Summary
We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.
Abstract
De hersenen zijn het commandocentrum voor het zenuwstelsel van zoogdieren en een orgaan met een enorme structurele complexiteit. Beschermd in de schedel, bestaan de hersenen uit een buitenste bedekking van grijze stof over de hemisferen die bekend staat als de hersenschors. Onder deze laag bevinden zich vele andere gespecialiseerde structuren die essentieel zijn voor meerdere fenomenen die belangrijk zijn voor het bestaan. Het verkrijgen van monsters van specifieke grove hersengebieden vereist snelle en nauwkeurige dissectiestappen. Het is duidelijk dat er op microscopisch niveau veel subregio's bestaan en waarschijnlijk de willekeurige regionale grenzen overschrijden die we opleggen met het oog op deze dissectie.
Muismodellen worden routinematig gebruikt om menselijke hersenfuncties en ziekten te bestuderen. Veranderingen in genexpressiepatronen kunnen beperkt zijn tot specifieke hersengebieden die gericht zijn op een bepaald fenotype, afhankelijk van de zieke toestand. Het is dus van groot belang om de regulering van transcriptie te bestuderen met betrekking tot de goed gedefinieerde structurele organisatie. Een volledig begrip van de hersenen vereist het bestuderen van verschillende hersengebieden, het definiëren van verbindingen en het identificeren van belangrijke verschillen in de activiteiten van elk van deze hersengebieden. Een uitgebreider begrip van elk van deze verschillende regio's kan de weg vrijmaken voor nieuwe en verbeterde behandelingen op het gebied van neurowetenschappen. Hierin bespreken we een stapsgewijze methodologie voor het ontleden van het muizenbrein in zestien verschillende regio's. In deze procedure hebben we ons gericht op mannelijke muis C57Bl / 6J (6-8 weken oud) hersenverwijdering en dissectie in meerdere regio's met behulp van neuroanatomische oriëntatiepunten om discrete functioneel relevante en gedragsrelevante hersengebieden te identificeren en te bemonsteren. Dit werk zal helpen een sterke basis te leggen op het gebied van neurowetenschappen, wat leidt tot meer gerichte benaderingen in het diepere begrip van de hersenfunctie.
Introduction
De hersenen, samen met het ruggenmerg en het netvlies, vormen het centrale zenuwstelsel dat complex gedrag uitvoert, gecontroleerd door gespecialiseerde, nauwkeurig gepositioneerde en interagerende celtypen in het hele lichaam1. De hersenen zijn een complex orgaan met miljarden onderling verbonden neuronen en glia met nauwkeurige circuits die tal van functies uitvoeren. Het is een bilaterale structuur met twee verschillende lobben en diverse cellulaire componenten2. Het ruggenmerg verbindt de hersenen met de buitenwereld en wordt beschermd door bot, hersenvliezen en hersenvocht en routeert berichten van en naar de hersenen 2,3,4. Het oppervlak van de hersenen, de hersenschors, is ongelijk en heeft verschillende plooien, gyri genaamd, en groeven, sulci genaamd, die de hersenen scheiden in functionele centra5. De cortex is glad bij zoogdieren met een klein brein 6,7. Het is belangrijk om de architectuur van het menselijk brein te karakteriseren en te bestuderen om de aandoeningen te begrijpen die verband houden met de verschillende hersengebieden, evenals de functionele circuits ervan. Neurowetenschappelijk onderzoek is de afgelopen jaren uitgebreid en er worden verschillende experimentele methoden gebruikt om de structuur en functie van de hersenen te bestuderen. Ontwikkelingen op het gebied van moleculaire en systeemniveau biologie hebben een nieuw tijdperk ingeluid van het onderzoeken van de complexe relatie tussen hersenstructuren en het functioneren van moleculen. Bovendien breiden moleculaire biologie, genetica en epigenetica zich snel uit, waardoor we onze kennis van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij het functioneren van systemen kunnen vergroten. Deze analyses kunnen op een veel meer gelokaliseerde basis worden uitgevoerd, om te helpen bij het onderzoeken en ontwikkelen van effectievere therapieën.
Het zoogdierbrein is structureel gedefinieerd in duidelijk identificeerbare discrete gebieden; de functionele en moleculaire complexiteit van deze discrete structuren zijn echter nog niet duidelijk begrepen. De multidimensionale en meerlagige aard van het hersenweefsel maakt dit landschap moeilijk te bestuderen op functioneel niveau. Bovendien bemoeilijkt het feit dat meerdere functies door dezelfde structuur worden uitgevoerd en vice versa het begrip van de hersenen verder8. Het is van vitaal belang dat de experimentele benadering die wordt uitgevoerd voor de structurele en functionele karakterisering van hersengebieden nauwkeurige onderzoeksmethoden gebruikt om consistentie te bereiken in bemonstering voor het correleren van neuroanatomische architectuur met functie. De complexiteit van de hersenen is onlangs verklaard met behulp van single cell sequencing 9,10, zoals de temporale gyrus van het menselijk brein die is samengesteld uit 75 verschillende celtypen11. Door deze gegevens te vergelijken met die uit een analoog gebied van het muizenbrein, onthult de studie niet alleen overeenkomsten in hun architectuur en celtypen, maar presenteert ook de verschillen. Om de complexe mechanismen te ontrafelen, is het daarom belangrijk om verschillende hersengebieden met volledige precisie te bestuderen. Geconserveerde structuren en functies tussen een menselijk en muisbrein maken het gebruik van een muis mogelijk als een voorlopig surrogaat voor het ophelderen van de menselijke hersenfunctie en gedragsuitkomsten.
Met de vooruitgang van systeembiologische benaderingen is het verkrijgen van informatie uit discrete hersengebieden bij knaagdieren een belangrijke procedure geworden in neurowetenschappelijk onderzoek. Hoewel sommige protocollen zoals laser capture microdissection12 duur kunnen zijn, zijn mechanische protocollen goedkoop en worden ze uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare tools13,14. We hebben meerdere hersengebieden gebruikt voor transcriptomische assays15 en hebben een hands-on en snelle procedure ontwikkeld om de hersengebieden van muizen die van belang zijn in korte tijd stap voor stap te ontleden. Eenmaal ontleed, kunnen deze monsters onmiddellijk in koude omstandigheden worden opgeslagen om de nucleïnezuren en eiwitten van deze weefsels te behouden. Onze aanpak kan sneller worden uitgevoerd, wat leidt tot een hoge efficiëntie en minder kans op weefselverslechtering mogelijk maakt. Dit verhoogt uiteindelijk de kans op het genereren van hoogwaardige, reproduceerbare experimenten met behulp van hersenweefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierbehandeling en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor dierverzorging. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het US Army Center for Environmental Health Research, nu Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) en uitgevoerd in een faciliteit die is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
OPMERKING: De procedure zal worden uitgevoerd op zes tot acht weken oude mannelijke muizen van de C57BL / 6j-stam geëuthanaseerd door cervicale dislocatie16. Er worden geen perfusies uitgevoerd in ons laboratorium, maar dit protocol kan worden aangepast waarbij perfusies om bloed uit de vasculatuur te verwijderen kunnen worden uitgevoerd. Alle benodigdheden die nodig zijn voor de dissectie staan vermeld in de tabel met materialen. De dissectie is onderverdeeld in drie componenten, waaronder verwijdering van de hersenen, de verwijdering van de hypofyse en de hersendissectie. De bedoeling van het verzamelen van hersenweefsel is om ze te verwerken voor transcriptomische assays na RNA-extracties. Zodra het hersengebied is ontleed, brengen we onmiddellijk elk van de hersengebieden over in een reeds gelabelde vriesflacon en bewaren we de injectieflacon vervolgens in vloeibare stikstof of -80 °C.
OPMERKING: Grondige kennis van de neuroanatomie is essentieel om deze procedure uit te voeren. Horizontale en longitudinale secties, evenals de gebruikelijke dwarsdoorsneden, moeten worden bestudeerd en geleerd. Omdat hersenweefsel zeer snel afbreekt, is er geen tijd om een atlas te raadplegen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
1. Muizen hersenverwijdering
- Klem de maxilla van het onthoofde hoofd vast met een hemostat (figuur 2i) en gebruik een gaasje om de hoofdhuid rostrale verder te reflecteren, waardoor een droog veld op de dorsum van de schedel ontstaat (figuur 2ii).
- Steek de fijne gebogen schaar in het foramen magnum om de klevende hersenvliezen te scheiden. Hier, plaats de schaar bij de opening op de schedelbasis het foramen magnum, waar het ruggenmerg passeert met het blad verticaal gericht (12 uur positie), maar parallel aan en drukkend tegen het binnenoppervlak van het basale plaatbot (d.w.z. occipitale squama) en het blad vijfenveertig ° naar de linkerkant en vervolgens naar de rechterkant draait.
- Blijf de pols draaien om het basale plaatbot af te wrikken dat het midden van het resterende bot doorknipt en doorgaat in het achterhoofdsbeen en intrapariëtale botten die de botten links en rechts wrikken totdat ze worden verwijderd. Verwijder op een vergelijkbare manier het achterhoofdsbot en het intrapariëtale bot om het cerebellum bloot te leggen.
OPMERKING: Op dit punt kan de holle benige structuur, de trommelvliesbullae, op het ventrale achterste deel van de schedel dat delen van het midden- en binnenoor omsluit, worden verwijderd, tenzij men de achterste en voorste lobben van hypofyses ontleedt (figuur 2iii). - Verwijder de spieraanhechtingen aan de temporale richel met behulp van een gebogen scherp schaarblad. Plaats een ledemaat van de gebogen scherpe schaar onder de lambdoïde hechting die doordringt in de kruising van de transversale en sagittale sinussen (figuur 2iv).
- Beweeg de schaar rostrale langs de midsagittale hechting tot aan de bregma en knip deze heel voorzichtig terwijl u voorzichtig naar boven tilt om scheuren van cerebrale cortices te voorkomen. Dit is een cruciale stap in de procedure (figuur 2v).
- Bij deze stap worden pariëtale botten opgetild en gedraaid, waardoor het binnenoppervlak van het bot wordt geschraapt om resterende meningeale aanhechtingen te identificeren en te snijden. Grijp het temporale bot dat naar buiten wrikt, weg van de hersenen. Verwijder het frontale bot van elke kant met een gebogen schaar of een rongeur in de baan en knip coronaal in een rechte hoek met de orbitale richel, maar niet verder dan de middellijn (figuur 2vii).
- Maak twee sneden evenwijdig en ongeveer 4 mm uit elkaar in het sagittale vlak (figuur 2viii).
OPMERKING: Snijd niet beide zijden met één enkele slag. - Verwijder de fragmenten van het frontale bot om te voorkomen dat het hersenoppervlak scheurt (figuur 2ix). Gebruik op dit punt een fijne schaar om de dura mater te knippen, die toegankelijk moet zijn tussen de olfactorische bollen.
- Keer de schedel voorzichtig om om de zwaartekracht te laten helpen bij het verwijderen van de hersenen, terwijl je doorgaat met het identificeren en snijden van resterende meningeale aanhechtingen en hersenzenuwen. De hersenen worden vrijgegeven door de grootste nervus trigeminus die aan de hersenen is bevestigd door te snijden en zijn duidelijk zichtbaar vanaf de basis van het calvarium (figuur 2x).
OPMERKING: Breng de hersenen over naar een koude zoutoplossing (ijskoude RNase-vrije natriumcitraat (0,9%) of fysiologische (0,9%) zoutoplossing) voor verdere dissectie.
2. Dissectie van de voorste en achterste hypofyse
OPMERKING: De hypofyse is bedekt met een zeer taai tentachtig membraan, met een richel die zijdelings loopt tussen de linker- en rechtertrigeminuszenuwen. Deze structuren zijn extreem zacht en delicaat en als zodanig wordt aanbevolen dat de achterste en voorste lobben van hypofyse afzonderlijk in fasen, in situ, rechtstreeks vanuit de schedel worden ontleed. Breng onmiddellijk na de dissectie de betreffende hypofyse over in een vooraf geëtiketteerde injectieflacon en bewaar de injectieflacon in vloeibare stikstof, bij voorkeur anders -80 °C. De hypofyse rust precies over de kruising van de occipitale en basisfenoïde botten; als ze buigen, wordt de hypofyse-architectuur verstoord.
- Houd de auditieve bullae intact om ervoor te zorgen dat de hypofyseanatomie intact en gemakkelijk identificeerbaar is (figuur 2ix).
- Ontleed de achterste kwab van de hypofyse gevolgd door de voorkwab van de hypofyse, van de rest van de schedel.
- Maak een extreem kleine parasagittale snede aan beide zijden in de rand van de vliezige tent en til de achterkwab van de hypofyse op met een ultrafijne tang, waarbij u ervoor zorgt dat het voorste hypofyseweefsel niet wordt verstoord (figuur 2x).
- Maak een sagittale snede tussen de laterale randen van de voorkwab van de hypofyse en de dichtstbijzijnde trigeminuszenuw en til daarna de voorkwab van de hypofyse op (figuur 2x).
3. Hersendissectie van muizen
OPMERKING: Onmiddellijk na het verwijderen van de hersenen en de hypofyse wordt verdere dissectie uitgevoerd op een voorgekoeld roestvrijstalen blok (figuur 3). Breng na dissectie de hersengebieden over naar vooraf gelabelde injectieflacons en breng de injectieflacons bij voorkeur over naar vloeibare stikstof anders -80 °C. Structuren geproduceerd door de top-down methode (in chronologische volgorde) omvatten mogelijk het volgende: cerebellum (CB), hersenstam / achterhersenen (pons en medulla oblongata) (HB), olfactorische bollen (OB) als accessoire olfactorische bollen, mediale prefrontale cortex (MPFC), laterale prefrontale cortex (FCX), anterieur en posterieur corpus striatum (ST), ventrale striatum (VS) bestaande uit de nucleus accumbens (NAC) en olfactorische tuberkel (OT), septum (SE), preoptisch gebied, piriforme cortex (PFM), hypothalamus (HY), amygdala (AY), hippocampus (HC), posterieure cingulate cortex (CNG), entorhinale cortex (ERC), middenhersenen (MB) met thalamus en rest van de hersenschors (ROC) (tabel 1). Specifieke regio's zullen worden besproken in volgorde van isolatie, werkend met een enkel halfrond.
- Wees voorzichtig bij het verwijderen van de hersenen uit het calvarium, omdat de oriëntatiepunten kunnen worden vernietigd in het geval er scheuren zijn. Voer bij deze stap alle dissecties uit met behulp van gezichtsbescherming, met name een 7x juweliersvizier, en verlichting wordt geleverd door chirurgische lampen die over elk van de schouders van de dissector zijn geplaatst. Een groot deel van de dissectie zal worden bereikt met behulp van stompe modus kleine gebogen tangen (d.w.z. Graefe-tangen).
- Plaats de hersenen op een roestvrijstalen blok (figuur 4i en figuur 4ii). Houd het blok koud door het te omringen met ijs en een ijskoude zoutoplossing. Bevochtig het weefsel periodiek met ijskoude zoutoplossing om de structuren te behouden.
- Plaats de hersenen zo dat de cerebrale cortices naar boven zijn gericht. Gebruik kleine gebogen tangen om de CB voorzichtig te reflecteren door de superieure, middelste en inferieure cerebellaire steeltjes bloot te leggen en verwijder de CB (figuur 4iii en figuur 4iv).
- Maak een midsagittale snede vanaf het dorsum en tussen de OB en de hersenhelften (figuur 4v) en zorg ervoor dat u niet verder reikt dan de voorste commissure. Op dit punt kan de vermis gemakkelijk worden gescheiden van de laterale porties en HB zal worden verkregen door een coronale snede aan de voorste rand van de pons.
- Scheid de medulla door een coronale snede aan de achterste rand van de pons.
OPMERKING: Op dit punt zal het diencephalon, het achterste deel van de voorhersenen dat de epithalamus, thalamus, hypothalamus en ventrale thalamus en de derde ventrikel bevat, ventrale kant naar boven worden gedraaid en een midsagittale snede zal worden gemaakt van het optische chiasme rostrale. De dissectie van hersenhelften gevolgd door verwijdering van OB uit een van de hemisfeer zal in deze stap zijn (figuur 4v en figuur 4vi). - Scheid de hersenhelften (figuur 4v) voordat je het diencephalon verder ontleedt (figuur 4v). De dorsale benadering zal worden gebruikt door zorgvuldige stompe dissectie om de kritisch opvallende middellijn oriëntatiepunten te behouden. Visualiseer elke interhemisferische verbinding voordat u ze verbreekt, omdat dit de mogelijkheid om van de middellijn af te wijken minimaliseert.
OPMERKING: Bij deze stap kan een van de hersenhelft (Hemibrain) worden bewaard en kan de tweede hemisfeer worden gebruikt voor verdere dissectie - Schuif de gesloten bladen van een kleine, gebogen tang onder het corpus callosum en spreid voorzichtig uit om de neocortex bilateraal in te trekken. Het corpus callosum is een brede band van zenuwvezels die de twee hemisferen verbindt die bot worden ontleed door met de tang te knijpen, zonder de onderliggende middenlijnstructuren te verstoren.
OPMERKING: Mesiale gezichten van de hemisferen hebben meerdere oriëntatiepunten zichtbaar, zoals gemyeliniseerde structuren zoals de genu van het corpus callosum, de fornices en de voorste commissure. Ook, hoewel een paar millimeter lateraal naar de middellijn, kunnen het mammillothalamic tractus en de fasciculus retroflexus ook zichtbaar zijn. - Bisect de meerdere structuren die de middellijn kruisen. Dit omvat het corpus callosum, anterieure commissure, ventrale fornix commissure, posterior commissure, dorsale fornix commissure, supra mammillaire decussatie, superieure colliculus commissure, ventrale fornix commissure en periventriculaire thalamische vezels.
- Wees extra voorzichtig bij deze stap in of in de buurt van de middellijn die gedeeltelijk kan worden aangetast door de dorsale benaderingsmethode. Alle follow-upstructuren lopen risico als ze niet zorgvuldig worden uitgevoerd.
- Verwijder de OB (wigvormige en lichtere kleur) en accessoire olfactorische bollen gevolgd door het verzamelen van de MPFC (cingulate cortex gebied 1, prelimbic, infralimbische, mediale orbitale en secundaire motor cortices [M2]) en FCX door een coronale snede die 1 mm anterieur is gemaakt aan de genu van het corpus callosum (figuur 4vii). Deel de resulterende sectie door een parasagittale snede 1/3 van de afstand van het mediale tot het laterale oppervlak, waardoor MPFC mediaal en rest van FCX lateraal ontstaat. De cingulate cortex is het muisanaloog van MPFC.
OPMERKING: Dit weefselschijfje bevat ook een kleine hoeveelheid van de M2 (secundaire motorische cortex) 17 en is onvermijdelijk. - Maak een coronale snede ter hoogte van de voorste commissure die leidt tot zichtbaarheid van pars anterieure ledemaat van de anterieure commissure in de doorsnede op het rostrale gezicht van de resulterende coronale sectie, terwijl het transversale gedeelte zal worden onthuld in het caudale gezicht van de sectie Dit is een bevestigend oriëntatiepunt voor NAC18. De VS bestaat uit de NAC en OT.
OPMERKING: Er is een voorste ledemaat naast het transversale segment in de voorste commissure en het wordt anterieure commissure genoemd, pars anterior. - Snijd gedeeltelijk horizontaal door het dwarse deel van de voorste commissure vanaf de middellijn onder de voorste hoorn van de laterale ventrikel, om de septumkern dorsaal en de VS ventraal te bevrijden. Verwijder de kleine hoeveelheid cortex van het laterale oppervlak waar NAC en OT zullen worden verwijderd.
- Scheid het rostrale deel van de ST van de bovenliggende cortex via gebogen scalpelsnede net buiten de externe capsule en zorg ervoor dat er geen striataal weefsel in het corticale monster wordt opgenomen. Op dit punt zullen de septumkernen /SE zichtbaar zijn en gemakkelijk uit deze plak kunnen worden genomen (figuur 4viii).
OPMERKING: De anterieure en achterste limieten van de PFM worden gedefinieerd door denkbeeldige coronale vlakken die in overeenstemming zijn met respectievelijk de anterieure commissure en de mammillaire lichamen. De mediale limiet wordt bepaald door de uitwendige capsule18. - Maak op het laterale oppervlak van het resterende hemi-gedeelte van het diencephalon een gedeeltelijke horizontale snede langs de rhinale sulcus die zich caudaal uitstrekt, maar alleen tot het denkbeeldige coronale vlak ter hoogte van de mammillaire lichamen. Maak een gedeeltelijke coronale snede, die zich mediaal 1 mm uitstrekt van het laterale corticale oppervlak in het vlak van de mammillaire lichamen van de HY. Hier zal para-sagittale incisie in het vlak van het claustrum de PFM bevrijden (figuur 4ix en figuur 4x).
OPMERKING: Op het mediale oppervlak van het resterende hemi-gedeelte van het diencephalon zullen talrijke anatomische kenmerken zichtbaar zijn, waaronder de mammillaire lichamen, de fasciculus retroflexus en de stria medullaris. Er zal een halfrond patroon (dorsale concave zijde) zichtbaar zijn, dat de marge tussen de thalamus en de HY aangeeft. De HY zal gemakkelijk worden geïdentificeerd op de midsagittale sectieweergave volgens het optische chiasme anteroventrale en anterieure commissure anterodorsaal en de mammillaire lichamen samen met de fasciculus retroflexus posteriorly. Deze laatste oriëntatiepunten zijn goed weergegeven in de atlas17 en in albino muis voorhersenen context19. - Maak een gedeeltelijke coronale snede achter de mammillaire lichamen, die zich slechts zijdelings uitstrekt als de hypothalamische sulcus. Op dit punt maakt een parasagittale snede langs de lengte van de hypothalamische sulcus nu de HY vrij .
- Breng de eversie van de laterale ventrikel met zich mee om extra intra-limbische verbindingen en de resterende limbische systeemcomponenten te onthullen. Als u het mediale gezicht van het resterende hemi-gedeelte van het diencephalon bekijkt, is een gebogen tang de beste optie, omdat deze de technicus in staat stelt om rond andere delicate delen van het omliggende gebied te manipuleren die worden gebruikt om de fornix te snijden en in de laterale ventrikel wordt ingebracht en voorzichtig wordt uitgebreid, met behulp van stompe dissectie om de ventrikel te openen en de HC te draaien 90° van het verticale naar het horizontale vlak. Het kan nodig zijn om het # 11-mes te gebruiken om de choroïdale slagader / plexus van het vaatvlies te snijden, omdat de puntige punt kan helpen bij precieze sneden.
- Draai de CNG 90° (maar in de tegenovergestelde richting van de HC) om in het horizontale vlak te zijn. Draai de HC met behulp van een tang voorzichtig 180° naar buiten en zijdelings, waardoor het binnenoppervlak van de ERC zichtbaar en naar boven gericht wordt.
- Een waaierachtige straling van gemyeliniseerde vezels die voortkomen uit de ERC zal worden gezien die convergeert om de hoekige bundel te vormen, inclusief het perforantpad en de aanhechting ervan aan de HC. Draai de thalamus en MB 180° dorsaal om de AY ventraal te onthullen.
- Til indien nodig het optische kanaal op om de bevestiging van de stria terminalis te onthullen, omdat het banden van vezels bevat die langs de laterale marge van het ventriculaire oppervlak van de thalamus naar de AY lopen en de contouren van de AY duidelijk maken.
OPMERKING: De HC en fornix zullen duidelijk zichtbaar zijn in hun geheel, genesteld in de laterale ventrikel en kunnen gemakkelijk worden opgetild. De laterale ventrikel zal bekleed zijn met pia mater en waaierachtige oorsprong van het perforant pad door het zeer transparante subpiale aspect van de ERC zal zichtbaar zijn20. - Het buitenoppervlak van mediale ERC zal een zichtbare prominente laag van grote piramidale cellen hebben. Bovendien zal een dichte convergentie van Golgi-kleuringsvezels een opvallend kenmerk zijn in de mediale ERC. In deze dissectieprocedure, na het everteren van de laterale ventrikel, zullen deze vezels gemakkelijk zichtbaar zijn op het mediale oppervlak door de pia mater, die de binnenoppervlakken van de ventrikels bekleedt en een zeer prominente waaierachtige structuur vormt.
- Merk op dat de vezels zich subpitaal verzamelen, de ventrale ERC afdalen en verlaten, zich naar achteren uitstrekken en vervolgens verticaal stijgen om de HC te perforeren. Deze waaierachtige structuur in de ERC zal worden gebruikt om de marges te definiëren met het oog op dissectie. Identificeren en verwijderen in de volgorde van AY-, ERC-, CNG - en HC-structuren .
OPMERKING: Het definiëren van een goed oriëntatiepunt voor AY-dissectie zal een sleutel zijn voor de volgende stap en de kruising op de achterste marge waar stria terminalis de AY ontmoet, zal een goed punt zijn. - Op dit punt omvatten de resterende structuren de thalamus en de MB. Bevestig de identificatie van de thalamus door visualisatie van de stria medullaris op het dorsale oppervlak dat zich uitstrekt in het middelste rostrocaudale vlak. Scheid de thalamus volledig van de middenhersenen door een coronale cut caudaal naar de habenula en rostral naar de superieure colliculi. Het ROC wordt bij deze stap opgeslagen.
- Op dit punt volledige verzameling van alle hersengebieden en, onmiddellijk (als elk wordt verkregen) opslaan van de monsters flash bevroren tot verdere verwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ons begrip van de complexe hersenstructuur en -functie evolueert en verbetert snel. De hersenen bevatten meerdere verschillende regio's en het bouwen van een moleculaire kaart kan ons helpen beter te begrijpen hoe de hersenen werken. In dit method paper hebben we de dissectie van het muizenbrein in meerdere verschillende regio's besproken (tabel 1). In dit protocol worden de structuren geïdentificeerd op basis van de kritieke oriëntatiepunten en wordt bereikt door het weefsel vochtig te houden met een zoutoplossing door zijn stevigheid te behouden voor onmiddellijke dissectie. De methode bestrijkt meer regio's dan andere rapporten21 en is complementair aan dissectiemethoden met behulp van bevroren hersenen22,23. Deze ontleedde weefsels kunnen later worden bewaard en verwerkt, afhankelijk van de vereisten van het onderzoek. De hier besproken methode is onmiddellijke verwijdering van de hersenen uit de schedel, gevolgd door dissectie die op een snelle manier voldoende weefsel levert voor stroomafwaartse testen gezien de grootte van het muizenbrein. Ons team heeft RNA geëxtraheerd uit meerdere ontleedde weefsels en getest op genexpressieprofilering met behulp van microarrays voor hersenweefsels; AY, HC, MPFC, septum regio, corpus striatum en VS en de resultaten zijn gepubliceerd15. Deze geoogste hersenen werden enkele maanden bewaard bij -80 °C voordat RNA-extractie werd uitgevoerd. Deze methode kan worden toegepast in combinatie met andere methoden om het downstream-nut van hersengebieden te diversifiëren. Deze dissectiemethode is gericht op het volgen van oriëntatiepunten tussen anatomisch verschillende aangrenzende regio's in plaats van strikt coronale of sagittale dissecties. De verschillende hersengebieden samen met gewichtsgegevens werden verzameld in het kader van het studie-agressor blootgestelde sociale stressmodel van PTSS16 en RNA-concentraties samen met spectrofotometrische metingen wordt weergegeven als figuur 5.
Figuur 1: Representatie van muizenhersenen met verschillende weefseltypen verzameld. Deze figuur is een cosmetische weergave van de structuren en wordt niet geschaald naar een in kaart gebrachte database. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hersenverwijdering uit de schedelholte gevolgd door hypofyseverwijdering. Stapsgewijze procedure voor hersenverwijdering (i) klemmen en vasthouden na ontharing (ii) de klem vastzetten met een Kimwipe om haar weg te houden van het weefsel (iii) vóór het verwijderen van spieren (iv) na verwijdering van spieren (v) scheiding van méninges (vi) verwijdering van bol / oog (vii) snijden op orbitale richel (viii) verwijdering van pariëtale en frontale botten (ix) hersenweergave en -verwijdering (x) hersenloslating (xi) hypofysezicht (xii) hypofyseverwijdering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dissectie Setup Station. Deze afbeelding toont de opzet voor hersendissectie na het verwijderen van hersen- en hypofyseweefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hersendissectie. Stapsgewijze procedure voor hersenverwijdering (i) bovenaanzicht van de hersenen (ii) dorsaal zicht op de hersenen (iii) cerebellumverwijdering (iv) cerebrale scheiding (v) hemisfering (vi) olfactorische bolverwijdering (vii) MPFC, FCX en accessoire olfactorische dissectie (viii) SE, VS en ST dissectie (ix) PFM-verwijdering (x) Limbische systeemdissectie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gegevens gegenereerd na monsterverzameling (A) Hersenweefselgewicht en (B) RNA-concentratie en (C) OD 260/280 van elk van de hersenweefsels worden getoond. Hier worden de gegevens verzameld uit controlegroepen (n= 3-6) uit een studiegroep zoals eerder gemeld15,16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| # | Afkortingen | Beschrijving van het hersengebied |
| 1 | Cb | Kleine hersenen |
| 2 | Hb | Hersenstam/achterhersenen (pons en medulla oblongata) |
| Scheid in de twee hemisferen | ||
| 3 | Ob | Olfactorische bollen en accessoire olfactorische bollen |
| 4 | Mpfc | Mediale prefrontale cortex |
| 5 | Fcx | Laterale prefrontale cortex |
| 6 | Se | Septum of septumgebied |
| 7 | Tegen | Ventraal striatum omvat de nucleus accumbens (NAC) en olfactorische tuberkel (OT) |
| 8 | St | Anterieur en posterieur corpus striatum |
| 9 | Hy | Hypothalamus |
| 10 | Pfm | Piriforme cortex |
| 11 | Hc | Hippocampus |
| 12 | Erc | Entorhinale cortex |
| 13 | CNG | Posterieure cingulate cortex |
| 14 | Ay | Amygdala |
| 15 | Mb | Middenhersenen met thalamus |
| 16 | Roc | Rest van de hersenschors |
Tabel 1: Beschrijving van verschillende regio's van muizenhersenen. Deze tabel bevat een lijst van alle hersengebieden verzameld met de afkorting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het zoogdierbrein is een complex orgaan dat bestaat uit een reeks morfologisch verschillende en functioneel unieke cellen met diverse moleculaire handtekeningen en meerdere regio's die gespecialiseerde en discrete functies uitvoeren. De hier gerapporteerde dissectieprocedure kan meerdere doelen hebben, afhankelijk van de vereisten van het laboratorium. In ons lab beoordeelden we transcriptie in meerdere hersengebieden verzameld van muizen die werden blootgesteld aan PTSS zoals stress16 . We willen graag de impact van stamgenetische achtergrond24 op expressieniveaus in meerdere hersengebieden verder bestuderen. Dit protocol heeft meerdere kritieke stappen die moeten worden overwogen voor een succesvolle reproduceerbaarheid van de experimenten. Elk van de gelokaliseerde hersengebieden speelt een duidelijke rol in neuropathologische toestand en gedetailleerde kennis van het juiste hersengebied om te bestuderen ontbreekt. Daarom is het belangrijk om de dataset met betrekking tot het hersengebied te genereren. De gegevens kunnen dus niet alleen worden opgevraagd door hersengebied te selecteren, maar ook door gegevenscategorie (bijv. Transcriptoom, eiwit, cel (cytoarchitecturaal) of andere), wat leidt tot nauwkeurigere informatie. Eerder is aangetoond dat de weefsels zoals reukbol, frontale cortex, striatum en hippocampus in verse hersenweefsels van ratten worden ontleed met behulp van een microscoop25. Afwisselend kunnen secties worden ontleed terwijl de hersenen14 bevroren zijn, gevolgd door RNA- en eiwitextracties, maar deze methode is beperkt tot hersengebieden die kunnen worden geïdentificeerd door duidelijke oriëntatiepunten. Totale RNA-extracties zijn uitgevoerd na microdissectie25 uit belangrijke hersengebieden en met behulp van een niet-laservangstmicroscopiebenadering voor genexpressiestudies13. Hier richten we ons op de dissectie van verse muizenhersenen om de specifieke hersenstructuren te scheiden die specifieke controle hebben over fysiologische en gedragsfuncties. Onze methode verklaart de dissectie van meer regio's dan reeds gepubliceerde rapporten, maar het is een aanvulling op andere beschikbare dissectiemethoden. Deze aanpak kan helpen bij het verstrekken van een uitgebreide beoordeling van de weefsels en de associatie met slopende aandoeningen. Deze dissectiestrategie biedt een haalbare optie voor bestaande strategieën voor het verzamelen van monsters die mogelijkheden bieden voor nieuwe ontdekkingen.
Met de hierin beschreven methode worden hersenweefsels ingevroren in vloeibare stikstof voordat ze worden overgebracht naar -80 °C voor langdurige opslag. Het is belangrijk dat de gereedschappen en weefsels koud worden gehouden tijdens de hele procedure voor het behoud van nucleïnezuren of eiwitten. Deze bevroren weefsels worden later gehomogeniseerd met behulp van laboratoriumstandaard operationele procedures. Sommige van deze hersenweefsels zijn erg klein en voorzichtigheid is geboden tijdens het homogenisatie- en extractieproces om doelmoleculen te beschermen tegen afbraak bij hogere temperaturen.
In dit proces is het belangrijk om duidelijke oriëntatiepunten te identificeren om de specifieke weefselregio's te lokaliseren. Dit wordt bereikt door het weefsel vochtig te houden met een zoutoplossing om te voorkomen dat het snel zacht wordt en zijn stevigheid een tijdje behoudt. Onze eerdere studies vergeleken genexpressieveranderingen tussen controle en agressor blootgestelde muizenweefsels15 en bestudeerden geen veranderingen veroorzaakt door de zoutoplossing die tijdens dissectie werd gebruikt. In onze ervaring is dit vooral belangrijk tijdens de incisie vanaf de hypothalamus en het 180 ° omdraaien als het blootlegt en de regionale scheidingsschaduw van de limbische gebieden (AY, HC, ERC) duidelijk en duidelijker maakt. Het limbisch systeem bevindt zich diep in de hersenen en wordt beschadigd door een verscheidenheid aan stimuli en is daarom diagnostisch en therapeutisch belangrijk. Er bestaat limbisch systeem uit hersengebieden, maar er is geen universele overeenstemming over deze lijst26. Hoewel niet bestudeerd, denken we dat er minimale of geen effecten zijn van zoutoplossinggebruik. Dit komt omdat de hele procedure ongeveer 20 minuten duurt na koude omstandigheden tijdens het hele proces.
Regio's in hersenweefsel worden geïdentificeerd met behulp van oriëntatiepunten die worden genoemd in hersenatlassen. Met behulp van deze techniek moeten de oriëntatiepunten duidelijk zijn en deze procedure moet sequentieel worden uitgevoerd. De dissectie moet gebeuren terwijl de hersenen nog fris en stevig zijn; (moet worden gedaan met de eerste 15 tot 20 minuten) - anders zullen de oriëntatiepunten niet duidelijk zijn en zullen regio's niet duidelijk zijn als de hersenen langer blijven en zachter worden.
Zoals hierboven beschreven, bevinden zich in de hersenen subregio's, die meerdere functionele gebieden bevatten die onafhankelijk of in coördinatie met intrinsieke verbindende netwerken werken. Het is belangrijk om deze regio's met grote precisie op te halen om de brede dimensies ervan te bestuderen. Dit zal helpen om deze concepten te integreren door de gespecialiseerde regio's te combineren waar elk een afzonderlijk proces met een therapeutisch potentieel dient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken mevrouw Seshmalini Srinivasan, de heer Stephen Butler en mevrouw Pamela Spellman voor experimentele hulp en mevrouw Dana Youssef voor het redigeren van het manuscript. De financieringssteun van USAMRDC wordt dankbaar erkend. De Geneva Foundation droeg bij aan dit werk en werd ondersteund door fondsen van het Military and Operational Medicine Research Area Directorate III via het US Army Research Office.
Disclaimer:
Materiaal is beoordeeld door het Walter Reed Army Institute of Research. Er is geen bezwaar tegen de presentatie en/of publicatie ervan. De meningen of beweringen die hierin zijn opgenomen, zijn de privé-opvattingen van de auteur en mogen niet worden opgevat als officieel, of als een weerspiegeling van ware opvattingen van het ministerie van het leger of het ministerie van Defensie. Onderzoek werd uitgevoerd onder een goedgekeurd protocol voor diergebruik in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit in overeenstemming met de Animal Welfare Act en andere federale statuten en voorschriften met betrekking tot dieren en experimenten met dieren en houdt zich aan de principes die zijn vermeld in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NRC-publicatie, editie 2011.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
- P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L.
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
- Spijker, S.
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E.
