Summary
Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Abstract
Le système nerveux autonome est un moteur important de l’électrophysiologie cardiaque. Particulièrement le rôle de sa branche sympathique est une question continue de recherche dans la pathophysiologie des arythmies ventriculaires (VA). Les neurones dans les ganglions étoilés (SG) – structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique – sont une composante importante de l’infrastructure sympathique. Le SG sont une cible identifiée pour le traitement par l’intermédiaire de l’énervation sympathique cardiaque dans les patients présentant le VA thérapie-réfractaire. Tandis que la retouche neuronale et l’activation glial dans le SG ont été décrites dans les patients présentant le VA, les processus cellulaires et moléculaires fondamentaux qui précèdent potentiellement le début de l’arythmie sont seulement insuffisamment compris et devraient être élucisés pour améliorer la modulation autonome. Les modèles murins nous permettent d’étudier le remodelage neuronal sympathique, mais l’identification du SG murin est difficile pour l’investigateur inexpérimenté. Ainsi, les études biologiques cellulaires et moléculaires approfondies du SG murin font défaut pour beaucoup de maladies cardiaques communes. Ici, nous décrivons un répertoire de base pour disséquer et étudier le SG chez les souris adultes pour des analyses au niveau de l’ARN (isolement de l’ARN pour les analyses d’expression génique, hybridation in situ), au niveau des protéines (coloration immunofluorescente de monture entière) et au niveau cellulaire (morphologie de base, mesure de la taille cellulaire). Nous présentons des solutions potentielles pour surmonter des défis dans la technique de préparation, et comment améliorer la souillure par trempe de l’autofluorescence. Cela permet la visualisation des neurones ainsi que des cellules gliales via des marqueurs établis afin de déterminer la composition cellulaire et les processus de remodelage. Les méthodes présentées ici permettent de caractériser le SG pour obtenir davantage d’informations sur le dysfonctionnement autonome chez les souris sujettes à VA et peuvent être complétées par des techniques supplémentaires étudiant les composants neuronaux et glial du système nerveux autonome dans le coeur.
Introduction
Le système nerveux autonome cardiaque est un équilibre étroitement régulé de composants sympathiques, parasympathiques et sensoriels qui permet au cœur de s’adapter aux changements environnementaux avec la réponse physiologique appropriée1,2. Des perturbations dans cet équilibre, par exemple, une augmentation de l’activité sympathique, ont été établies comme un facteur clé pour l’apparition ainsi que le maintien des arythmies ventriculaires (VA)3,4. Par conséquent, la modulation autonome, réalisée par l’intermédiaire de la réduction pharmacologique de l’activité sympathique avec des bêta-bloquants, a été une pierre angulaire dans le traitement des patients avec VA pendant des décennies5,6. Mais malgré les interventions pharmacologiques et à base de cathéter, un nombre pertinent de patients souffre toujours de VA7récurrent.
L’entrée sympathique au cœur est principalement médiée par l’intermédiaire de corps cellulaires neuronaux dans les ganglions étoilés (SG), structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique, qui relaient l’information via de nombreux nerfs intrathoraciques du tronc cérébral au cœur8,9,10. Le nerf germant du SG après blessure est associé à va et à la mort cardiaque subite11,12,soulignant le SG comme cible pour la modulation autonome13,14. Une réduction de l’apport sympathique au coeur peut être réalisée temporairement par injection percutanée d’anesthésiques locaux ou de façon permanente par retrait partiel du SG par thoracoscopie vidéo-assistée15,16. L’énervation sympathique cardiaque présente une option pour des patients présentant le VA thérapie-réfractaire avec des résultats prometteurs14,16,17. Nous avons appris de SG explanted de ces patients que le remodelage neuronal et neurochimique, la neuro-inflammation et l’activation glial sont des cachets du remodelage sympathique qui pourrait contribuer ou aggraver le dysfonctionnement autonome18,19. Pourtant, les processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans ces neurones restent obscurs à ce jour, par exemple, le rôle de la transdifférenciation neuronale dans un phénotype cholinergique20,21. Les études expérimentales présentent des approches nouvelles pour traiter l’AV, par exemple, la réduction de l’activité nerveuse sympathique via l’optogénétique22, mais la caractérisation en profondeur du SG fait encore défaut dans de nombreuses pathologies cardiaques qui vont de pair avec l’AV. Des modèles murins imitant ces pathologies permettent d’étudier le remodelage neuronal qui précède potentiellement l’apparition d’arythmies12,23. Ceux-ci peuvent être complétés par d’autres analyses morphologiques et fonctionnelles pour la caractérisation autonome du coeur et du système nerveux. Dans le protocole actuel, nous fournissons un répertoire de base des méthodes permettant de disséquer et de caractériser le SG murin pour améliorer l’entente de VA.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’État de Hambourg (ORG870, 959) et l’Agence d’État de Rhénanie-du-Nord-Westphalie pour la protection de la nature, de l’environnement et des consommateurs (LANUV, 07/11) et sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011) des National Institutes of Health. Les études ont été réalisées sur des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 10 à 24 semaines) (numéro de stock 000664, Jackson Laboratories) et des souris homozygotes (db/db) ou hétérozygotes (db/het; contrôle) pour la mutation spontanée du diabète (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, numéro de stock 000642, Jackson Laboratories). Les auteurs ont utilisé les protocoles à portée de main sans variations pour les souris âgées jusqu’à 60 semaines.
1. Emplacement et dissection des ganglions radiés murins
REMARQUE: Même si les descriptions et les dessins sont principalement disponibles chez les espèces plus grandes, certaines publications ont déjà décrit l’emplacement du SG chez les rats24 et les souris25 en utilisant des méthodes anatomiques et des lignes rapporteurs fluorescentes, respectivement.
- Préparer 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) héparinisée (3-4 °C) (20 unités/mL, voir la table des matières)tamponnée au phosphate (PBS). Effectuer la dissection du SG à température ambiante (TA).
- Anesthésier profondément la souris par inhalation de 3%-5% d’isoflurane selon les directives institutionnelles et locales. Vérifier une anesthésie adéquate par perte de réflexe de retrait de la pédale. Décapiter les souris ou effectuer une luxation cervicale.
REMARQUE: Une luxation cervicale incorrecte peut entraîner une rupture de la colonne vertébrale et des dommages aux vaisseaux thoraciques conduisant à des saignements qui entravent la préparation ou la section de la chaîne sympathique, de sorte que les SG ne sont pas dans leur position correcte. Par conséquent, il est essentiel que le personnel expérimenté effectue une luxation cervicale ou décapite des animaux sous sédation profonde. - Vaporisez la peau avec de l’éthanol et ouvrez le thorax avec deux incisions le long des lignes axillaires antérieures à l’aide de ciseaux Mayo et de pinces à motif étroit. Coupez le diaphragme et retirez l’avant de la cage thoracique.
- Retirez l’emballage cœur-poumon en saisissant l’aorte et la veine cave juste au-dessus du diaphragme à l’aide de pinces de Londres et en coupant tous les vaisseaux et le tissu conjonctif près de la colonne vertébrale ci-dessous avec les ciseaux de strabisme.
- Rincer soigneusement le thorax avec du PBS héparinisé à l’aide d’une pipette jetable en plastique jusqu’à ce que toutes les traces de sang soient enlevées.
- Placez le torse sous des jumelles de préparation de stéréomicroscope et assurez un bon éclairage dans le thorax avec des sources de lumière externes.
- Localisez la première côte et les muscles du longus colli.
NOTE : Les SG sont situés bilatéralement, parallèlement à la colonne vertébrale au niveau de la branche entre la première côte et la colonne vertébrale, dans une rainure latérale aux muscles longus colli24. Le côté plat du SG est situé à côté des muscles longus colli. Selon la préparation, des parties de la chaîne sympathique peuvent déjà être visibles sous forme de fibres blanches et obliques parallèles à la colonne vertébrale. Ceux-ci peuvent être tracés le long du SG. - Utilisez doucement la pointe de la pince Dumont #5/45 pour exposer le tissu conjonctif latéral au muscle longus colli.
- Tournez la pince de 180 ° et utilisez le côté plat pour saisir le SG et le retirer avec une pression minimale.
- Répétez l’opération avec le deuxième SG.
- Placez les deux SG dans une capsule (6 cm de diamètre) remplie de PBS froid et inspectez avec le grossissement approprié. Si nécessaire, enlevez les vaisseaux en excès, le tissu adipeux et les nerfs plus gros.
NOTE: Les ganglions autonomes sont entourés d’une capsule de tissu conjonctif constituée de fibres de collagène et de fibroblastes26,27. La perméabilité de ces capsules semble varier selon les espèces, différents types de ganglions26 et âge28. Retirez autant de tissu conjonctif que possible à l’aide de pinces Dumont #5/45 et, si nécessaire, de ciseaux à ressort. - Selon l’objectif de l’expérience, passez à la section 2, 3 ou 5 de ce protocole.
2. Protocole d’immunohistochimie de montage entier
NOTE : Ce protocole est adapté des colorations cardiaques de montage entier4,29. Effectuer des étapes d’incubation pour chaque SG dans un puits d’une plaque de 96 puits et utiliser 100 μL (pour les solutions contenant des anticorps) à 200 μL (pour toutes les autres solutions) de la solution pour assurer une couverture complète. Vérifiez régulièrement la couverture et l’immersion correcte du SG avec des jumelles. Retirez les liquides manuellement à l’munis d’une pipette de 200 μL avec une pointe supplémentaire de 10 μL au-dessus de la pointe de 200 μL. Cela empêchera l’aspiration du SG dans la pointe de la pipette. Utilisez des solutions fraîchement préparées et des liquides stériles pour prévenir la croissance bactérienne.
- Fixer SG pour l’histologie pendant 2 h à droite dans le paraformaldéhyde sans méthanol à 4% (PFA)/PBS.
- Traiter les SG le plus rapidement possible, mais ils peuvent être conservés pendant 2-4 semaines à 4-6 °C dans du PBS avec 0,02% (p / v) d’azide de sodium à ce stade.
- Préparer la solution mère noire du Soudan (1% de noir du Soudan p / v dans 100% d’éthanol) pour la réduction de l’autofluorescence et l’amélioration du rapport signal / fond30. Dissoudre pendant 2-3 h sur un agitateur magnétique à TA.
REMARQUE: Utilisez la solution mère pendant un maximum de 6 à 8 semaines, jetez-la plus tôt lorsque la sédimentation apparaît. - Préparer la solution de travail noir du Soudan en centrifugant la solution mère pendant 30 min à pleine vitesse (13 000 x g)pour éliminer les débris et diluer le stock dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à une concentration finale de 0,25 % de noir soudanais.
- Traiter sg avec l’eau de Javel de Dent pour améliorer la perméabilisation des anticorps31. Préparer fraîchement l’eau de Javel de Dent en mélangeant du méthanol (MeOH), une solution de peroxyde d’hydrogène à 30% (p/p) dansH2Oet du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un rapport de 4:1:1. Ajouter 200 μL par SG et placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 1 h à TA.
- Effectuer une série meOH descendante pour la réhydratation en incubant pendant 10 min chacune sur un agitateur orbital : 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
- Effectuer la perméabilisation en incubant SG deux fois pendant 60 minutes chacune dans PBS/1% Triton-X-100 à droite.
- Retirez la solution de perméabilisation du SG et ajoutez la solution de travail noir du Soudan. Incuber pendant 2 h à droite sur un agitateur orbital.
- En attendant, préparer une solution bloquante en ajoutant 5% d’albumine sérique bovine (BSA) de qualité récepteur et 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS un récipient de 15 mL et laisser dissoudre sur un agitateur à rouleaux pendant environ 5-10 min. Décanter à travers un filtre en papier pré-plissé pour enlever les débris.
- Retirez le noir soudan très soigneusement en inclinant la plaque et en pipetant soigneusement du côté droit.
REMARQUE: Il n’est pas possible de voir le SG en noir soudan. Utilisez une source de lumière forte et travaillez lentement. À partir de cette étape, les SG sont tachés de noir, ce qui améliore la visibilité. Si un tissu conjonctif supplémentaire est vu entourant SG à ce stade, retirez-le à l’aide de dumont #5/45 pinces et ciseaux à ressort. - Ajouter 200 μL de PBS/0,1 % de Triton-X-100 (PBS-T) et laver pendant 5 min à TA sur un agitateur orbital.
- Retirez PBS-T en l’aspirant avec une pipette et répétez 2 fois.
- Supprimer pbs; ajouter 200 μL de solution de blocage et incuber à 4 °C pendant la nuit sur un agitateur orbital.
- Le lendemain, préparez des solutions en ajoutant des anticorps primaires dans la solution bloquante. Adapter les concentrations d’anticorps des protocoles établis.
REMARQUE : Inclure un SG comme témoin d’anticorps sans anticorps primaire (inubpé avec de l’anticorps préabsorbé par l’antigène ou des IgG, s’il est disponible, ou un tampon bloquant). - Effectuer une incubation d’anticorps primaires pendant 36-48 h à 4 °C sur un agitateur orbital. Pour les mesures de la taille des cellules et la coloration des neurones sympathiques, utilisez des anticorps contre la tyrosine hydroxylase (voir le tableau des matériaux pour les recommandations d’anticorps).
NOTA : Placez la plaque de 96 puits dans une chambre humide (p. ex., boîte en plastique doublée d’essuie-tout mouillés ddH2O) pour éviter l’évaporation à ce stade. - Retirer soigneusement la solution d’anticorps et ajouter 200 μL de PBS-T. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 30 min.
- Retirez PBS-T et répétez l’étape de lavage 5 fois supplémentaires.
- Préparer la solution de travail d’anticorps secondaires en centrifugant des anticorps secondaires fluorescents marqués par Alexa pendant 1 min à pleine vitesse (13 000 x g)avant utilisation. Diluer les anticorps secondaires appropriés selon les anticorps primaires 1:500 dans la solution bloquante et ajouter à SG. Ajouter 1 μg/mL de bisbenzimide H33342 trichlorhydrate (coloration de Hoechst) si une coloration nucléaire est souhaitée. Incuber pendant 12-24 h à 4 °C sur un agitateur orbital.
- Retirer soigneusement la solution d’anticorps et ajouter 200 μL de PBS-T. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 30 min.
- Retirez PBS-T et répétez l’étape de lavage 5 fois supplémentaires. Pour la dernière étape, utilisez PBS sans Triton.
- Pour l’encastrement, étaler 50-100 μL de milieu de montage fluorescent (voir la table des matériaux)sur une lame de verre et placer sous préparation des jumelles. Utilisez la pince Dumont #5/45 pour ramasser le SG de la plaque de 96 puits et éliminer l’excès de liquide en trempant une extrémité sur un papier filtre (p. ex. tampon de séchage Whatman) et placez-le sur la goutte.
- Utilisez la pince Dumont #5/45 pour corriger le positionnement avec le grossissement approprié.
- Placez doucement une lamelle de verre (20 mm x 20 mm) à côté du SG et descendez lentement.
REMARQUE: L’utilisation d’un support de montage trop important entraînera un mouvement du SG ou un enchevêtrement des nerfs. Si cela se produit, retirez rapidement la lamelle et répétez les étapes 2.9-2.21. - Laisser sécher les lames dans l’obscurité pendant la nuit à RT. Le stockage de l’échantillon taché est possible pendant au moins 4-6 semaines à 4 °C.
3. Hybridation in situ à montage entier
NOTE : L’hybridation in situ à montage entier du SG est adaptée de l’organe du corti32 et du protocole commercial de fluorescence in situ de l’ARN (voir tableau des matériaux). Obtenir des sondes pour les gènes d’intérêt et les tampons et solutions du fournisseur. Toutes les étapes d’incubation sont effectuées à RT, sauf mention contraire. Utilisez du PBS stérile. Si vous souhaitez colorer plusieurs SG dans un puits, utilisez au moins 150 μL de tampons et de solutions.
- Effectuez la dissection du SG comme décrit dans les étapes 1.1-1.13.
- Fixer SG pendant 1 h dans 200 μL de PFA/PBS sans MeOH à 4 % dans un puits d’une plaque de 96 puits placée sur un agitateur orbital.
- Laver SG trois fois pendant 30 min chacune dans 0,1% Tween-20/PBS sur un agitateur orbital.
- Déshydratez SG dans la série de MeOH/PBS par incubation suivante dans 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS, et 100% MeOH pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital.
- Conservez SG à -20 °C dans 100% MeOH pendant la nuit.
- Le lendemain, préchauffez l’incubateur à 40 °C. Vérifiez la température avec un thermomètre.
- Réhydrater SG en série MeOH/PBS inverse (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) pendant 10 min chacun.
- Laver SG trois fois pendant 5 min chacune dans du PBS.
- En attendant, commencez à préchauffer les sondes par incubation à 40 °C pendant 10 min, puis par refroidissement pendant 10 min.
- Incuber sg dans 200 μL de protéase III pendant 15 min.
- Facultatif : Effectuer un traitement au noir du Soudan pour éteindre l’autofluorescence conformément aux sections 2.3, 2.4 et 2.8 de ce protocole si une coloration par immunofluorescence ultérieure est prévue.
- Laver sg dans 200 μL de 0,1% Tween-20/PBS 3x pendant 5 min chacun sur un agitateur orbital.
- Facultatif : Si une co-coloration avec plusieurs sondes est souhaitée, diluez la sonde Channel-2 (50x) et la sonde Channel-3 (50x) dans la sonde Channel-1 (1x).
- Couvrir sg avec 100 μL de sonde pour le gène d’intérêt et incuber pendant une nuit à 40 °C avec une légère agitation. Placer la plaque de 96 puits dans une chambre humide à 40 °C pour toutes les étapes d’incubation.
REMARQUE : Inclure un SG comme témoin négatif, à l’aide d’une sonde contre un gène bactérien (p. ex., dihydro-dipicolinate réductase, Dapb)pour vérifier la liaison non spécifique des réactifs d’amplification dans les étapes ultérieures. - Laver SG dans le tampon de lavage fourni 3x pendant 15 min chacun sur un agitateur orbital.
- Amp1-3, HRP-C1 et HRP-Blocker préchauffés à RT. Si la co-coloration avec la sonde Channel-2 et/ou Channel-2 est souhaitée, HRP-C2 et HRP-C3 préchauffés.
- Re-fixer SG pendant 10 minutes à droite dans 4% PFA/PBS sur un agitateur orbital.
- Laver SG dans 200 μL de tampon de lavage fourni 3x pendant 5 min chacun sur un agitateur orbital à RT.
- Pour l’amplification, incuber SG avec 100 μL d’Amp1 pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
- Retirez soigneusement tout liquide et lavez sg dans 200 μL de tampon de lavage fourni 3x pendant 5 min chacun à RT sur un agitateur orbital.
- Incuber SG avec 100 μL d’Amp2 pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
- Répétez l’étape 3.18.
- Incuber SG avec 100 μL d’Amp3 pendant 20 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
- Répétez l’étape 3.18.
- Incuber SG avec 100 μL de multiplex FL v2 HRP-C1 fourni pendant 20 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
- Répétez l’étape 3.18.
- Préparer l’anticorps secondaire conjugué à l’opale 1:1 000 dans 200 μL de tampon TSA fourni et incuber le SG pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital. Protéger de la lumière pendant l’incubation et à partir de cette étape.
- Répétez l’étape 3.18.
- Incuber SG dans 100 μL de multiplex FL v2 HRP-blocker fourni pendant 15 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
- Répétez l’étape 3.18.
- Facultatif : Pour la co-coloration avec la sonde Channel-2, répétez les étapes 3.25-3.30 avec le multiplex FL v2 HRP-C2 fourni.
- Facultatif: Pour la co-coloration avec la sonde Channel-3, répétez les étapes 3.25-3.30 avec multiplex FL v2 HRP-C3 fourni.
- En cas de coloration immunofluorescente ultérieure, effectuez les étapes 2.13-2.25 de ce protocole.
- Incuber dans 1% BSA/PBS pendant 30 minutes sur un agitateur orbital.
- Incuber le SG pendant 30 min dans 1 μg/mL de trichlorhydrate de bisbenzimide H33342 (coloration de Hoechst) dans 1 % de BSA/PBS si une coloration nucléaire est souhaitée et/ou ajouter de l’agglutinine de germe de blé couplée à Alexa (WGA, 1:500) sur un agitateur orbital.
- Répétez l’étape 3.18.
- Incorporer comme décrit dans les étapes 2.19-2.22.
4. Imagerie et analyses des ganglions étoilés murins
- Effectuer la microscopie confocale du SG incorporé dans l’installation locale d’imagerie.
- Si des mesures de taille de cellule sont requises, l’image SG colorée pour la tyrosine hydroxylase (voir la table des matériaux)à un grossissement de 200x et prend 4-6 images aléatoires de chaque SG.
- Analysez les images à l’aide du logiciel ImageJ33 pour estimer la taille des cellules (par exemple, avec une table à stylet, voir Table des matériaux). Utilisez free hand selection, encerclez chaque cellule et cliquez sur Analyser | Mesure pour obtenir la surface cellulaire. Veillez à n’inclure que les cellules intactes et entièrement visibles qui sont situées bien dans le SG.
- À l’aide de cette méthode, effectuez une mesure d’environ 100 cellules par SG.
- Demandez à un investigateur aveuglé d’exécuter les étapes 4.2-4.3 si vous voulez comparer SG de différentes souris. Utilisez une distribution de fréquence dans un logiciel statistique pour visualiser les différences de taille entre les groupes34.
5. Analyses moléculaires des ganglions étoilés murins
REMARQUE : Incluez des contrôles en fonction de votre plan expérimental. Il pourrait s’agir de SG avec différents génotypes et fond de la maladie et/ou d’autres ganglions autonomes, tels que le ganglion cervical supérieur sympathique (situé dans la région du cou, voir la description détaillée dans Ziegler et al.35) ou les ganglions parasympathiques (tels que les ganglions intracardiaques, voir Jungen et al.4).
- Préparer un tube de 2 mL contenant 500 μL de solution de thiocyanate de phénol/guanidine (p. ex. Qiazol) par animal et préparer l’azote liquide pour le glaçage par choc ou envisager des solutions commerciales pour la protection de l’ARN (facultatif, voir le tableau des matériaux)36. Travaillez rapidement pour l’isolement de l’ARN.
- Effectuez la dissection du SG comme décrit dans les étapes 1.1-1.13.
- Plongez immédiatement les deux SG directement dans un tube avec une solution de thiocyanate de phénol/guanidine et un tube de choc-gel dans de l’azote liquide.
- Conserver à -80 °C jusqu’à la transformation ultérieure.
- Pour la lyse tissulaire, laisser les tubes contenant du SG décongeler jusqu’à ce que la solution de thiocyanate de phénol/guanidine soit liquéfiée et ajouter deux billes d’acier inoxydable de 7 mm. Refroidir les parties métalliques de l’homogénéisateur tissulaire (broyeur à billes ou à mélangeurs, p. ex. Tissue Lyser II) sur de la glace carbonique et centrifuger à 4 °C.
- Tubes à centrifuger à 500 x g pendant 1 min à 4 °C de sorte que SG soit au fond du tube.
- Mettez des tubes dans les parties métalliques de la lyseuse tissulaire et lysez pendant 1 min à 20 Hz.
- Répétez les étapes 5.6 et 5.7 jusqu’à 5 fois jusqu’à ce qu’aucun tissu intact ne soit détectable.
- Transférer le liquide dans un tube frais de 1,5 mL.
- Effectuez l’isolement de l’ARN avec un kit d’isolation de l’ARN à base de colonnes (par exemple, mini-kit miRNeasy) conformément aux instructions du fabricant.
- Éluer l’ARN dans 20 μL d’eau sans RNase et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
REMARQUE: Pour exclure la contamination de l’ARN purifié par l’ADN génomique, nous proposons d’effectuer une réaction en chaîne de la polymérase avec des amorces génomiques et 1 μL d’ARN comme modèle, moins le contrôle de la transcriptase inverse. Cela permettra d’économiser une quantité importante d’ARN. Si l’ARN est contaminé, utilisez des amorces limites d’exon-intron ou des amorces flanquantes d’intron pour une réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel ultérieure. - Utilisez 250 ng d’ARN SG pour effectuer la synthèse de l’ADNc et utilisez les protocoles établis. Ici, un kit de transcription inverse de l’ADNc de grande capacité a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.
- Diluer à une concentration finale de 2,5 ng/μL d’ADNc et effectuer une réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel avec les sondes appropriées conformément aux protocoles établis. Ici, le test TaqMan (voir la table des matériaux)a été effectué en utilisant 10 ng d’ADNc par réaction.
Remarque : effectuez un contrôle sans modèle pour chaque gène afin d’exclure les résultats faussement positifs. - Normaliser l’expression génique de votre gène d’intérêt sur un gène de ménage (p. ex. Cdkn1b)pour comparer l’expression génique relative entre différents groupes de SG.
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Representative Results
La figure 1 montre comment identifier et disséquer le SG. La figure 1A montre un dessin schématique de l’emplacement, tandis que la figure 1B présente la vue dans le thorax après le retrait de l’emballage cœur-poumon. Les muscles gauches et droits de colli de longus médiaux du SG et de la cage thoracique sont des points de repère importants pour l’orientation. La dissection est effectuée le long des lignes pointillées entre les muscles et la première côte. Le SG et la chaîne sympathique deviennent visibles sous forme de structures blanches(figure 1C). La figure 1D montre un grossissement de la région située entre le muscle longus colli gauche et la première côte, où se trouve le SG gauche. La morphologie du SG diffère d’un individu à l’autre. Il s’agit souvent d’une fusion des ganglions cervicaux inférieurs et du premier au troisième ganglion thoracique24. Une certaine variété à laquelle l’expérimentateur peut s’attendre dans le SG murin est représentée à la figure 1E,F,où le SG gauche et droit de cinq souris mâles de type sauvage C57Bl6 sont photographiées.
L’évaluation de la vue d’ensemble anatomique brute, aussi bien que les analyses cellulaires et subcellulaires des cellules dans le SG innervant le coeur peuvent être exécutées par des techniques entières de montage au niveau de protéine et d’ARN. Un aperçu d’un SG est présenté à la figure 2. Les fibres sympathiques myocardiques proviennent des corps de cellules dans le SG. Ceux-ci sont visualisés par coloration avec un anticorps contre la tyrosine hydroxylase (TH). Somata neuronale exprimant TH sont entourés de fibres nerveuses coloration positive pour la choline acétyltransférase (ChAT). Ce sont très probablement des fibres présynaptiques37,38. Un grossissement exemplaire issu du co-étiquetage TH et ChAT est présenté à la figure 2A. Les cellules gliales entourant les corps cellulaires neuronaux peuvent être visualisées par coloration pour S100B. Ceci est représenté à la figure 2B en combinaison avec le marqueur neural PGP9.5. La figure 2C-F montre des analyses exemplaires pour étudier le SG à un niveau subcellulaire, en utilisant une hybridation in situ à montage entier et une co-coloration immunofluorescente. La protéine TH(figure 2C,rouge) et les molécules d’ARNm de Tubb3 (figure 2D,blanc) sont exprimées dans de grands corps cellulaires neuronaux, tandis que l’ARNm de S100b (figure 2E,vert) est également détectable dans les cellules glies environnantes. Dans la fusion(figure 2F),on voit que certains neurones sont négatifs pour TH mais expriment Tubb3,tandis que les ARNm S100b peuvent également être détectés dans les cellules environnantes, comme le montre le grossissement de la figure 2G.
La figure 3 présente les analyses quantitatives potentielles et les pièges pour l’étude du SG murin. Des images de SG colorées en TH (Figure 3A) peuvent être utilisées pour les mesures de la taille des cellules, comme cela a été fait par exemple pour un modèle murin du diabète. Les somatas neuronales du contrôle (db/het) SG étaient de 388,8 ± 123,8 μm2 contre dans le SG diabétique (db/db) 407,33 ± 139,6 μm2 (figure 3B,n = 2 SG, 100 cellules par SG par génotype, P = 0,348, les données ont été comparées à l’aide du test de Mann-Whitney). La figure 3C montre l’expression de gènes de différents types cellulaires du SG (n = 6-7). La mise en commun des deux SG d’un seul animal permet des mesures d’expression génique d’environ 24 tests (12 gènes en double). Nous normalisons généralement des échantillons pour Cdkn1b (détecté à des valeurs Ct de 25,4 ± 0,97) ainsi que pour le marqueur neuronal Neun/Rbfox3 (32,5 ± 0,7) s’il est nécessaire de tenir compte d’autres types de cellules et de la pureté neuronale de la dissection. Les gènes que nous avons trouvés utiles pour caractériser les processus moléculaires dans le SG comprennent le gène sympathique Th (22,4 ± 1,6), Chat, qui pourrait indiquer une transdifférenciatation cholinergique (exprimée à des valeurs Ct de 30,8 ± 1,3) et Gap43, un marqueur de germination neuronale (détectable à des valeurs Ct de 22,4 ± 1,4). Les gènes exprimés dans le type de cellules non neuronales comprennent S100b (pour les cellules gliales, 27,3 ± 1,2), Ki-67 (pour les cellules proliférantes, 33,0 ± 1,6) et Cd45 (pour les cellules immunitaires, 30,2 ± 1,1).
Le SG est entouré d’une capsule de tissu conjonctif26,visualisée via l’hématoxyline et la coloration à l’éosine sur la figure 3D,E. De temps en temps, nous avons observé des incohérences dans la souillure à base d’anticorps comme démontré dans la figure 3F, très probablement en raison de l’enlèvement incomplet de la capsule. Tandis que la souillure de ChAT et de TH sont seulement discernables dans certaines parties du SG, les noyaux contre-colorés avec DAPI sont discernables partout. La ligne pointillée dans l’image fusionnée sépare la coloration réussie (à droite de la ligne) de la coloration infructueuse (à gauche de la ligne).
Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart type. La signification statistique a été définie comme une valeur de P de <0,05; l’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel commercial.
Figure 1: Localisation, dissection et morphologie des ganglions étoilés murins ( A) Dessin schématique de l’emplacement des ganglions étoilés (SG). (B) Vue dans le thorax après le retrait de l’emballage cœur-poumon. Il est important de noter que les SG ne sont pas immédiatement visibles la plupart du temps. Les muscles longus colli sont situés latéralement de la colonne vertébrale. Les SG sont situés latéralement des muscles à la jonction avec la première côte. Disséquer soigneusement latéralement aux muscles (zone marquée par une ligne pointillée) pour découvrir les ganglions. Après dissection, les ganglions (gauche et droite, LSG et RSG, respectivement) et la chaîne sympathique peuvent être distingués comme des structures blanches et longues. (C) Une dissection exemplaire montrant les ganglions et les repères anatomiques. (D) Grossissement du LSG. (E) LSG et (F) RSG de type sauvage, des souris C57Bl6 mâles (16 semaines) ont été disséquées et photographiées pour montrer les variations dans la morphologie et la taille. La barre d’échelle représente 1 000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Visualisation de différents types de cellules dans les ganglions radiés murins par immunohistochimie de montage entier et hybridation in situ. (A) Vue d’ensemble brute d’un ganglion étoilé murin (SG) coloré pour le marqueur sympathique tyrosine hydroxylase (TH) et choline acétyltransférase (ChAT). Le grossissement montre les corps cellulaires TH-positifs et la présence de chAT-positifs, très probablement présynaptiques, fibres nerveuses entourant la somata neuronale. (B) Les cellules gliales ensheathing des corps cellulaires neuronaux peuvent être visualisées par coloration pour S100B, ici en combinaison avec le marqueur neuronal PGP9.5. (C,D, E,F) Les images microscopiques d’un SG ont souillé la monture entière par l’intermédiaire d’une combinaison d’immunohistochemistry pour TH (rouge) et d’hybridation in situ pour Tubb3 (D, blanc) et S100b (E, vert). Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI (bleu). (F) La fusion montre que toutes les cellules neuronales(Tubb3-positive) ne sont pas TH positives. Les ARNm S100b peuvent être détectés dans la somata neuronale, mais aussi dans les cellules environnantes, comme indiqué par une flèche dans le grossissement en (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Analyses quantitatives potentielles et pièges. (A) Les images de Tyrosine-hydroxylase (TH)-stained SG peuvent être utilisées pour les mesures de taille de cellule utilisant ImageJ. (B) Ceci a été exécuté dans un modèle murin du diabète (100 cellules par SG, n = 2 SG par génotype, les données ont été comparées utilisant le test de Mann-Whitney). (C) Gènes exemplaires exprimés dans le SG qui pourraient être utiles pour caractériser les processus moléculaires. Cdkn1b ainsi que le marqueur neuronal Neun/Rbfox3 (pour tenir compte de la présence d’autres types de cellules) peuvent être utilisés pour la normalisation. Tyrosine hydroxylase (Th) sert de marqueur sympathique, choline acétyltransférase (Chat) pour la transdifférenciatation cholinergique, Gap43 pour la germination neuronale. Les gènes exprimés dans les types de cellules non neuronales comprennent S100b (cellules gliales), Ki-67 (cellules proliférantes) et Cd45 (cellules immunitaires). (D) La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine d’un SG fixe au forcélif visualise le tissu conjonctif et les cellules au-dessus du SG. (E) Grossissement de la zone encadrée. (F) À certaines occasions, nous avons observé l’échec dans la souillure anticorps-basée, très probablement dû au déplacement inachevé de la capsule. Alors que les taches ChAT (rouge) et TH (vert) ne sont détectables que dans certaines parties du SG, les noyaux contre-colorés avec DAPI (bleu foncé) sont détectables partout. La ligne pointillée dans l’image fusionnée sépare la coloration réussie (à droite de la ligne) de la coloration infructueuse (à gauche de la ligne). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales du système nerveux sympathique qui précèdent l’apparition de l’AV est d’un grand intérêt, car l’arrêt cardiaque soudain reste la cause de décès la plus fréquente dans le monde5. Par conséquent, dans le manuscrit actuel, nous fournissons un répertoire de base de méthodes pour identifier le SG murin – un élément murin au sein de ce réseau – et effectuer des analyses ultérieures au niveau de l’ARN, des protéines et des cellules.
Un défi du SG murin est sa taille et le nombre limité de cellules39. Pour cette raison, différents modèles animaux, tels que les rats40,les chiens22et les porcs41 sont utilisés pour les études sur le SG. Pourtant, il existe une variété de modèles de maladies bien établis pour les phénotypes cardiaques disponibles chez la souris et certains d’entre eux ont déjà été caractérisés dans différents aspects de l’innervation cardiaque et de l’arythmie, tels que les modèles pour le diabète23, infarctus du myocarde42, ou myocardite43. Par conséquent, d’autres études du SG murin sont justifiées pour caractériser davantage le dysfonctionnement autonome à la lumière du VA. Celles-ci peuvent être complétées par d’autres approches pour étudier l’innervation du cœur murin telles que les expériences fonctionnelles4,23,44 comprenant la stimulation in vivo duSG23.
En raison de sa petite taille et de son emplacement dans la cavité thoracique24,la manipulation du SG murin in vivo est difficile, bien qu’elle ait été réalisée avec succès23. Pour cette raison, certaines études se concentrent donc sur les ganglions cervicaux supérieurs, qui sont situés plus facilement dans le cou, en amont du SG dans la chaîne sympathique derrière la bifurcation carotide dans les artères carotides internes et externes24,35. Il a été démontré que la dénervation cardiaque par l’intermédiaire de l’élimination des ganglions cervicaux supérieurs atténue l’inflammation du myocarde, l’hypertrophie et le dysfonctionnement cardiaque après un infarctus du myocarde35. Cependant, il est important de noter que les ganglions cervicaux supérieurs innercèrent différentes régions du cœur, le plus en évidence le côté antérieur45. En outre, une revue de littérature approfondie récente est arrivée à la conclusion que le rôle des ganglions cervicaux sur l’innervation sympathique du cœur reste peu clair chez l’homme46. Ceci accentue l’importance de caractériser le SG pour des études d’innervation sympathique cardiaque.
Il est important de noter que le cœur n’est pas la seule cible du SG. Entre autres, les poumons47 et les glandes sudoripares dans la la lacet48 sont également innervés à partir de fibres provenant du SG, ces dernières étant une exception à la physiologie sympathique car elles expriment la choline acétyltransférase37. Le blocage temporaire du SG est étudié en ce qui concerne les processus inflammatoires dans les lésions pulmonaires aiguës49 ou pour le traitement des bouffées de chaleur et des dysfonctionnements du sommeil50; par conséquent, les protocoles à portée de main pourraient offrir un répertoire pour les questions mécanistes dans ces domaines. Lorsque l’on se concentre sur les modèles de maladies cardiaques, il convient de garder à l’esprit, pour l’interprétation des résultats, que les neurones cardiaques ne peuvent pas être différenciés par morphologie ou leurs propriétés électrophysiologiques des neurones non cardiaques51. Ceci peut être réalisé par le tracé rétrograde, ainsi l’emplacement des neurones projetant vers le coeur a été montré pour être situé dans les parties cranio-médiales du SG52.
De plus, il est important de noter qu’en plus de différents types de neurones, les ganglions sympathiques sont constitués de glies ensheathing, de cellules gliales satellites ou de cellules satellites marquées par l’expression du marqueur glial S100B53. Alors que peu de choses sont connues sur le rôle de ces cellules dans les pathologies cardiovasculaires, l’activation gliale et l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ont été décrites dans SG chez des patients atteints d’arythmies18.
Quelques pièges devraient être gardés à l’esprit avec les méthodes présentées : nous avons observé des incohérences dans la souillure anticorps-basée à certaines occasions et avons émis l’hypothèse que le déplacement inachevé de la capsule de tissu conjonctif ensheathing le SG pourrait être en faute, car ils ont été décrits pour varier dans la perméabilité parmi différents types de ganglions26. L’enlèvement mécanique de la capsule à l’aide d’une pince fine a été décrit dans le ganglion cervical supérieur des rats jusqu’au jour postnatal 1028 et le desheathing est mentionné dans la littérature pour le rat adulte SG54,55 et les souris56. L’enlèvement de la capsule SG peut varier entre l’âgede 28 ans et – en raison des différences de taille – les espèces. Dans notre expérience, la dissection fraîche, le déplacement d’autant de tissu conjonctif que possible utilisant la pince fine et la perméabilisation complète comme décrit dans le protocole à portée de main, sont des facteurs importants pour la souillure réussie. En ce qui concerne la PCR quantitative en temps réel, un travail rapide et une lyse efficace sont essentiels. La mise en commun fiable des deux SA d’un animal a permis d’analyser jusqu’à 12 gènes différents (lors de l’exécution de doublons).
Quoique la fonction et l’anatomie brute de SG aient été étudiées pendant des décennies maintenant et que chaque cardiomyocyte simple soit innervé par les fibres sympathiques46,beaucoup de questions ouvertes demeurent. Par exemple, il reste peu clair, pourquoi les neurones sympathiques du SG transdifférencient transitoirement à un phénotype cholinergique dans l’insuffisance cardiaque ischémique21 et non ischémique, chez les modèles animaux ainsi que chez les patients20. Récemment, notre groupe a décrit un rôle des cellules gliales S100B-positives, qui sont également présentes dans le SG murin, sur la germination nerveuse dans le système nerveux cardiaque29. Si ces cellules sont pertinentes pour la germination sympathique de nerf après des dommages liés à VA11,12,doit être élucidé dans de futures études. Il est important de savoir que des approches innovantes, telles que l’optogénétique52 et les analyses detranscriptomes 36, peuvent compléter des méthodes établies telles que le traçage neuronal afin d’approfondir la compréhension du système nerveux sympathique et de son rôle sur l’électrophysiologie cardiaque.
En conclusion, ce répertoire permet à l’investigateur inexpérimenté d’effectuer une caractérisation de base du SG dans des modèles murins de pathologies cardiaques. Nous espérons que cela stimulera l’utilisation, la combinaison et la création de nouvelles méthodes. Ceci pourrait aider à augmenter la compréhension des processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans les neurones sympathiques qui pourraient être responsables de l’apparition et de l’entretien de VA.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique, et l’installation d’imagerie par microscopie UKE (Umif) du centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf pour avoir fourni des microscopes et un soutien. Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
References
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