Summary
هنا نقدم طريقة للتعبير عن بروتينات الهستون الأسيتية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية وتجميع النيوكليوسومات المعاد تشكيلها في المختبر.
Abstract
يمكن التعبير بسهولة عن بروتينات الهستون الأسيتية في الإشريكية القولونية ترميز متحولة، Nε-أسيتيل ليسين (AcK) محددة ميتانوساركينا مازي بيروليسين tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ورنا cognate (tRNAPyl)لتجميع الرتابات المعاد تشكيلها مع الهستونات المحددة الموقع. MmAcKRS1 و TRNAPyl تسليم ACK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لدمج AcK في مواقع ال ليسين H3. يمكن أيضا أن تتطور بسهولة بيروليسيل-TRNA synthetase (PylRS) لدمج الأحماض الأمينية غير الكانانية الأخرى (ncAAs) لتعديل البروتين محددة الموقع أو وظيفية. هنا نحن بالتفصيل طريقة لدمج AcK باستخدام نظام MmAcKRS1 في H3 الهستون ودمج البروتينات H3 أسيتيلاتيد في mononucleosomes المعاد تشكيلها. يمكن استخدام أحاديات النوكليوسومات المعاد تشكيلها في المقايسات الكيميائية الحيوية والملزمة ، وتحديد الهيكل ، وأكثر من ذلك. يعد الحصول على النويدات أحادية النواة المعدلة أمرا حاسما لتصميم التجارب المتعلقة باكتشاف تفاعلات جديدة وفهم علم الوراثة اللاجينية.
Introduction
لقد استخدمنا PylRS و TRNAPyl لتجميع وتجميع mononucleosomes المعاد تشكيلها مع الهستونات الأسيتيlated الموقع محددة. وقد ثبت PylRS لا تقدر بثمن كأداة لتوسيع الشفرة الوراثية لإنتاج البروتينات مع تعديلات ما بعد التحويل (PTMs) وتطورت وراثيا لدمج حوالي 200 ncAAs مختلفة. PylRS يدمج في وقف الكهرمان codon، وإزالة المنافسة من الأحماض الأمينية الأخرى أثناء الترجمة. تم اكتشاف PylRS لأول مرة في archaea الميثانوجينية ، ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في البيولوجيا الكيميائية لدمج مجموعات كيميائية تفاعلية جديدة في البروتينات1،2.
تم تطوير MmAcKRS1 من ميتانوساركينا مازي PylRS وكثيرا ما تستخدم في مختبرنا لتركيب البروتينات الأسيتيلاتيد3،4،5،6. MmAcKRS1 يسلم AcK في موقع طفرة العنبر في مرنا من اختيار أثناء الترجمة في الإشريكية القولونية. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدمج ACK في K4، K9، K14، K18، K23، K27، K36، K56، K64، و K79 هيستون H3 مواقع ليسين لدراسة نشاط سيرتوين 1، 2، 6، و 7 على mononucleosomes أسيتيلاتيد4،5،6. هنا نحن بالتفصيل هذه الطريقة للتعبير عن الهستونات أسيتيلاتيد وإعادة تشكيل النيوكليوسومات الأسيتيlated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. البناء البلازميد
- تبدأ من خلال تحديد البروتين الهستون الذي سيتم أسيتيلاتيد وفي أي موقع ليسين. تحور الموقع إلى وقف الكهرمان كودون (TAG) باستخدام موقع موجهة mutagenesis.
ملاحظة: هناك أربعة البلازميدات المصممة سابقا المستخدمة للتعبير عن بروتينات الهستون. تم استنساخ جميع بروتينات الهستون الأربعة في ناقلات pETDuet-1 مع علامة الهستيدين N-terminal. Histone H4 يتضمن أيضا علامة سومو، وأصل colE1 النسخ المتماثل مع عدد نسخة من حوالي 40، ومقاومة الأمبيسلين، ومروج T7.- تصميم التمهيديات إلى الأمام وعكس التي تحتوي على طفرة TAG في الموقع المطلوب (استبدال كودون ليسين القائمة مع codon وقف العنبر) في واحدة من أربعة البلازميدات بروتين الهستون.
- استخدام PCR كامل البلازميد لتضخيم TAG التي تحتوي على البلازميد. تحديد درجة حرارة التلين المناسبة للمبرمجين. بشكل عام، فإن درجة حرارة ذوبان (Tm)من التمهيديات ناقص 5 درجة مئوية تكون كافية. إذا واجهت صعوبة في الحصول على منتج PCR ، يمكن استخدام تدرج درجة الحرارة حول Tm - 5 °C لتحسين درجة حرارة التلاحم للتضخيم.
ملاحظة: في هذه التجربة تم استخدام بوليمرات PFU المعبر عنها داخليا لمدة 30 دورة مع الشروط التالية: 94 درجة مئوية لمدة 30 s (التشبع)، ودرجة حرارة التلين لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق (أو دقيقة واحدة لكل كيلوبيس-أزواج). لمزيد من التفاصيل حول هذا النوع من طريقة PCR انظر ليو ونايسميث7. - تنظيف المنتج PCR مع مجموعة تنظيف PCR باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تحليل المنتج PCR بواسطة أجاروز هلام الكهربائي وتلطيخ بروميد الإيثيديوم اللاحقة.
- Ligate وplasmid عن طريق احتضان مع T4 ligase بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
- أولا تحويل TAG التي تحتوي على البلازميد (أمبيرR)إلى الإشريكية القولونيةالمختصة كيميائيا . اختيار ما لا يقل عن 4 مستعمرات من التحول وتنقية البلازميد. جعل مخزونات الخلايا من كل مع الجلسرين باستخدام أساليب قياسية وتخزينها في -80 درجة مئوية. أرسل للتسلسل لتأكيد طفرة TAG المطلوبة.
- بمجرد تأكيد التسلسل ، شارك في تحويل البلازميد المحتوي على TAG (AmpR)مع pEVOL-AckRS (ChlR)إلى CobB المختص كيميائيا (الهستون الوحيد ليسين deacetylase المعروف في E. coli.) حذف خلايا BL21 باستخدام طريقة الصدمة الحرارية. pEVOL هو plasmid مع منتصف عدد النسخ إلى انخفاض عدد نسخة p15A الأصل.
ملاحظة: تم بناء سلسلة pEVOL من البلازميدات استنادا إلى الدراسات السابقة التي أظهرت زيادة التعبير عن الزوج aaRS متعامد / TRNATyr كانت فعالة في خفض اقتطاع البروتين وفي زيادة الغلة الإجمالية للبروتينات متحولة8. إذا لم يكن من السهل الوصول إلى خلايا حذف CobB ، فانتقل إلى خلايا BL21 المختصة كيميائيا. CobB هو سيرتوين مثل الهستون ليسين deacetylase ونيكوتيناميد يمكن أن تضاف في التركيز النهائي 5 MM خلال التعبير البروتين الهستون لمنع كوب كنهج بديل9. - جعل مخزون الخلية وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. أسيتيلاتيد الهستون البروتين التعبير
- إعداد 1 لتر من الوسائط 2YT autoclaved (أو حجم الاختيار) في قارورة الثقافة.
- تلقيح 20 مل من وسائط 2YT التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع مخزون الخلايا التي تم تحويلها المشتركة التي تحتوي على البلازميد المحتوي على TAG (أمبيرR)وpEVOL-AckRS (ChlR)وتنمو عند 37 درجة مئوية إلى OD = 0.6 (4-6 ساعة).
- إضافة المضادات الحيوية المناسبة إلى 1 لتر من وسائل الإعلام 2YT autoclaved والتطعيم مع ثقافة بداية 20 مل. تنمو عند 37 درجة مئوية إلى OD = 0.6-0.8 (2-3 ساعة).
- إضافة عوامل تحريضية والأستيتيل (AcK) إلى التركيزات النهائية من IPTG 1 mM, 0.2٪ أرابينوس, وAcK 5 mM.
- تنمو الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة.
- الكريات الخلايا في 2700 س ز لمدة 15 دقيقة.
- تخزين بيليه الخلية في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- من هذه الخطوة فصاعدا إبقاء العينة على الجليد في جميع الأوقات. حل بيليه الخلية في 50 مل من العازلة تحلل الهستون لكل 1 لتر من الثقافة.
- Sonicate وفقا للدورة التالية: 1 ق على، 1 ق قبالة، المجموع في الوقت المحدد: 3 دقيقة في 60٪ السعة.
- بيليه إدراج الهيئات في 41600 × غرام لمدة 45 دقيقة.
- تجاهل الهيئات إدراج supernatant وإعادة الإنفاق في 30 مل من العازلة تحلل الهستون. بيليه إدراج يبشر في 41600 × ز لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل الهيئات إدراج supernatant وإعادة الإنفاق في 30 مل من العازلة غسل بيليه. بيليه إدراج الهيئات في 41600 × غرام لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل الهيئات فائقة التناسل وتذوب إدراج في 25 مل من 6 م جوانيدين هيدروكلوريد (GuHCl) العازلة. احتضان مع التحريض في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن احتضان هيئات الإدماج مع التحريض بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. - بيليه إدراج يبشر في 41600 × ز لمدة 45 دقيقة. احتضان supernatant مع 1 مل من راتنج ني-NTA متساوية مع 6 M GuHCl العازلة لمدة 2 ساعة.
- المضي قدما في تنقية Ni-NTA في ظل ظروف مشوهة. اغسل العمود ب 3 وحدات تخزين عمود من المخزن المؤقت لغسل العمود. Elute بروتين الهستون الأسيتي مع 10 مل من العازلة elution.
ملاحظة: محاولة تركيز البروتين هنا هو خيار ولكن الهستونات الأسيتيlated لا يمكن التنبؤ بها جدا ويمكن أن تعجل بسهولة. لا ينصح بالتركيز على 2 مل في الحجم الإجمالي. - dialyze على نطاق واسع بروتين الهستون أسيتيلاتيد ضد 5٪ حمض الخليك العازلة لإزالة الأملاح. Dialyze لمدة 3 ساعة في وقت واحد في 4 درجة مئوية، وتبادل لعازلة جديدة لا تقل عن 6 مرات.
ملاحظة: لتحسين نقاء البروتين، هناك خيار ل dialyze ضد المياه النقية. ومع ذلك، وهذا يسبب هطول الأمطار كبيرة وانخفاض في الغلة التي قد تكون غير مرغوب فيها لبروتينات الهستون الأسيتيلاتيد منخفضة الغلة. - الكوت والليوفليزي البروتين، وتخزينها إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية. البرية نوع البروتينات الهستون تسفر عموما 10-50 ملغ / لتر في حين أن بروتينات الهستون الأسيتيlated تسفر عن أقل من 10 ملغ / لتر اعتمادا على موقع اليسين محددة. على سبيل المثال، يبلغ متوسط H3K79Ac 5 ملغم/لتر.
3. البرية نوع الهستون البروتين التعبير
- لتجميع النوى الكاملة، والتعبير عن جميع البروتينات الهستون 4. عند التعبير عن وتنقية نوع البرية histones البروتوكول هو نفسه كما هيستونات أسيتيلاتيد باستثناء ما يلي:
- لا تقم بإجراء التحويل المشترك. لا تستخدم pEVOL-AcKRS للتعبير عن الهستون نوع البرية. ضبط المضادات الحيوية وفقا لذلك.
- لا تستخدم خط الخلية حذف كوب أو إضافة نيكوتيناميد، AcK، أو أرابينوس أثناء تحريض التعبير الخلوي.
4. إعداد الحمض النووي 601
ملاحظة: تم تجميع تسلسل الحمض النووي الأمثل المصمم مسبقا لتحديد المواقع النيوكليوسوم المباشر مع ثمانيات الهستون لإنتاج مونونوكليوسوم بكفاءة عالية. ويشار إلى هذا التسلسل باسم 601 DNA أو تسلسل Widom. وقد أصبح هذا التسلسل تسلسل الحمض النووي القياسية للدراسات المختبرية من النيوكليوسومات من الكروماتين إعادة عرض المقايسات لقياس جزيء واحد10.
- لإعداد كميات كبيرة من الحمض النووي 601 للتجميع النيوكليوسوم، تحويل pGEM-3z/601 إلى أعلى 10 خلايا وتنمو 10 مل من الثقافة لتضخيم البلازميد واستخراج. استخدام عدة استخراج البلازميد واتبع توصية الشركة المصنعة.
- استخدام البوليمرات PFU أعرب في المنزل (أكثر كفاءة) لهذا البروتوكول تضخيم. إعداد تفاعل PCR: لتفاعل 250 ميكرولتر، استخدام 207.5 ميكرولتر autoclaved MQH 2O، 25 ميكرولتر 10x PFU العازلة، 5 ميكرولتر التمهيدي إلى الأمام: ctggagaatcccgggccg، 5 ميكرولتر عكس التمهيدي: acaggatgtatatatctgacg، 5 ميكرولتر مزيج DNTP، 2.5 ميكرولتر إنزيم PFU. نحن عادة تشغيل 60 ردود الفعل في وقت واحد للحصول على ما يكفي من الحمض النووي لتجميع.
- استخدام درجة حرارة التلين من 52 درجة مئوية لمدة 30 ق وفترة تمديد 30 ق إذا باستخدام البوليميراز PFU. وإلا اتبع الشروط الموصى بها من قبل الشركات المصنعة.
- وبمجرد الانتهاء من PCR، استخدم مجموعة تنظيف PCR من الاختيار لتنقية المنتج PCR.
5. جمعية اوكتامر الهستون
- حل aliquots من الكريات البروتين الهستون H2A، H2B، H3، وH4 بحيث يكون هناك مخزون منفصل من كل بروتين الهستون في مخزن GuHCl مع حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
- حساب تركيز كل بروتين الهستون عن طريق قياس امتصاصA 280.
- إذا كان الامتصاص أكبر من 1 لأي بروتين، تخفيف مع العازلة GuHCl للحصول على تركيز أكثر دقة.
- الجمع بين H2A و H2B البروتينات في نسبة الضرس 1:1 وتمييع إلى تركيز البروتين الكلي من 4 ميكروغرام / ميكرولتر. كرر لH3 و H4.
- Dialyze بالتسلسل عند 4 درجة مئوية مقابل 2 M TE العازلة بين عشية وضحاها، 1 M TE العازلة لمدة 2 ساعة و 0.5 M TE العازلة لمدة 5 ساعة.
ملاحظة: الخطوات الثانية والثالثة من غسيل الكلى يسبب تشكيلات غير مستقرة من البروتين لتسريع بها. ومن المتوقع أن تشهد هطول الأمطار الغزيرة في هذه الخطوات. - إزالة الترسبات عن طريق الطرد المركزي عند 16,800 × ز عند 4 °C.
- مرة أخرى، حساب تركيز ديمرات الهستون (خليط H2A/H2B) و tetramers (خليط H3/H4) قياس امتصاص A280.
- مزيج dimers و tetramers في نسبة 1:1 الضرس وضبط NaCl إلى 2 M بإضافة NaCl الصلبة.
- يمكن تخزين ثماني الهستون عند 4 درجة مئوية وهو أكثر استقرارا من الدامرات والتترامرات. أبدا تجميد ثماني الهستون لأن هذا يمكن أن يسبب تفكيك.
- إذا تجميع مع الهستونات الأسيتيlated، ببساطة استبدال البروتين نوع البرية مع البروتين الأسيتيلاتيد في الإجراء.
6. التجمع النوى
- استخدم 100x TE العازلة وNaCl الصلبة لضبط 601 الحمض النووي إلى 2M TE العازلة. أضف الحمض النووي 601 في 2M TE العازلة إلى ثماني الهستون في نسبة الضرس من 0.85:1 إلى 0.90:1. يمكن إضافة نسبة أقل من الحمض النووي إذا كان الحمض النووي المجاني موجودا في تحليل تحول الجل.
- نقل خليط الحمض النووي-الهستون كيس غسيل الكلى ومكان في حوالي 200 مل من العازلة TE 2M (أو أكثر إذا تجميع عينات متعددة) ويحرك بلطف جدا في 4 درجة مئوية.
- تعيين مضخة التجذم لتطهير بالتنقيط ببطء في أي عازلة TE الملح. عندما يتضاعف حجم تقريبا، صب من نصف حجم. القيام بذلك على الأقل 4 مرات في المجموع. مع مضخة هذا يمكن أن يستغرق 4-8 ساعة اعتمادا على حجم البداية. تتشكل النيوكليوسومات عندما ينخفض تركيز الملح إلى 150 مليون متر (يقاس بمقياس الملوحة).
- بعد تقليل تركيز الملح إلى 150 mM، dialyze ضد 20 متر TE العازلة بين عشية وضحاها.
- إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي وقياس تركيز النوى من قبل قراءةA 260 باستخدام قارئ لوحة.
- إضافة له-TEV protease (TEV: نوى 1:30, ث:ث) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C لإزالة جميع العلامات الهستيدين. إزالة الشوائب العلامة الهستيدين من الحل النيوكليوسوم بواسطة راتنج ني-NTA سحب إلى أسفل.
- لوضع النوى وتجانس العينة، واحتضان في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: بالنسبة للمواقع التي تم تحديدها بشكل خاص غير مستقرة، قد لا تكون هذه الخطوة مستحسنة. - تخزين النوى على المدى القصير (بضعة أسابيع) في 4 °C.
- للتخزين على المدى الطويل، النوى dialyze ضد المخزن المؤقت وتخزينها في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تقييم الديمرات والتترامر والأوكتامات عن طريق تشغيل هلام صفحة SDS بنسبة 12٪ (الشكل 1 والشكل 2). هنا يمكنك أن ترى أن بعض tetramers أسيتيلاتيد لديها عائد أقل من غيرها(الشكل 1). في الواقع، كلما اقتربنا من المنطقة الأساسية، انخفض العائد الملاحظ. هذا هو على الأرجح بسبب أسيتيل التدخل في تجميع tetramer أقرب تحصل على المناطق الأساسية. ويلاحظ تأثير مماثل بعد تجميع ثمانيات (الشكل 2). بعد تجميع الأوكتامات مع تسلسل الحمض النووي 601 ، يمكن تقييم النيوكليوسوم باستخدام هلام 5٪ 1x TBE Native PAGE متبوعا بالتلطيخ ببروميد الإيثيديوم (الشكل 3). قبل هضم TEV لوحظ الفرقة النوى بالقرب من علامة زوج قاعدة 10k. بعد هضم TEV يتحول النطاق النيوكليوسوم إلى أسفل نسبة إلى السلم. قبل تحديد المواقع الحرارية، فإن العصابات النوى لاحظت تكون واسعة جدا، وربما خط(الشكل 4).
الشكل 1: هيستون ديمر و tetramers. ممثل 12٪ SDS PAGE هلام من نوع البرية هيستون ديمر (حارة 2) وH3 tetramers أسيتيلاتيد (الممرات 3-9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هيستون أوكتامرز. ممثل 12٪ SDS PAGE هلام من H3 أسيتيلاتيد هيستون أوكتامرز (الممرات 2-11). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجميع له الموسومة H3K64Ac مجمع النيوكليوسوم. ممثل 1x TBE هلام الصفحة الأصلية من مجمع النيوكليوسوم H3K64Ac (حارة 2) مقارنة مع الحمض النووي 601 مجانا (لين 4) تصورها بروميد الإيشتيوم. يعرض Lane 3 نواة H3K64Ac بعد الحضانة عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ويلاحظ في حارة 3 أن جميع النوى قد تفككت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تجميعها TEV هضم مجمع النوى. ممثل 1x TBE هلام الصفحة الأصلية من نوع البرية TEV هضم مجمع النيوكليوسوم، ومجانا 601 الحمض النووي. مقارنة بين قبل وبعد تحديد المواقع الحرارية النيوكليوسوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من الضروري اتباع هذا البروتوكول بكل التفاصيل أثناء التجربة. النوى ليست مستقرة جدا والكثير من التجربة والخطأ قد ذهب إلى تحديد هذا البروتوكول. من المهم إزالة الرواسب في كل خطوة (أو كلما لوحظ) لأن الجسيمات يمكن أن تتداخل بسهولة مع عمليات التجميع. دائما احتفظ بعينات الهستون على الثلج إذا تم تخزين النوى عند 4 درجات مئوية لفترة طويلة جدا، فإنها يمكن أن تفكيك تلقائيا. تأكد من التحقق من أي عينات من قبل NATIVE PAGE إذا تم تخزينها عند 4 درجة مئوية لأكثر من أسبوعين قبل استخدامها في أي تجربة. تجنب دوامة الأوكتامات والنوكليوسومات لأن هذا يمكن أن يسبب لهم أيضا لتفكيك. إذا واجهت مشاكل تجميع dimers، tetramers، أو ثمانيات هذا عادة ما يدل على سوء نوعية البروتين. تحقق من جودة البروتين بنسبة 15٪ SDS-PAGE. أحد الخيارات إذا كان نقاء البروتين منخفضا هو طلب البروتين مقابل الماء النقي. وهذا سوف يسبب هطول الأمطار الغزيرة ويقلل إلى حد كبير من غلة البروتين، ولكن سوف تنتج عينة أنقى. دمج والاستقرار النووي لكل موقع أستيل الهستون يختلف اختلافا كبيرا. بشكل عام ، كلما كان الموقع أقرب إلى نطاق N-terminal ، انخفض العائد أثناء تعبير بروتين الهستون. للاستقرار النوى، وأقرب موقع أستيل إلى النواة الأساسية أو مواقع ربط الحمض النووي، وأقل استقرارا النوى تجميعها. إذا واجهت قضايا الاستقرار، فمن الأهمية بمكان أن تبقي دائما عينة النوى على الجليد. قد يكون من الضروري حذف خطوة تحديد المواقع النيوكليوسوم عند 60 درجة مئوية لأن هذا قد يسبب التفكيك أو هطول الأمطار. أحد القيود الرئيسية للنيوكليوسومات الأسيتية هو عدم استقرارها. قد يكون من المستحيل إجراء فحوصات مسبقة في درجات حرارة أعلى مثل 37 درجة مئوية دون التسبب في هطول الأمطار النووية. إذا سمحت الإجراءات التجريبية، قم بتنفيذها عند 4 درجات مئوية لمنع هطول الأمطار من النيوكليوسوم الأسيتي.
هذه الطريقة لإنتاج النيوكليوسومات مفيدة بشكل خاص لإنتاج النوى المعدلة للتجارب الملزمة وتحديد الهيكل. تنتج هذه الطريقة نواة ذات نقاء أعلى وتسلسل الحمض النووي النووي المعروف ، مما يزيل المتغيرات المحيرة مما يؤدي إلى تجارب أفضل تحكما وصورا عالية الدقة. من المهم بالنسبة لتحديد البنية أن تكون العينة النووية متجانسة مع تسلسل الحمض النووي المعروف ، وإلا سيكون من المستحيل الحصول على صور عالية الدقة.
هناك وفرة من التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة. على وجه التحديد، في مجال علم الوراثة اللاجينية. يمكن أن يكون من الصعب بشكل لا يصدق للحصول على البروتينات المعدلة. الحصول على البروتينات المعدلة أمر بالغ الأهمية للتحقيق في بنية ووظيفة الكتاب والقراء والممحاة في العديد من المسارات اللاجينية التي لا تفهم بشكل جيد. لقد سبق لنا استخدام هذه التقنية للتحقيق في إمكانية الوصول إلى الحمض النووي النوى إلى الهضم Pst1 في مواقع أستيل H3 K18 و K36 و K56 عن طريق تجميع كل ثماني متحولة مع تسلسل الحمض النووي المعدلة 601 الذي يحتوي على موقع الهضم Pst1. ويمكن مواصلة تعديل هذه التقنية لتشمل NCAAs أخرى غير ACK. PylRS يمكن أن تكون هندسية لدمج مجموعة من NCAAs أخرى. كما قمنا بدمج Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysine (AzHeK) بواسطة كودون العنبر في الإشريكية القولونية للتعبير المؤتلف عن العديد من بروتينات الهستون H3 المحتوية على AzHeK للتحقيق في نشاط إزالة الهستون من SIRT7 في العديد من مواقع الأستيل. وكشف هذا النهج أن SIRT7 لديه نشاط عال نحو إزالة التكسير من H3K36 ونشطة أيضا تحفيزيا لdeacylate H3K37. H3K36 deacylation كما تبين أن تعتمد على النيوكليوسوم ويمكن تعزيزها بشكل كبير عن طريق إضافة الحمض النووي قصيرة مزدوجة تقطعت بهم السبل إلى الركيزة أسيل نوكليوسوم الذي يحاكي الحمض النووي جسر بين النيوكليوسومات في الكروماتين الأصلي6.
ويمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لإنتاج النوى البرية نوع مع عدم وجود تعديلات التي يمكن أن تكون مفيدة في مجموعة متنوعة من السيناريوهات. نشرت مجموعتنا مؤخرا هيكلا بالتعاون مع مجموعة الدكتور بينغوي لي يظهر الربط الضيق ل GMP-AMP synthase الدوري (cGAS) إلى رقعة حمضية مشحونة سلبيا شكلتها هيستون H2A و H2B عبر موقعها الثاني لربط الحمض النووي11. cGAS هو جهاز استشعار dsDNA الذي يحفز تخليق cGAMP dinucleotide دوري، الذي يتوسط التعريفي من النوع الأول الإنترفيرونات من خلال ستينغ-TBK1-IRF3 إشارات المحور12،13،14،15،16.
الفائدة من استخدام النوى المجمعة بالكامل هو أنه يشبه بشكل وثيق الحالة الأصلية للنيوكليوسومات بمثابة نموذج أفضل للتحقيق في الأنشطة أو قدرات ملزمة لأي عدد من البروتينات ذات الصلة اللاجينية. هناك العديد من الأمثلة على نشاط إنزيم محدود أو غائب تماما نحو الحمض النووي العاري أو ركائز الببتيد الهستونية التي عندما يتم فحصها مع ركائز النيوكليوسوم تغير النتائج بشكل كبير. وكما هو الحال مع المثال المذكور أعلاه، تم اكتشاف موقع جديد لإلغاء الازيل ل SIRT7 باستخدام ركيزة نوكليوسوم كان من الممكن أن تكون غير معروفة لولا ذلك. من المهم استخدام الركائز الأصلية عند فحص هذه الأنواع من الأنظمة. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في نشاط القراءة والكتابة والمحو أو القدرة على الربط لأي تعديل يمكن دمجه من خلال تقنية توسيع الشفرة الوراثية للبيروليزين. وsynthetase pyrrolysyl-tRNA هو بالفعل مشوشة أصلا، وقد تم هندستها لمجموعة من الركائز الأخرى بالفعل فتح الباب لاستخدام هذه التقنية في أي عدد من النظم مما يجعل عامل الحد الأساسي إبداع الباحث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا توجد مصالح مالية متنافسة يعلن عنها أي من أصحاب البلاغ.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور ويسلي وانغ على إرساء الأساس لهذا البروتوكول وإرشاده القيم. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح R01GM127575 وR01GM121584) ومؤسسة ويلش (منحة A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
