Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Plassering, disseksjon og analyse av Murine Stellate Ganglion

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62026
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2, 2,4,5, 3, 1,2,3
1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Summary

Patofysiologiske endringer i hjerte autonominervesystemet, spesielt i sin sympatiske gren, bidrar til utbruddet og vedlikehold av ventrikulære arytmier. I den nåværende protokollen viser vi hvordan man karakteriserer murine stellate ganglia for å forbedre forståelsen av de underliggende molekylære og cellulære prosessene.

Abstract

Det autonome nervesystemet er en betydelig driver for hjerteelektrofysiologi. Spesielt rollen til den sympatiske grenen er et pågående spørsmål om undersøkelse i patofysiologien til ventrikulære arytmier (VA). Nevroner i stellate ganglia (SG)   – bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kjeden –   er en viktig del av den sympatiske infrastrukturen. SG er et anerkjent mål for behandling via hjerte-sympatisk denervasjon hos pasienter med terapi-ildfast VA. Mens nevronal ombygging og glial aktivering i SG har blitt beskrevet hos pasienter med VA, er de underliggende cellulære og molekylære prosessene som potensielt går foran utbruddet av arytmi bare utilstrekkelig forstått og bør belyses for å forbedre autonom modulasjon. Musemodeller lar oss studere sympatisk nevronal ombygging, men identifisering av murin SG er utfordrende for den uerfarne etterforskeren. Dermed mangler dyptgående cellulære og molekylære biologiske studier av murin SG for mange vanlige hjertesykdommer. Her beskriver vi et grunnleggende repertoar for dissekering og studier av SG hos voksne mus for analyser på RNA-nivå (RNA-isolasjon for genuttrykksanalyser, in situ hybridisering), proteinnivå (immunfluorescerende hel monteringsfarging) og cellulært nivå (grunnleggende morfologi, cellestørrelsesmåling). Vi presenterer potensielle løsninger for å overvinne utfordringer i forberedelsesteknikken, og hvordan du kan forbedre farging via slukking av autofluorescens. Dette gjør det mulig å visualisere nevroner samt glialceller via etablerte markører for å bestemme cellesammensetning og ombyggingsprosesser. Metodene som presenteres her gjør det mulig å karakterisere SG for å få ytterligere informasjon om autonom dysfunksjon hos mus utsatt for VA og kan suppleres med ytterligere teknikker som undersøker nevronale og gliale komponenter i det autonome nervesystemet i hjertet.

Introduction

Hjerte autonominervesystemet er en tett regulert likevekt av sympatiske, parasympatiske og sensoriske komponenter som gjør at hjertet kan tilpasse seg miljøendringer med riktig fysiologisk respons1,2. Forstyrrelser i denne likevekten, for eksempel en økning av sympatisk aktivitet, er etablert som en nøkkeldriver for utbruddet, samt vedlikehold av ventrikulære arytmier (VA)3,4. Derfor har autonom modulasjon, oppnådd via farmakologisk reduksjon av sympatisk aktivitet med betablokkere, vært en hjørnestein i behandlingen av pasienter med VA i flere tiår5,6. Men til tross for farmakologiske og kateterbaserte intervensjoner, lider et relevant antall pasienter fortsatt av tilbakevendende VA7.

Sympatiske innspill til hjertet er for det meste mediert via nevronale cellelegemer i stellate ganglia (SG), bilaterale stjerneformede strukturer i den sympatiske kjeden, som videresender informasjon via mange intrathoracic nerver fra hjernestammen til hjertet8,9,10. Nervespirering fra SG etter skade er forbundet med VA og plutselig hjertedød11,12, understreker SG som et mål for autonom modulasjon13,14. En reduksjon av sympatiske innspill til hjertet kan oppnås midlertidig via perkutan injeksjon av lokalbedøvelse eller permanent ved delvis fjerning av SG via videoassistert thoracoskopi15,16. Hjerte sympatisk denervasjon presenterer et alternativ for pasienter med terapi-ildfast VA med lovende resultater14,16,17. Vi har lært av utplantet SG av disse pasientene at nevronal og nevrokjemisk ombygging, nevrobetennelse og glial aktivering er kjennetegn på sympatisk ombygging som kan bidra eller forverre autonom dysfunksjon18,19. Likevel forblir de underliggende cellulære og molekylære prosessene i disse nevronene uklare til dags dato, for eksempel rollen som nevronal transdifferensiering til en kolinerge fenotype20,21. Eksperimentelle studier presenterer nye tilnærminger for å behandle VA, for eksempel reduksjon av sympatisk nerveaktivitet via optogenetikk22, men grundig karakterisering av SG mangler fortsatt i mange hjertepatologier som går i hånd med VA. Musemodeller som etterligner disse patologiene gjør det mulig å studere nevronal ombygging som potensielt går foran utbruddet av arytmier12,23. Disse kan fullføres ved ytterligere morfologiske og funksjonelle analyser for autonom karakterisering av hjertet og nervesystemet. I den nåværende protokollen gir vi et grunnleggende repertoar av metoder som gjør det mulig å dissekere og karakterisere murin SG for å forbedre forståelsen av VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverte dyr ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen i delstaten Hamburg (ORG870, 959) og North Rhine-Westphalian State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection (LANUV, 07/11) og i samsvar med National Institutes of Health's Guide for care and use of Laboratory Animals (2011). Studier ble utført ved hjelp av mannlige og kvinnelige (i alderen 10-24 uker) C57BL / 6 mus (lagernummer 000664, Jackson Laboratories) og mus homozygot (db / db) eller heterozygot (db / het; kontroll) for diabetes spontan mutasjon (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, lagernummer 000642, Jackson Laboratories). Forfatterne har brukt protokollene for hånden uten variasjoner for mus i alderen opptil 60 uker.

1. Plassering og disseksjon av murine stellate ganglia

MERK: Selv om beskrivelser og tegninger for det meste er tilgjengelige i større arter, har noen publikasjoner tidligere beskrevet plasseringen av SG hos rotter24 og mus25 ved hjelp av anatomiske metoder og fluorescerende reporterlinjer.

  1. Forbered 50 ml iskald (3-4 °C) heparinisert (20 enheter/ml, se Tabell over materialer) fosfatbufret saltvann (PBS). Utfør disseksjon av SG ved romtemperatur (RT).
  2. Dyp bedøvet mus ved innånding av 3% -5% isofluran i henhold til institusjonelle og lokale retningslinjer. Kontroller tilstrekkelig anestesi ved tap av pedaluttaksrefleks. Decapitate mus eller utføre cervical dislokasjon.
    MERK: Feil cervical dislokasjon kan føre til brudd i ryggraden og skade på thoraxbeholdere som fører til blødning som hindrer forberedelse eller kutting av den sympatiske kjeden, slik at SG ikke er i riktig posisjon. Derfor er det viktig å ha erfaren personell utføre cervical dislokasjon eller halshugge dyr i dyp sedasjon.
  3. Spray huden med etanol og åpne thoraxen med to snitt langs de fremre aksillære linjene ved hjelp av Mayo saks og smale mønster tang. Klipp membranen og fjern forsiden av ribbeina.
  4. Fjern hjerte-lunge pakken ved å gripe aorta og vena cava rett over membranen ved hjelp av London tang og kutte alle fartøy og bindevev nær ryggraden nedenfor med Strabismus saks.
  5. Skyll thoraxen grundig med heparinisert PBS ved hjelp av en plastisk engangspipette til alle spor av blod er fjernet.
  6. Plasser torsoen under stereomikroskopforberedelses kikkert og sørg for god belysning i thoraxen med eksterne lyskilder.
  7. Finn den første ribben og longus colli musklene.
    MERK: SG er plassert bilateralt, parallelt med ryggraden på grenen mellom første ribbe og ryggrad, i et spor lateral til longus colli muskler24. Den flate siden av SG ligger ved siden av longus colli musklene. Avhengig av preparatet kan deler av den sympatiske kjeden allerede være synlige som hvite, skrå fibre parallelt med ryggraden. Disse kan spores videre til SG.
  8. Bruk forsiktig spissen av Dumont #5/45 tang for å eksponere bindevevet lateral til longus colli muskelen.
  9. Vri tangene rundt med 180° og bruk den flate siden til å gripe SG og trekk den ut med minimalt trykk.
  10. Gjenta med den andre SG.
  11. Legg både SG i en tallerken (6 cm diameter) fylt med kald PBS og inspiser med riktig forstørrelse. Fjern om nødvendig overflødige kar, fettvev og større nerver.
    MERK: Autonome ganglia er omgitt av en bindevevskapsel som består av kollagenfibre og fibroblaster26,27. Permeabiliteten til disse kapslene ser ut til å variere mellom arter, forskjellige typer ganglia26 og alder28. Fjern så mye bindevev som mulig ved hjelp av Dumont #5/45 tang og, om nødvendig, vårsaks.
  12. Avhengig av målet med eksperimentet, fortsett med avsnitt 2, 3 eller 5 i denne protokollen.

2. Hele mount immunhiistokjemi protokoll

MERK: Denne protokollen er tilpasset fra hjerte-hele braketten flekker4,29. Utfør inkubasjonstrinn for hver enkelt SG i en brønn på en 96-brønnsplate og bruk 100 μL (for antistoffholdige løsninger) til 200 μL (for alle andre løsninger) av løsningen for å sikre fullstendig dekning. Kontroller regelmessig dekningen og riktig nedsenking av SG med kikkert. Fjern væsker manuelt med en 200 μL pipette med ytterligere 10 μL spiss på toppen av 200 μL spissen. Dette vil forhindre Aspirasjon av SG i pipettespissen. Bruk nylagde løsninger og sterile væsker for å forhindre bakterievekst.

  1. Fix SG for histologi i 2 timer ved RT i 4% metanolfri paraformaldehyd (PFA)/PBS.
  2. Behandle SG så raskt som mulig, men de kan lagres i 2-4 uker ved 4-6 °C i PBS med 0,02 % (w/v) natriumazid på dette tidspunktet.
  3. Forbered Sudan svart lagerløsning (1% Sudan svart m / v i 100% etanol) for reduksjon av autofluorescence og forbedring av signal-til-bakgrunn-forhold30. Løs opp i 2-3 timer på en magnetisk rører ved RT.
    MERK: Bruk bestandsløsningen i maksimalt 6-8 uker, kast tidligere når sedimentering vises.
  4. Forbered Sudan svart arbeidsløsning ved å sentrifugere lagerløsningen i 30 minutter med full hastighet (13.000 x g)for å fjerne rusk og fortynne bestanden i 70% etanol til en endelig konsentrasjon på 0,25% sudansk svart.
  5. Behandle SG med Dents blekemiddel for å forbedre antistoffpermeabilisering31. Forbered Dents blekemiddel på nytt ved å blande metanol (MeOH), hydrogenperoksidoppløsning 30 % (m/w) i H2O og dimetylsulfoksid (DMSO) i forholdet 4:1:1. Tilsett 200 μL per SG og legg platen på en orbital shaker i 1 time ved RT.
  6. Utfør en synkende MeOH-serie for rehydrering ved å inkubere i 10 minutter hver på en orbital shaker: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. Utfør permeabilisering ved å inkubere SG to ganger i 60 minutter hver i PBS /1% Triton-X-100 ved RT.
  8. Fjern permeabiliseringsløsningen fra SG og legg til Sudans svarte arbeidsløsning. Inkuber i 2 timer ved RT på en orbital shaker.
  9. I mellomtiden, forbered en blokkeringsløsning ved å legge til 5% reseptorklasse bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100 i PBS et 15 ml kar og la det oppløses på en rulle shaker i ca 5-10 min. Dekanter gjennom et forhåndsplemt papirfilter for å fjerne rusk.
  10. Fjern Sudan svart veldig nøye ved å vippe platen og forsiktig pipettering fra oppreist side.
    MERK: Det er ikke mulig å se SG i Sudan svart. Bruk en sterk lyskilde og arbeid sakte. Fra dette trinnet er SG farget svart, noe som forbedrer synligheten. Hvis det ses ekstra bindevev rundt SG på dette tidspunktet, fjern det ved hjelp av Dumont #5/45 tang og vårsaks.
  11. Tilsett 200 μL PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) og vask i 5 min ved RT på en orbital shaker.
  12. Fjern PBS-T ved å aspirere den med en pipette og gjenta 2 ganger.
  13. Fjern PBS; tilsett 200 μL blokkeringsløsning og inkuber ved 4 °C over natten på en orbital shaker.
  14. På neste dag, forberede løsninger ved å legge til primære antistoffer i blokkeringsløsningen. Tilpass antistoffkonsentrasjoner fra etablerte protokoller.
    MERK: Inkluder en SG som antistoffkontroll uten primært antistoff (inkubert med antigenpreabsorbert antistoff eller IgG, hvis tilgjengelig, eller blokkeringsbuffer).
  15. Utfør primær antistoffinkubasjon i 36-48 timer ved 4 °C på en orbital shaker. For måling av cellestørrelse og farging av sympatiske nevroner, bruk antistoffer mot tyrosinhydroksylase (se Tabell over materialer for antistoffanbefalinger).
    MERK: Plasser 96-brønnsplaten i et vått kammer (f.eks. plastboks foret med ddH2O-fuktede papirhåndklær) for å forhindre fordampning på dette tidspunktet.
  16. Fjern antistoffoppløsningen forsiktig og tilsett 200 μL PBS-T. Plasser platen på en orbital shaker i 30 min.
  17. Fjern PBS-T og gjenta vasketrinnet 5 ganger til.
  18. Forbered den sekundære antistoffarbeidsløsningen ved å sentrifuserende fluorescerende Alexa-merkede sekundære antistoffer i 1 min ved full hastighet (13 000 x g) før bruk. Fortynn de aktuelle sekundære antistoffene i henhold til de primære antistoffene 1:500 i blokkeringsløsningen og legg til SG. Tilsett 1 μg/ml bisbenzimid H33342 trihydroklorid (Hoechst-farging) hvis det ønskes kjernefysisk farging. Inkuber i 12-24 timer ved 4 °C på en orbital shaker.
  19. Fjern antistoffoppløsningen nøye og tilsett 200 μL PBS-T. Plasser platen på en orbital shaker i 30 min.
  20. Fjern PBS-T og gjenta vasketrinnet 5 ganger til. For det siste trinnet, bruk PBS uten Triton.
  21. For innebygging sprer du 50-100 μL fluorescerende monteringsmedium (se Materialbord) på en glasssklie og plasseres under tilberedning av kikkert. Bruk Dumont #5/45 tang til å plukke opp SG fra 96-brønnsplaten og fjern overflødig væske ved å dyppe den ene enden på et filterpapir (f.eks. Whatman tørkepute) og legg den på dråpen.
  22. Bruk Dumont #5/45 tang for å korrigere posisjonering med riktig forstørrelse.
  23. Plasser forsiktig en glassdeksle (20 mm x 20 mm) ved siden av SG og senk sakte ned.
    MERK: Bruk av for mye monteringsmedium vil føre til bevegelse av SG eller sammenting av nerver. Hvis det skjer, fjerner du dekslene raskt og gjentar trinn 2.9-2.21.
  24. La lysbildene tørke i mørket over natten på RT. Lagring av den fargede prøven er mulig i minst 4-6 uker ved 4 °C.

3. Full montering in situ hybridisering

MERK: Helmontert in situ-hybridisering av SG er tilpasset fra organet til corti32 og den kommersielle RNA fluorescens in situ-protokollen (se Tabell over materialer). Få sonder for gener av interesse og buffere og løsninger fra leverandøren. Alle inkubasjonstrinn utføres på RT, hvis ikke nevnt ellers. Bruk steril PBS. Hvis du er interessert i å farge flere SG i en brønn, bruk minst 150 μL buffere og løsninger.

  1. Utføre disseksjon av SG som beskrevet i trinn 1.1-1.13.
  2. Fixate SG i 1 t i 200 μL av 4% MeOH-fri PFA / PBS i en brønn av en 96-brønns plate plassert på en orbital shaker.
  3. Vask SG tre ganger i 30 min hver i 0,1% Tween-20/PBS på en orbital shaker.
  4. Dehydrere SG i MeOH/PBS-serien ved etterfølgende inkubasjon i 50% MeOH /PBS, 70% MeOH / PBS og 100% MeOH i 10 minutter hver på en orbital shaker.
  5. Oppbevar SG ved -20 °C i 100 % MeOH over natten.
  6. Neste dag, forvarm inkubatoren til 40 °C. Kontroller temperaturen med et termometer.
  7. Rehydrer SG i omvendt MeOH/PBS-serie (100 % MeOH, 70 % MeOH/PBS, 50 % MeOH/PBS) i 10 minutter hver.
  8. Vask SG tre ganger i 5 min hver i PBS.
  9. I mellomtiden, start forvarming av sondene ved inkubasjon ved 40 °C i 10 minutter, etterfulgt av kjøling i 10 minutter.
  10. Inkuber SG i 200 μL Protease III i 15 min.
  11. Valgfritt: Utfør sudansk svart behandling for å slukke autofluorescens i henhold til pkt. 2.3, 2.4 og 2.8 i denne protokollen hvis etterfølgende immunfluorescensfarging er planlagt.
  12. Vask SG i 200 μL av 0,1% Tween-20/PBS 3x i 5 min hver på en orbital shaker.
  13. Valgfritt: Hvis det ønskes samtidig farging med flere sonder, fortynn Kanal-2 (50x) og Kanal-3-sonde (50x) i Kanal-1-sonden (1x).
  14. Dekk SG med 100 μL sonde for genet av interesse og inkuber over natten ved 40 °C med liten agitasjon. Plasser 96-brønnsplaten i et vått kammer ved 40 °C for alle inkubasjonstrinn.
    MERK: Inkluder en SG som negativ kontroll, ved hjelp av en sonde mot et bakteriell gen (f.eks. dihydro-dipicolinate reduktase, Dapb) for å se etter ikke-spesifikk binding av forsterkningsreagenser i senere trinn.
  15. Vask SG i medfølgende vaskebuffer 3x i 15 min hver på en orbital shaker.
  16. Forvarm Amp1-3, HRP-C1 og HRP-Blocker til RT. Hvis det ønskes samtidig farging med Kanal-2- og/eller Kanal-2-proben, må HRP-C2 og HRP-C3 forvarmes.
  17. Re-fix SG i 10 min på RT i 4% PFA / PBS på en orbital shaker.
  18. Vask SG i 200 μL med medfølgende vaskebuffer 3x i 5 minutter hver på en orbital shaker på RT.
  19. For forsterkning, inkuber SG med 100 μL Amp1 i 35 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  20. Fjern forsiktig væske og vask SG i 200 μL med medfølgende vaskebuffer 3x i 5 minutter hver på RT på en orbital shaker.
  21. Inkuber SG med 100 μL Amp2 i 35 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  22. Gjenta trinn 3.18.
  23. Inkuber SG med 100 μL Amp3 i 20 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  24. Gjenta trinn 3.18.
  25. Inkuber SG med 100 μL med medfølgende Multiplex FL v2 HRP-C1 i 20 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  26. Gjenta trinn 3.18.
  27. Forbered Opal-konjugert sekundært antistoff 1:1000 i 200 μL levert TSA-buffer og inkuber SG i 35 min ved 40 °C på en orbital shaker. Beskytt mot lys under inkubasjon og fra dette trinnet på.
  28. Gjenta trinn 3.18.
  29. Inkuber SG i 100 μL med medfølgende Multiplex FL v2 HRP-blokkering i 15 min ved 40 °C på en orbital shaker.
  30. Gjenta trinn 3.18.
  31. Valgfritt: Gjenta trinn 3.25-3.30 med medfølgende Multiplex FL v2 HRP-C2 for samtidig farging med Channel-2-proben.
  32. Valgfritt: Gjenta trinn 3.25-3.30 med medfølgende Multiplex FL v2 HRP-C3 for samtidig farging med Channel-3-proben.
  33. Ved påfølgende immunfluorescerende farging, utfør trinn 2.13-2.25 i denne protokollen.
  34. Inkuber i 1% BSA / PBS i 30 min på en orbital shaker.
  35. Inkuber SG i 30 min i 1 μg/ml bisbenzimid H33342 trihydrochloride (Hoechst farging) i 1% BSA/PBS hvis kjernefysisk farging er ønsket og/eller tilsett Alexa-koblet hvetekim agglutinin (WGA, 1:500) på en orbital shaker.
  36. Gjenta trinn 3.18.
  37. Bygg inn som beskrevet i trinn 2.19-2.22.

4. Avbildning og analyser av murine stellate ganglia

  1. Utfør konfiskert mikroskopi av innebygd SG i det lokale bildebehandlingsanlegget.
  2. Hvis det kreves måling av cellestørrelse, kan du se bildet SG farget for tyrosinhydroksylase (se Materialfortegnelse) ved 200x forstørrelse og ta 4-6 tilfeldige bilder fra hver SG.
  3. Analyser bilder ved hjelp av ImageJ33-programvare for å beregne cellestørrelse (se Materialfortegnelsemed pennetabell ). Bruk Valg av fri hånd, sirkle rundt hver celle og klikk på Analyser | Mål for å få celleområde. Pass på at du bare inkluderer intakte, fullt synlige celler som ligger godt innenfor SG.
  4. Bruk denne metoden til å utføre måling av ca. 100 celler per SG.
  5. Få en blindet undersøker til å utføre trinn 4.2-4.3 hvis du vil sammenligne SG fra forskjellige mus. Bruk en frekvensfordeling i statistisk programvare til å visualisere størrelsesforskjeller mellom gruppe34.

5. Molekylære analyser av murine stellate ganglia

MERK: Inkluder kontroller avhengig av eksperimentell design. Dette kan være SG med forskjellige genotyper og sykdomsbakgrunn og / eller andre autonome ganglia, for eksempel den sympatiske overlegne cervical ganglion (som ligger i nakkeområdet, se detaljert beskrivelse i Ziegler et al.35) eller parasympatisk ganglia (som intrakariac ganglia, se Jungen et al.4).

  1. Forbered et 2 ml rør med 500 μL fenol/guanidintiocyanatoppløsning (f.eks. Qiazol) per dyr og ha flytende nitrogen klar for støtfrosning eller vurder kommersielle løsninger for beskyttelse av RNA (valgfritt, se Materialfortegnelse)36. Arbeid raskt for RNA-isolasjon.
  2. Utføre disseksjon av SG som beskrevet i trinn 1.1-1.13.
  3. Senk umiddelbart både SG direkte ned i ett rør med fenol/guanidintiocyanatoppløsning og støt-frostrør i flytende nitrogen.
  4. Oppbevars ved -80 °C til videre behandling.
  5. For vevslys, la rør med SG tine til fenol / guanidin tiocyanatoppløsning er flytende og tilsett to 7 mm rustfrie stålperler. Avkjøl metalldelene av vevshomogenisator (kule- eller miksermølle, for eksempel Tissue Lyser II) på tørris og sentrifuge ved 4 °C.
  6. Sentrifugerør ved 500 x g i 1 min ved 4 °C slik at SG er nederst på røret.
  7. Sett rør inn i metalldelene på Tissue Lyser og lyse i 1 min ved 20 Hz.
  8. Gjenta trinn 5.6 og 5.7 opptil 5 ganger til ingen intakt vev kan påvises.
  9. Overfør væsken til et friskt 1,5 ml rør.
  10. Utfør RNA-isolasjon med et kolonnebasert RNA-isolasjonssett (f.eks. miRNeasy minisett) i henhold til produsentens instruksjoner.
  11. Elute RNA i 20 μL RNase-fritt vann og måle konsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer.
    MERK: For å utelukke kontaminering av renset RNA med genomisk DNA foreslår vi å utføre en polymerasekjedereaksjon med genomiske primere og 1 μL RNA som mal, i stedet minus omvendt transkripsjonskontroll. Dette vil spare en betydelig mengde RNA. Hvis RNA er forurenset, bruk exon-intron grenseprimere eller intron flankende primere for etterfølgende kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon.
  12. Bruk 250 ng SG RNA til å utføre cDNA-syntese og bruke etablerte protokoller. Her ble et cDNA omvendt transkripsjonssett med høy kapasitet brukt i henhold til produsentens instruksjoner.
  13. Fortynn til en endelig konsentrasjon på 2,5 ng/μL cDNA og utfør kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon med de aktuelle sondene i henhold til de etablerte protokollene. Her ble TaqMan Assay (se Materialliste) utført ved hjelp av 10 ng cDNA per reaksjon.
    MERK: Utfør ingen malkontroll for hvert gen for å utelukke falske positive resultater.
  14. Normaliser genuttrykk av ditt gen av interesse for et hus som holder gen (f.eks. Cdkn1b) for å sammenligne relativt genuttrykk mellom ulike grupper av SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visualiserer hvordan man identifiserer og dissekerer SG. Figur 1A viser en skjematisk tegning av stedet, mens figur 1B presenterer utsikten inn i thoraxen etter fjerning av hjerte-lunge-pakken. Venstre og høyre longus colli muskler medial fra SG og ribbeburet er viktige landemerker for orientering. Disseksjon utføres langs de stiplede linjene mellom muskler og den første ribben. SG og den sympatiske kjeden blir synlige som hvite strukturer (Figur 1C). Figur 1D viser en forstørrelse av regionen mellom venstre longus colli muskel og den første ribben, hvor venstre SG ligger. Morfologien til SG er forskjellig mellom individer. Det består ofte av en sammensmelting av den dårligere cervical og den første til den tredje thoracic ganglia24. Noe variasjon som eksperimentet kan forvente i murine SG er avbildet i Figur 1E, F, hvor venstre og høyre SG av fem mannlige C57Bl6 wild type mus er fotografert.

Evaluering av brutto anatomisk oversikt, samt cellulære og subcellulære analyser av celler i SG som innerverer hjertet, kan utføres ved hjelp av hele monteringsteknikker på protein- og RNA-nivå. En oversikt over en SG presenteres i figur 2. Myokardiske sympatiske fibre stammer fra cellelegemer i SG. Disse visualiseres ved farging med et antistoff mot tyrosinhydroksylase (TH). TH-uttrykkende nevronal somata er omgitt av nervefibre som flekker positivt for kolin acetyltransferase (ChAT). Dette er mest sannsynlig presynaptiske fibre37,38. En eksemplarisk forstørrelse fra TH- og ChAT-komerking presenteres i figur 2A. Glialceller rundt nevronale cellelegemer kan visualiseres ved farging for S100B. Dette er avbildet i figur 2B i kombinasjon med nevralmarkøren PGP9.5. Figur 2C-F viser eksemplariske analyser for å studere SG på et subcellulært nivå, ved hjelp av full montering in situ hybridisering og immunfluorescent co-farging. Proteinet TH (Figur 2C, rød) og mRNA molekyler av Tubb3 (Figur 2D, hvit) uttrykkes i store nevroncellelegemer, mens mRNA av S100b (Figur 2E, grønn) også kan påvises i omkringliggende gliaceller. I sammenslåingen (figur 2F) er det synlig at noen nevroner er negative for TH, men uttrykker Tubb3, mens S100b mRNAer også kan påvises i omkringliggende celler, som vist i forstørrelsen i figur 2G.

Figur 3 presenterer potensielle kvantitative analyser og fallgruver for å studere murin SG. Bilder fra TH-farget SG (Figur 3A) kan brukes til cellestørrelsesmålinger som ble utført eksemplarisk for en musemodell av diabetes. Neuronal somata fra kontroll (db/het) SG var 388,8 ± 123,8 μm2 vs. i diabetisk SG (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (Figur 3B, n = 2 SG, 100 celler per SG per genotype, P = 0,348, data ble sammenlignet med Mann-Whitney-test). Figur 3C viser uttrykk for gener fra ulike celletyper av SG (n = 6-7). Sammenslåing av både SG fra ett dyr tillater genuttrykksmålinger på ca. 24 analyser (12 gener i duplikater). Vi normaliserer vanligvis prøver for Cdkn1b (påvist ved Ct-verdier på 25,4 ± 0,97) samt nevronmarkøren Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7) hvis det er nødvendig å ta hensyn til andre celletyper og nevronal renhet av disseksjonen. Gener som vi fant nyttige for å karakterisere molekylære prosesser i SG inkluderer det sympatiske genet Th (22,4 ± 1,6), Chat, som kan indikere kolinerge transdifferensiering (uttrykt ved Ct-verdier på 30,8 ± 1,3) og Gap43, en markør for nevronal spiring (detekterbar ved Ct-verdier på 22,4 ± 1,4). Gener uttrykt i ikke-nevronal celletype inkluderer S100b (for glialceller, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (for spredningsceller, 33,0 ± 1,6) og Cd45 (for immunceller, 30,2 ± 1,1).

SG er omgitt av en kapsel bindevev26, visualisert via hematoksylin og eosinfarging i figur 3D,E. Av og til observerte vi inkonsekvenser i antistoffbasert farging som vist i figur 3F, mest sannsynlig på grunn av ufullstendig fjerning av kapselen. Selv om ChAT- og TH-farging bare kan påvises i enkelte deler av SG, kan kjerner som er motstått med DAPI, påvises overalt. Den prikkede linjen i det sammenslåtte bildet skiller vellykket farging (til høyre for linjen) fra mislykket farging (til venstre for linjen).

Data presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik. Statistisk signifikans ble definert som en P-verdi på <0,05; statistisk analyse ble utført ved hjelp av kommersiell programvare.

Figure 1
Figur 1: Plassering, disseksjon og morfologi av murine stellate ganglia. (A) Skjematisk tegning av plasseringen av stellate ganglia (SG). (B) Se inn i thoraxen etter fjerning av hjerte-lunge-pakken. Det er viktig å merke seg at SG ikke umiddelbart er synlig mesteparten av tiden. Longus colli musklene ligger lateral fra ryggraden. SG ligger lateral fra musklene i krysset med den første ribben. Disseker forsiktig lateral til musklene (område preget av prikket linje) for å avdekke ganglia. Etter disseksjon kan ganglia (henholdsvis venstre og høyre, LSG og RSG) og den sympatiske kjeden utgis som hvite, lange strukturer. (C) En eksemplarisk disseksjon som viser ganglia og anatomiske landemerker. (D) Forstørrelse av LSG. (E) LSG og (F) RSG fra vill type, mannlige C57Bl6 mus (16 uker) ble dissekert og fotografert for å vise variasjoner i morfologi og størrelse. Skalalinjen representerer 1000 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Visualisering av ulike celletyper i murine stellate ganglia via helmontert immunhiistokjemi og in situ hybridisering. (A) Brutto oversikt over en murine stellate ganglion (SG) farget for den sympatiske markøren tyrosinhydroksylase (TH) og kolin acetyltransferase (ChAT). Forstørrelsen viser TH-positive cellelegemer og tilstedeværelsen av ChAT-positive, mest sannsynlig presynaptiske, nervefibre rundt nevronal somata. (B) Glial celler som omkranser nevronale cellelegemer kan visualiseres ved farging for S100B, her i kombinasjon med nevronmarkøren PGP9.5. (C,D,E,F) Mikroskopiske bilder fra en SG farget hele braketten via en kombinasjon av immunhiistokjemi for TH (rød) og in situ hybridisering for Tubb3 (D, hvit) og S100b (E, grønn). Nuclei er kontrastained med DAPI (blå). (F) Sammenslåingen viser at ikke alle nevronale (Tubb3-positive) celler er TH positive. S100b mRNAer kan påvises innenfor nevronal somata, men også omkringliggende celler, som merket med en pil i forstørrelsen i (G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Potensielle kvantitative analyser og fallgruver. (A) Bilder fra Tyrosin-hydroksylase (TH)-farget SG kan brukes til måling av cellestørrelse ved hjelp av ImageJ. (B) Dette ble utført i en musemodell av diabetes (100 celler per SG, n = 2 SG per genotype, data ble sammenlignet med Mann-Whitney test). (C) Eksemplariske gener uttrykt i SG som kan være nyttige for å karakterisere molekylære prosesser. Cdkn1b samt nevronmarkøren Neun / Rbfox3 (for å ta hensyn til tilstedeværelsen av andre celletyper) kan brukes til normalisering. Tyrosinhydroksylase (Th) fungerer som en sympatisk markør, kolin acetyltransferase (Chat) for kolinerge transdifferentiasjon, Gap43 for nevronal spiring. Gener uttrykt i ikke-nevronale celletyper inkluderer S100b (glialceller), Ki-67 (proliferaterende celler) og Cd45 (immunceller). (D) Hematoksylin og eosinfarging av en formalin-fast SG visualiserer bindevev og celler på toppen av SG. (E) Forstørrelse fra innrammet område. (F) Ved noen anledninger observerte vi svikt i antistoffbasert farging, mest sannsynlig på grunn av ufullstendig fjerning av kapselen. Selv om ChAT (rød) og TH (grønn) farging bare kan påvises i enkelte deler av SG, kan kjerner som er motstående med DAPI (mørkeblå) påvises overalt. Den prikkede linjen i det sammenslåtte bildet skiller vellykket farging (til høyre for linjen) fra mislykket farging (til venstre for linjen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelsen av cellulære og molekylære prosesser i nevroner og glialceller i det sympatiske nervesystemet som kommer før utbruddet av VA, er av høy interesse, da plutselig hjertestans forblir den vanligste dødsårsaken over hele verden5. Derfor, i det nåværende manuskriptet, gir vi et grunnleggende repertoar av metoder for å identifisere murin SG - et murinelement i dette nettverket - og utføre påfølgende analyser på RNA, protein og cellulært nivå.

En utfordring med murine SG er størrelsen og det begrensede antall celler39. På grunn av dette brukes forskjellige dyremodeller, som rotter40, hunder22og griser41 til studier på SG. Likevel er det en rekke veletablerte sykdomsmodeller for hjertefenotyper tilgjengelig hos mus, og noen av disse har allerede blitt karakterisert i forskjellige aspekter av hjerteinternasjon og arytmi, for eksempel modeller for diabetes23, hjerteinfarkt42, eller myokarditt43. Derfor er videre studier av murin SG garantert å ytterligere karakterisere autonom dysfunksjon i lys av VA. Disse kan fullføres ved andre tilnærminger for å studere innervasjon av murinhjertet som funksjonelle eksperimenter4,23,44 inkludert in-vivo stimulering av SG23.

På grunn av sin lille størrelse og beliggenhet i thoracic hulrommet24, er manipulering av murin SG in vivo utfordrende, selv om den har blitt utført vellykket23. Av denne grunn fokuserer noen studier derfor på den overlegne Cervical ganglia, som ligger mer tilgjengelig i nakken, oppstrøms SG i den sympatiske kjeden bak karotisbifurkasjonen i interne og eksterne karotisarteriarterarter24,35. Hjerte denervasjon via fjerning av den overlegne Cervical ganglia har vist seg å dempe myokardbetennelse, hypertrofi og hjertedysfunksjon etter hjerteinfarkt35. Det er imidlertid viktig å merke seg at den overlegne Cervical ganglia innervate forskjellige regioner i hjertet, mest fremtredende den fremre siden45. I tillegg kom en nylig grundig litteraturgjennomgang til den konklusjon at rollen som Cervical ganglia på sympatisk innervering av hjertet forblir uklar hos mennesker46. Dette understreker viktigheten av å karakterisere SG for studier av hjerte sympatisk innervering.

Det er viktig å merke seg at hjertet ikke er det eneste målet for SG. Blant annet er lunger47 og svettekjertler i forepaw48 også innervated fra fibre som stammer fra SG, sistnevnte er et unntak fra sympatisk fysiologi da de uttrykker kolin acetyltransferase37. Midlertidig blokade av SG studeres med hensyn til inflammatoriske prosesser i akutt lungeskade49 eller for behandling av hetetokter og søvndysfunksjon50; Derfor kan de aktuelle protokollene tilby et repertoar for mekanistiske spørsmål på disse feltene. Når du fokuserer på hjertesykdomsmodeller, bør du huske på tolkning av resultater at hjertenevroner ikke kan skilles av morfologi eller elektrofysiologiske egenskaper fra ikke-hjertenevroner51. Dette kan oppnås ved retrogradsporing, og dermed ble plasseringen av nevroner som projiserer til hjertet vist seg å være plassert i kranio-mediale deler av SG52.

I tillegg er det viktig å merke seg at i tillegg til forskjellige typer nevroner, består sympatisk ganglia av ensheathing glia, såkalte satellitt glialceller eller satellittceller preget av uttrykk for glialmarkøren S100B53. Mens lite er kjent om disse cellenes rolle i kardiovaskulære patologier, har glialaktivering og uttrykk for glialflimmersyreproteinet (GFAP) blitt beskrevet i SG fra pasienter med arytmier18.

Noen fallgruver bør huskes med de presenterte metodene: Vi observerte inkonsekvenser i antistoffbasert farging ved noen anledninger og hypoteset om at ufullstendig fjerning av bindevevskapselen som omslutter SG, kan være feil, da de har blitt beskrevet å variere i permeabilitet blant forskjellige typer ganglia26. Mekanisk fjerning av kapselen ved hjelp av fine tang har blitt beskrevet i overlegen cervical ganglion av rotter opp til postnatal dag 1028 og desheathing er nevnt i litteratur for voksen rotte SG54,55 og mus56. Fjerning av SG-kapselen kan variere mellom28 år og – på grunn av størrelsesforskjeller – arter. Vår erfaring er at fersk disseksjon, fjerning av så mye bindevev som mulig ved bruk av fine tang og grundig permeabilisering som beskrevet i den aktuelle protokollen, er viktige faktorer for vellykket farging. Når det gjelder kvantitativ PCR i sanntid, er raskt arbeid og effektiv lysis avgjørende. Sammenslåing av begge bærekraftsmålene fra ett dyr tillot pålitelig analyse av opptil 12 forskjellige gener (ved utførelse av duplikater).

Selv om funksjon og brutto anatomi av SG har blitt studert i flere tiår nå, og hver eneste kardiomyocytt er innervated av sympatiske fibre46, mange åpne spørsmål gjenstår. For eksempel er det fortsatt uklart, hvorfor sympatiske nevroner av SG transdifferentiate forbigående til en kolinerge fenotype i iskemisk21 og ikke-iskemisk hjertesvikt, i dyremodeller så vel som hos pasienter20. Nylig beskrev gruppen vår en rolle av S100B-positive glialceller, som også er til stede i murin SG, på nervespirering i hjertenervesystemet29. Hvorvidt disse cellene er relevante for sympatisk nervespirering etter skade forbundet med VA11,12, må belyses i fremtidige studier. Det er viktig at innovative tilnærminger, som optogenetikk52 og transkripsjonsanalyser36, kan utfylle etablerte metoder som nevronsporing for å utdype forståelsen av det sympatiske nervesystemet og dets rolle i hjerteelektrofysiologi.

Til slutt tillater dette repertoaret den uerfarne undersøkeren å utføre en grunnleggende karakterisering av SG i murinmodeller av hjertepatologier. Vi håper at dette vil stimulere bruken, kombinasjonen og etableringen av nye metoder. Dette kan bidra til å øke forståelsen av de underliggende cellulære og molekylære prosessene i sympatiske nevroner som kan være ansvarlige for utbruddet og vedlikeholdet av VA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Hartwig Wieboldt for hans utmerkede tekniske assistanse, og UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf for å gi mikroskoper og støtte. Denne forskningen ble finansiert av DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) [FKZ 81Z4710141].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate TPP 92097 RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm R. Langenbrinck 03-0060 Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. Serva 11924.03 Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA B2261 Whole mount staining
Chicken anti neurofilament EMD Millipore AB5539 Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck, KGA, Darmstadt, Germany D8418 Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647  Merck, KGA, Darmstadt, Germany AP194SA6 Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568  Thermo Fisher Scientific A11057 Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488  Thermo Fisher Scientific A21206 Whole mount staining
Drying block 37-100 mm Whatman (Sigma Aldrich) WHA10310992  Whole mount staining
Eosin Y Sigma Aldrich E4009 Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) Th.Geyer 2212.5000 Whole mount staining
Eukitt mounting medium AppliChem 253681.0008 Whole mount staining
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI Southern Biotech 0100-20 Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase EMD Millipore AP144P Whole mount staining
H2O2 30% (w/w) Merck, KGA, Darmstadt, Germany H1009 Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml Rotexmedica PZN: 3862340 Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit Life technologies  4368813 RNA isolation
Isoflurane (Forene) Abbott Laboratories 2594.00.00 Preparation SG
Mayer's hemalum solution Merck 1.09249.0500 Whole mount staining
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller Marienfeld 0101040 Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA isolation
NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific ND-2000C RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack Akoya Bioscience FP1488001KT RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free  Alfa Aesar 43368 Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm Th.Geyer 7691202 Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets Gibco 18912-014 Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps FineScienceTools 11203-25 Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent Qiagen  79306 RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Whole mount staining
RNAlater Merck R0901-100ML RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 biotechne (ACD) 323100 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 biotechne (ACD) 431738-C2 RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 biotechne (ACD) 423391 RNAscope
Stainless steel beads 7 mm  Qiagen  69990 RNA isolation
Sudan black B Roth 0292.2 Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) Thermo Fisher Scientific 4331182 Gene expression analysis
TaqMan mastermix Applied biosystems 4370074 Gene Expression analysis 
Tissue Lyser II Qiagen 85300 RNA isolation
Triton X-100 10% solution Sigma-Aldrich 93443-100ml Whole mount staining
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ML RNAscope
Wacom bamboo pen Wacom CTL-460/K Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 Sigma-Aldrich WHA10311647 Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 RNAscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Tags

Medisin Utgave 166 sympatisk nervesystem stellate ganglia intrakariac autonomt nervesystem ventrikulær arytmi nevromorfologi elektrofysiologi
Plassering, disseksjon og analyse av Murine Stellate Ganglion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scherschel, K., Bräuninger, H., … More

Scherschel, K., Bräuninger, H., Glufke, K., Jungen, C., Klöcker, N., Meyer, C. Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion. J. Vis. Exp. (166), e62026, doi:10.3791/62026 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter