccamenti meningei e nervi cranici. Il cervello verrà rilasciato tagliando il più grande nervo trigemino attaccato al cervello ed è chiaramente visibile che si estende dalla base del calvario (Figura 2x).
NOTA: Trasferire il cervello in una soluzione salina fredda (citrato di sodio privo di RNasi ghiacciata (0,9%) o soluzione fisiologica (0,9%) per un'ulteriore dissezione.
2. Dissezione delle pituitarie anteriori e posteriori
NOTA: Le ghiandole pituitarie sono ricoperte da una membrana simile a una tenda molto dura, con una cresta che corre lateralmente tra i nervi trigemino sinistro e destro. Queste strutture sono estremamente morbide e delicate e, come tali, si raccomanda che i lobi posteriori e anteriori delle ghiandole pituitarie siano sezionati separatamente in fasi, in situ, direttamente dal cranio. Immediatamente dopo la dissezione, trasferire la rispettiva ghiandola pituitaria in un flaconcino premarcato e conservare il flaconcino in azoto liquido, preferibilmente altrimenti -80 °C. La ghiandola pituitaria poggia esattamente sopra la giunzione delle ossa occipitale e basisfenoide; Se si flettono, l'architettura pituitaria viene interrotta.
- Mantenere intatte le bolle uditive per assicurarsi che l'anatomia ipofisaria sia intatta e facilmente identificabile (Figura 2ix).
- Sezionare il lobo posteriore dell'ipofisi seguito dal lobo anteriore dell'ipofisi, dal resto del cranio.
- Fare un taglio parasagittale estremamente piccolo su entrambi i lati nella cresta della tenda membranosa e sollevare il lobo posteriore dell'ipofisi con una pinza ultrafine, facendo attenzione a non interrompere il tessuto ipofisario anteriore (Figura 2x).
- Fare un taglio sagittale tra i margini laterali del lobo anteriore dell'ipofisi e il nervo trigemino più vicino e sollevare successivamente il lobo anteriore dell'ipofisi (Figura 2x).
3. Dissezione del cervello del topo
NOTA: Immediatamente dopo la rimozione del cervello e dell'ipofisi, viene eseguita un'ulteriore dissezione su un blocco di acciaio inossidabile pre-raffreddato (Figura 3). Dopo la dissezione, trasferire le regioni cerebrali in flaconcini premarcati e trasferire i flaconcini preferibilmente in azoto liquido altrimenti -80 °C. Le strutture prodotte con il metodo top-down (in ordine cronologico) includono potenzialmente quanto segue: cervelletto (CB), tronco encefalico/cervello posteriore (ponte e midollo allungato) (HB), bulbi olfattivi (OB) come bulbi olfattivi accessori, corteccia prefrontale mediale (MPFC), corteccia prefrontale laterale (FCX), corpo striato anteriore e posteriore (ST), striato ventrale (VS) costituito dal nucleo accumbens (NAC) e tubercolo olfattivo (OT), setto (SE), area preottica, corteccia piriforme (PFM), ipotalamo (HY), amigdala (AY), ippocampo (HC), corteccia cingolata posteriore (CNG), corteccia entorinale (ERC), mesencefalo (MB) con talamo e resto della corteccia cerebrale (ROC) (Tabella 1). Regioni specifiche saranno discusse in ordine di isolamento, lavorando con un singolo emisfero.
- Fai molta attenzione nel rimuovere il cervello dal calvario poiché i punti di riferimento possono essere distrutti in caso di lacerazioni. In questa fase, eseguire tutte le dissezioni utilizzando la protezione del viso, in particolare, una visiera da gioielliere 7x e l'illuminazione sarà fornita da lampade chirurgiche posizionate su ciascuna delle spalle del dissettore. Gran parte della dissezione sarà eseguita utilizzando piccole pinze curve in modalità smussata (cioè pinze di Graefe).
- Posizionare il cervello su un blocco di acciaio inossidabile (Figura 4i e Figura 4ii). Mantenere il blocco freddo circondandolo con ghiaccio e una soluzione salina ghiacciata. Inumidire periodicamente il tessuto con soluzione salina ghiacciata per preservare le strutture.
- Posiziona il cervello in modo tale che le cortecce cerebrali siano rivolte verso l'alto. Utilizzando piccole pinze curve, riflettere delicatamente il CB esponendo i peduncoli cerebellari superiori, medi e inferiori e rimuovere il CB (Figura 4iii e Figura 4iv).
- Fai un taglio mediosagittale partendo dal dorso e tra l'OB e gli emisferi cerebrali (Figura 4v) e assicurati di non estenderti oltre la commissura anteriore. A questo punto, il verme può essere facilmente separato dalle porzioni laterali e l'HB sarà ottenuto da un taglio coronale al margine anteriore del ponte.
- Separare il midollo da un taglio coronale sul margine posteriore del ponte.
NOTA: A questo punto, il diencefalo, la parte posteriore del proencefalo contenente l'epitalamo, il talamo, l'ipotalamo e il talamo ventrale e il terzo ventricolo, sarà girato con il lato ventrale verso l'alto e un taglio mediosagittale sarà fatto dal chiasma ottico rostralmente. La dissezione degli emisferi cerebrali seguita dalla rimozione di OB da uno degli emisferi sarà in questa fase (Figura 4v e Figura 4vi). - Separare gli emisferi cerebrali (Figura 4v) prima di sezionare ulteriormente il diencefalo (Figura 4v). L'approccio dorsale sarà impiegato da un'attenta dissezione smussata per preservare i punti di riferimento della linea mediana criticamente salienti. Visualizza ogni connessione interemisferica prima di reciderle in quanto ciò ridurrà al minimo la possibilità di deviare dalla linea mediana.
NOTA: In questa fase uno degli emisferi cerebrali (Hemibrain) può essere conservato e il secondo emisfero può essere utilizzato per un'ulteriore dissezione. - Far scivolare le lame chiuse di una piccola pinza curva, sotto il corpo calloso e allargare delicatamente per ritrarre la neocorteccia bilateralmente. Il corpo calloso è un'ampia fascia di fibre nervose che unisce i due emisferi che saranno sezionati senza mezzi termini pizzicando con la pinza, senza disturbare le strutture della linea mediana che si trovano sotto.
NOTA: Le facce mesiali degli emisferi avranno più punti di riferimento visibili come strutture mieliniche come il genu del corpo calloso, i fornici e la commissura anteriore. Inoltre, sebbene alcuni millimetri laterali alla linea mediana, possono essere visibili anche il tratto mammillotalamico e il fascicolo retroflexus. - Taglia in due le molteplici strutture che attraversano la linea mediana. Ciò includerà il corpo calloso, la commissura anteriore, la commissura del fornice ventrale, la commissura posteriore, la commissura del fornice dorsale, la decussazione supra mammillare, la commissura del collicolo superiore, la commissura del fornice ventrale e le fibre talamiche periventricolari.
- Prestare particolare attenzione in questa fase all'interno o vicino alla linea mediana che potrebbe essere parzialmente compromessa dal metodo di avvicinamento dorsale. Tutte le strutture di follow-up sono a rischio se non eseguite con attenzione.
- Rimuovere l'OB (a forma di cuneo e di colore più chiaro) e i bulbi olfattivi accessori seguiti dalla raccolta dell'MPFC (area 1 della corteccia cingolata, prelimbica, infralimbica, orbitale mediale e secondaria [M2]) e FCX da un taglio coronale che viene effettuato 1 mm anteriormente al genu del corpo calloso (Figura 4vii). Dividere la sezione risultante per un taglio parasagittale di 1/3 della distanza dalla superficie mediale a quella laterale, ottenendo MPFC medialmente e il resto di FCX lateralmente. La corteccia cingolata è l'analogo del topo di MPFC.
NOTA: Questa fetta di tessuto conterrà anche una piccola quantità di M2 (corteccia motoria secondaria) 17 ed è inevitabile. - Effettuare un taglio coronale a livello della commissura anteriore che porti alla visibilità dell'arto anteriore della commissura anteriore nella sezione trasversale sulla faccia rostrale della sezione coronale risultante, mentre la porzione trasversale sarà rivelata nella faccia caudale della sezione. Questo è un punto di riferimento di conferma per NAC18. Il VS è composto da NAC e OT.
NOTA: C'è un arto anteriore oltre al segmento trasversale nella commissura anteriore ed è chiamato commissura anteriore, pars anteriore. - Parzialmente tagliato orizzontalmente attraverso la porzione trasversale della commissura anteriore dalla linea mediana sotto il corno anteriore del ventricolo laterale, per liberare il nucleo del setto dorsalmente e il VS ventralmente. Rimuovere la piccola quantità di corteccia dalla superficie laterale dove verranno rimossi NAC e OT .
- Separare la porzione rostrale della ST dalla corteccia sovrastante tramite bisturi curvo tagliato appena fuori dalla capsula esterna facendo attenzione a non includere tessuto striatale nel campione corticale. A questo punto, i nuclei del setto /SE saranno visibili e potranno essere facilmente prelevati da questa fetta (Figura 4viii).
NOTA: I limiti anteriore e posteriore della PFM sono definiti da piani coronali immaginari che sono in linea rispettivamente con la commissura anteriore e i corpi mammillari. Il limite mediale è definito dalla capsula esterna18. - Sulla superficie laterale dell'emisezione rimanente del diencefalo, effettuare un taglio orizzontale parziale lungo il solco rinale che si estende caudalmente, ma solo fino al livello immaginario del piano coronale con i corpi mammillari. Fare un taglio coronale parziale, estendendosi medialmente 1 mm dalla superficie corticale laterale nel piano dei corpi mammillari dell'HY. Qui, l'incisione para-sagittale nel piano del claustrum libererà la PFM (Figura 4ix e Figura 4x).
NOTA: Sulla superficie mediale della restante emisezione del diencefalo, saranno visibili numerose caratteristiche anatomiche tra cui i corpi mammillari, il fascicolo retroflesso e la stria midollare. Sarà visibile un motivo semicircolare (lato concavo dorsale), che indica il margine tra il talamo e l'HY. L'HY sarà facilmente identificabile sulla vista della sezione mediosagittale per il chiasma ottico anteroventralmente e la commissura anteriore anterodoralmente e i corpi mammillari insieme al fascicolo retroflesso posteriormente. Questi ultimi punti di riferimento sono stati ben visualizzati nell'atlante17 e nel contesto del proencefalo del topo albino19. - Fare un taglio coronale parziale posteriore ai corpi mammillari, estendendosi solo lateralmente fino al solco ipotalamico. A questo punto un taglio parasagittale lungo la lunghezza del solco ipotalamico ora libera l'HY .
- Comportare l'eversione del ventricolo laterale per rivelare ulteriori connessioni intralimbiche e i restanti componenti del sistema limbico. Osservando la faccia mediale della rimanente emi-sezione del diencefalo, la pinza curva sarà l'opzione migliore in quanto consente al tecnico di manipolare attorno ad altre sezioni delicate dell'area circostante utilizzate per recidere il fornice e viene inserito nel ventricolo laterale e delicatamente espanso, usando la dissezione smussata per aprire il ventricolo e ruotare l'HC . 90° dal piano verticale a quello orizzontale. Potrebbe essere necessario utilizzare la lama # 11 per sezionare l'arteria coroideale / plesso coroideo poiché la punta appuntita può aiutare con tagli precisi.
- Ruotare il CNG di 90° (ma nella direzione opposta rispetto all'HC) per essere sul piano orizzontale. Utilizzando una pinza, ruotare delicatamente l'HC di 180° verso l'esterno e lateralmente, in modo da rendere la superficie interna dell'ERC visibile e rivolta verso l'alto.
- Una radiazione simile a un ventaglio di fibre mieliniche derivanti dall'ERC sarà vista convergere per formare il fascio angolare, compreso il percorso perforante e il suo attaccamento all'HC. Ruotare il talamo e MB di 180° dorsalmente per rivelare ventralmente l'AY.
- Se necessario, sollevare il tratto ottico per rivelare l'attacco della stria terminale in quanto conterrà bande di fibre che corrono lungo il margine laterale della superficie ventricolare del talamo all'AY e renderà chiari i contorni dell'AY .
NOTA: L'HC e il fornice saranno chiaramente visibili nella loro interezza, annidati nel ventricolo laterale e possono essere facilmente sollevati. Il ventricolo laterale sarà rivestito con pia madre e le origini a ventaglio del percorso perforante attraverso l'aspetto subpiale molto trasparente dell'ERC saranno visibili20. - La superficie esterna della ERC mediale avrà uno strato prominente visibile di grandi cellule piramidali. Inoltre, una densa convergenza di fibre coloranti del Golgi sarà una caratteristica saliente nell'ERC mediale. In questa procedura di dissezione, dopo aver eliminato il ventricolo laterale, queste fibre saranno facilmente visibili sulla superficie mediale attraverso la pia madre, che riveste le superfici interne dei ventricoli, formando una struttura a ventaglio molto prominente.
- Si noti che le fibre si stanno raccogliendo sottopialmente, discendendo e lasciando l'ERC ventrale, estendendosi posteriormente e poi ascendendo verticalmente per perforare l'HC. Questa struttura a ventaglio nel CER sarà utilizzata per definire i margini ai fini della dissezione. Identificare e rimuovere nell'ordine delle strutture AY, ERC, CNG e HC .
NOTA: La definizione di un buon punto di riferimento per la dissezione AY sarà una chiave per il passo successivo e la giunzione sul margine posteriore in cui la stria terminalis incontra l'AY sarà un buon punto. - A questo punto, le strutture rimanenti includono il talamo e il MB. Confermare l'identificazione del talamo mediante la visualizzazione della stria midollare sulla sua superficie dorsale che si estende nel piano rostrocaudale della linea mediana. Separare completamente il talamo dal mesencefalo con un taglio coronale caudale all'habenula e rostrale ai collicoli superiori. Il ROC viene salvato in questo passaggio.
- A questo punto completa la raccolta di tutte le regioni del cervello e, immediatamente (man mano che ciascuna viene ottenuta) conserva i campioni congelati fino a ulteriori elaborazioni.
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Representative Results
La nostra comprensione della complessa struttura e funzione del cervello si sta rapidamente evolvendo e migliorando. Il cervello contiene più regioni distinte e la costruzione di una mappa molecolare può aiutarci a capire meglio come funziona il cervello. In questo documento metodologico, abbiamo discusso la dissezione del cervello del topo in più regioni distinte (Tabella 1). In questo protocollo, le strutture sono identificate in base ai punti di riferimento critici e si ottiene mantenendo il tessuto umido con soluzione salina mantenendo la sua robustezza per una dissezione immediata. Il metodo copre più regioni rispetto ad altri rapporti21 ed è complementare ai metodi di dissezione che utilizzano cervelli congelati22,23. Questi tessuti sezionati possono essere conservati e lavorati in seguito a seconda delle esigenze dello studio. Il metodo discusso qui è la rimozione immediata del cervello dal cranio seguita dalla dissezione che fornisce abbastanza tessuto in modo rapido per i saggi a valle date le dimensioni del cervello del topo. Il nostro team ha estratto l'RNA da più tessuti sezionati e analizzato il profilo di espressione genica utilizzando microarray per i tessuti cerebrali; AY, HC, MPFC, regione del setto, corpo striato e VS e i risultati sono stati pubblicati15. Questi cervelli raccolti sono stati conservati a -80 ° C per diversi mesi prima dell'estrazione dell'RNA. Questo metodo può essere adottato in combinazione con altri metodi per diversificare l'utilità a valle delle regioni cerebrali. Questo metodo di dissezione si concentra sul seguire i punti di riferimento tra regioni adiacenti anatomicamente distinte invece di essere dissezioni strettamente coronali o sagittali. Le distinte regioni del cervello insieme ai dati sul peso sono state raccolte nell'ambito dello studio aggressore esposto al modello di stress sociale di PTSD16 e le concentrazioni di RNA insieme alle letture spettrofotometriche sono mostrate come Figura 5.
Figura 1: Rappresentazione del cervello di topo con distinti tipi di tessuto raccolti. Questa figura è una rappresentazione cosmetica delle strutture e non viene ridimensionata in alcun database mappato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rimozione del cervello dalla cavità cranica seguita da rimozione dell'ipofisi. Procedura graduale per la rimozione del cervello (i) bloccaggio e tenuta dopo la depilazione (ii) fissaggio del morsetto con un Kimwipe per tenere i peli lontani dal tessuto (iii) prima della rimozione dei muscoli (iv) dopo la rimozione dei muscoli (v) separazione di méninges (vi) rimozione del globo/occhio (vii) taglio sulla cresta orbitale (viii) rimozione delle ossa parietali e frontali (ix) visualizzazione e rimozione del cervello (x) distacco del cervello (xi) vista ipofisaria (xii) rimozione dell'ipofisi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Stazione di configurazione della dissezione. Questa immagine mostra il set up per la dissezione cerebrale post-rimozione dei tessuti cerebrali e ipofisari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Dissezione cerebrale. Procedura graduale per la rimozione del cervello (i) vista dall'alto del cervello (ii) vista dorsale del cervello (iii) rimozione del cervelletto (iv) separazione cerebrale (v) dissezione degli emisferi (vi) rimozione del bulbo olfattivo (vii) MPFC, FCX e dissezione olfattiva accessoria (viii) Dissezione SE, VS e ST (ix) Rimozione PFM (x) Dissezione del sistema limbico Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Dati generati dopo la raccolta del campione (A) Viene mostrato il peso del tessuto cerebrale e (B) la concentrazione di RNA e (C) OD 260/280 da ciascuno dei tessuti cerebrali. Qui i dati sono raccolti da gruppi di controllo (n = 3-6) da un gruppo di studio come riportato in precedenza15,16. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| # | Abbreviazioni | Descrizione della regione del cervello |
| 1 | Cb | Cervelletto |
| 2 | Hb | Tronco encefalico/cervello posteriore (ponte e midollo allungato) |
| Separare nei due emisferi | ||
| 3 | Ob | Bulbi olfattivi e bulbi olfattivi accessori |
| 4 | MPFC | Corteccia prefrontale mediale |
| 5 | FCX | Corteccia prefrontale laterale |
| 6 | SE | Setto o regione del setto |
| 7 | Vs | Lo striato ventrale comprende il nucleo accumbens (NAC) e il tubercolo olfattivo (OT) |
| 8 | San | Corpo striato anteriore e posteriore |
| 9 | Hy | Ipotalamo |
| 10 | PFM | Corteccia piriforme |
| 11 | Hc | Ippocampo |
| 12 | CER | Corteccia entorinale |
| 13 | Metano | Corteccia cingolata posteriore |
| 14 | Ay | Amigdala |
| 15 | MB | Mesencefalo con talamo |
| 16 | Roc | Resto della corteccia cerebrale |
Tabella 1: Descrizione delle regioni distinte dal cervello del topo. Questa tabella contiene l'elenco di tutte le regioni del cervello raccolte con la sua abbreviazione.
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Discussion
Il cervello dei mammiferi è un organo complesso composto da una serie di cellule morfologicamente distinte e funzionalmente uniche con diverse firme molecolari e regioni multiple che svolgono funzioni specializzate e discrete. La procedura di dissezione qui riportata può avere più obiettivi a seconda delle esigenze del laboratorio. Nel nostro laboratorio abbiamo valutato la trascrizione in più regioni del cervello raccolte da topi esposti a PTSD come lo stress16 . Vorremmo studiare ulteriormente l'impatto del background genetico del ceppo24 sui livelli di espressione in più regioni del cervello. Questo protocollo ha più passaggi critici che devono essere considerati per la riproducibilità di successo degli esperimenti. Ciascuna delle regioni localizzate del cervello svolge un ruolo distinto nella condizione neuropatologica e manca una conoscenza dettagliata della regione cerebrale appropriata da studiare. Pertanto è importante generare il set di dati relativo alla regione del cervello. Pertanto, i dati possono essere interrogati non solo selezionando la regione del cervello, ma anche per categoria di dati (ad esempio, trascrittoma, proteina, cellula (citoarchitettonica) o altro) portando a informazioni più precise. In precedenza, i tessuti come il bulbo olfattivo, la corteccia frontale, lo striato e l'ippocampo nei tessuti cerebrali di ratto freschi hanno dimostrato di essere sezionati usando un microscopio25. In alternativa, le sezioni possono essere sezionate mentre il cervello viene congelato14 seguito da estrazioni di RNA e proteine, ma questo metodo è limitato alle regioni del cervello che possono essere identificate da chiari punti di riferimento. Le estrazioni totali di RNA sono state effettuate dopo la microdissezione25 dalle principali regioni del cervello e utilizzando un approccio di microscopia non a cattura laser per studi di espressione genica13. Qui ci concentriamo sulla dissezione del cervello di topo fresco per separare le strutture cerebrali specifiche che hanno un controllo dedicato sulle funzioni fisiologiche e comportamentali. Il nostro metodo spiega la dissezione di più regioni rispetto ai rapporti già pubblicati, tuttavia è complementare ad altri metodi di dissezione disponibili. Questo approccio può aiutare a fornire una valutazione completa dei tessuti e della sua associazione con condizioni debilitanti. Questa strategia di dissezione fornisce un'opzione praticabile alle strategie di raccolta dei campioni esistenti aprendo possibilità per nuove scoperte.
Con il metodo qui descritto, i tessuti cerebrali vengono congelati in azoto liquido prima di trasferirsi a -80 °C per la conservazione a lungo termine. È importante che gli strumenti e i tessuti siano mantenuti freddi durante l'intera procedura per la conservazione degli acidi nucleici o delle proteine. Questi tessuti congelati vengono omogeneizzati successivamente utilizzando procedure operative standard di laboratorio. Alcuni di questi tessuti cerebrali sono molto piccoli e bisogna prestare attenzione durante il processo di omogeneizzazione ed estrazione proteggendo le molecole bersaglio dalla degradazione a temperature più elevate.
In questo processo, è importante identificare punti di riferimento chiari per individuare le regioni specifiche del tessuto. Ciò si ottiene mantenendo il tessuto umido con soluzione salina per evitare che diventi rapidamente morbido e mantenga la sua robustezza per un po '. I nostri studi precedenti hanno confrontato i cambiamenti di espressione genica tra i tessuti di topo esposti al controllo e all'aggressore15 e non hanno studiato alcun cambiamento causato dalla soluzione salina utilizzata durante la dissezione. Nella nostra esperienza, questo è particolarmente importante durante l'incisione a partire dall'ipotalamo e il capovolgimento di 180 ° in quanto espone e rende più evidente e più chiara l'ombreggiatura di separazione regionale delle regioni limbiche (AY, HC, ERC). Il sistema limbico è situato in profondità all'interno del cervello e viene danneggiato da una varietà di stimoli, e quindi è importante diagnosticamente e terapeuticamente. Il sistema limbico è costituito da regioni cerebrali, tuttavia non esiste un accordo universale su questa lista26. Sebbene non studiati, pensiamo che ci siano effetti minimi o nulli dell'uso salino. Questo perché l'intera procedura dura circa 20 minuti dopo le condizioni di freddo durante l'intero processo.
Le regioni all'interno del tessuto cerebrale sono identificate utilizzando punti di riferimento menzionati negli atlanti cerebrali. Utilizzando questa tecnica, i punti di riferimento devono essere chiari e questa procedura dovrebbe essere eseguita in sequenza. La dissezione deve essere fatta mentre il cervello è ancora fresco e robusto; (deve essere fatto con i primi 15-20 minuti) - altrimenti i punti di riferimento non saranno chiari e le regioni non saranno distinte se il cervello rimane più a lungo e diventa più morbido.
Come descritto sopra, all'interno del cervello ci sono sottoregioni, contenenti più aree funzionali che agiscono indipendentemente o in coordinamento con reti connettive intrinseche. È importante recuperare queste regioni con grande precisione per studiarne le grandi dimensioni. Ciò contribuirà a integrare questi concetti combinando le regioni specializzate in cui ciascuna sta servendo un processo distinto con un potenziale terapeutico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Seshmalini Srinivasan, il signor Stephen Butler e la signora Pamela Spellman per l'assistenza sperimentale e la signora Dana Youssef per la revisione del manoscritto. Il sostegno finanziario da parte di USAMRDC è riconosciuto con gratitudine. La Fondazione di Ginevra ha contribuito a questo lavoro ed è stata sostenuta da fondi della Direzione III dell'Area di Ricerca di Medicina Militare e Operativa tramite l'Ufficio di Ricerca dell'Esercito degli Stati Uniti.
Disconoscimento:
Il materiale è stato esaminato dal Walter Reed Army Institute of Research. Non vi sono obiezioni alla sua presentazione e/o pubblicazione. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono opinioni private dell'autore e non devono essere interpretate come ufficiali o come riflettenti le vere opinioni del Dipartimento dell'Esercito o del Dipartimento della Difesa. La ricerca è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato per l'uso degli animali in una struttura accreditata AAALAC in conformità con l'Animal Welfare Act e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicazione NRC, edizione 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
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