Summary
Här presenterar vi en metod för att uttrycka acetylerade histonproteiner med hjälp av genetisk kodexpansion och montera rekonstituerade nukleosomer in vitro.
Abstract
Acetylerade histonproteiner kan enkelt uttryckas i Escherichia coli kodning av en mutant, Nε-acetyl-lysin (AcK)-specifika Methanosarcina mazi pyrrolysin tRNA-synthetas (MmAcKRS1) och dess cognate tRNA (tRNAPyl)för att montera rekonstituerade mononukleosomer med platsspecifika acetylerade histoner. MmAcKRS1 och tRNAPyl levererar AcK på en bärnstensfärgad mutationsplats i det mRNA som val under översättning i Escherichia coli. Denna teknik har använts i stor utsträckning för att införliva AcK på H3 lysin platser. Pyrrolysyl-tRNA syntetas (PylRS) kan också lätt utvecklas för att införliva andra icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) för platsspecifik proteinmodifiering eller funktionalisering. Här beskriver vi en metod för att införliva AcK med MmAcKRS1-systemet i histon H3 och integrera acetylerade H3-proteiner i rekonstituerade mononukleosomer. Acetylerade rekonstituerade mononukleosomer kan användas i biokemiska och bindande analyser, strukturbestämning och mer. Att få modifierade mononukleosomer är avgörande för att utforma experiment relaterade till att upptäcka nya interaktioner och förstå epigenetik.
Introduction
Vi har använt PylRS och tRNAPyl för att syntetisera och montera rekonstituerade mononukleosomer med platsspecifika acetylerade histoner. PylRS har visat sig vara ovärderligt som ett genetiskt kodexpansionsverktyg för att producera proteiner med post translationella modifieringar (PTMs) och har utvecklats genetiskt för att införliva cirka 200 olika ncAAs. PylRS införlivar vid en bärnstensfärgad stoppkodon, tar bort konkurrens från andra aminosyror under översättning. PylRS upptäcktes först i metanogenic arké, och har sedan dess använts i kemisk biologi för att införliva nya reaktiva kemiska grupper iproteiner 1,2.
MmAcKRS1 utvecklades från Methanosarcina mazei PylRS och används ofta i vårt laboratorium för syntes av acetyleradeproteiner 3,4,5,6. MmAcKRS1 levererar AcK på en bärnstensfärgad mutationsplats i det mRNA som du väljer under översättningen i Escherichia coli. Denna teknik har tidigare använts för att införliva AcK vid K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 och K79 histon H3 lysin platser för att studera aktiviteten hos Sirtuin 1, 2, 6 och 7 på acetylerade mononukleosomer4,5,6. Här beskriver vi denna metod för att uttrycka acetylerade histoner och rekonstituerade acetylerade nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
- Börja med att bestämma vilket histonprotein som ska acetyleras och på vilken lysinplats. Mutera platsen till bärnstensfärgade stop codon (TAG) med hjälp av platsstyrd mutagenes.
OBS: Det finns fyra tidigare utformade plasmider som används för uttryck av histonproteiner. Alla fyra hisstone proteiner klonades till pETDuet-1 vektor med en N-terminal histidin tagg. Histone H4 innehåller också en SUMO-tagg, ursprunget till replikeringskolE1 med ett kopieringsnummer på cirka 40, ampicillinbeständig och en T7-promotor.- Designa framåt och omvända primers som innehåller en TAG-mutation på önskad plats (ersätter en befintlig lysinkodon med bärnstensfärgad stoppkodon) i en av de fyra histonproteinplasmiderna.
- Använd hela plasmid PCR för att förstärka TAGG som innehåller plasmid. Bestäm en lämplig glödgningstemperatur för primers. I allmänhet kommer smälttemperaturen (Tm)för primers minus 5 °C att vara tillräcklig. Om det är svårt att få tag på en PCR-produkt kan en temperaturgradient runt Tm - 5 °C användas för att optimera glödgningstemperaturen för förstärkning.
OBS: I detta experiment användes ett internt uttryckt PFU-polymeras i 30 cykler med följande villkor: 94 °C för 30 s (denaturering), glödgningstemperatur för 30 s och 72 °C i 6 min (eller 1 min per kilobaspar). För mer information om denna typ av PCR-metod se Liu och Naismith7. - Rengör PCR-produkten med ett PCR-rengöringskit genom att följa tillverkarens protokoll. Analysera PCR-produkten med agarose gel elektrofores och efterföljande ethidiumbromid färgning.
- Ligate plasmiden, genom att inkubera med T4 ligase över natten på °C 16.
- Omvandla först taggen som innehåller plasmid (AmpR)till kemiskt kompetent Escherichia coli. Välj minst 4 kolonier från omvandlingen och rena plasmiden. Gör celllager av var och en med glycerol med standardmetoder och lagra vid -80 °C. Skicka för sekvensering för att bekräfta önskad TAG-mutation.
- När sekvensen har bekräftats, omvandla den TAG-innehållande plasmiden (AmpR)med pEVOL-AckRS (ChlR)till kemiskt kompetent CobB (den enda histonlytindeacetylas som är känd i E. coli.) borttagning BL21-celler med hjälp av värmechockmetoden. pEVOL är en plasmid med ett mellankopienummer till lågt kopianummer p15A ursprung.
OBS: PEVOL-serien av plasmider konstruerades baserat på tidigare studier som visade ett ökat uttryck för orthogonal aaRS/tRNATyr-paret var effektivt för att minska proteintrimeringen och öka den totala avkastningen av mutanta proteiner8. Om CobB-borttagningsceller inte är tillgängliga, fortsätt med kemiskt kompetenta BL21-celler. CobB är en Sirtuin-liknande histon lysindeacetylas och nikotinamid kan tillsättas vid en 5 mM slutlig koncentration under histonproteinuttryck för att hämma CobB som ett alternativt tillvägagångssätt9. - Gör ett celllager och förvara vid -80 °C.
2. Acetylerat histonproteinuttryck
- Förbered 1 L autoklaverat 2YT-medium (eller valfri volym) i en odlingskolv.
- Inokulera 20 ml 2YT-medier som innehåller lämpliga antibiotika med det samtransformerade cellbeståndet som har tag-innehållande plasmid (AmpR)och pEVOL-AckRS (ChlR)och växer vid 37 °C till OD = 0, 6 (4-6 h).
- Tillsätt lämpliga antibiotika till 1 L autoklaverade 2YT-medier och inokulera med 20 ml startkultur. Odla vid 37 °C till OD = 0,6-0,8 (2-3 h).
- Tillsätt inducerande medel och acetyllysin (AcK) till de slutliga koncentrationerna av IPTG 1 mM, 0, 2% arabinose och AcK 5 mM.
- Odla kulturen vid 37 °C i 6-8 h.
- Pelletsceller på 2 700 x g i 15 min.
- Förvara cellpelleten vid -80 °C över natten.
- Från och med nu håller du provet på is hela tiden. Lös upp cellpelleten i 50 ml histonlysbuffert per 1 L kultur.
- Sonicate enligt följande cykel: 1 s på, 1 s off, totalt i tid: 3 min vid 60% amplitud.
- Pelletsinkluderingskroppar på 41 600 x g i 45 min.
- Kassera supernatant och återanvända inneslutningskroppar i 30 ml histonlysbuffert. Pelletsinkludering bådar på 41 600 x g i 30 min.
- Kassera supernatant och återanvända inneslutningskroppar i 30 ml pelletstvättbuffert. Pelletsinkluderingskroppar på 41 600 x g i 30 min.
- Kassera supernatanten och lös upp inneslutningskropparna i 25 ml 6 M Guanidinhydrokloridbuffert (GuHCl). Inkubera med omrörning vid 37 °C i 1 timme.
OBS: Vid behov kan inklusionskroppar inkuberas med agitation över natten vid 4 °C. - Pelletsinkludering bådar på 41 600 x g i 45 min. Inkubera supernatanten med 1 ml Ni-NTA harts jämvikt med 6 M GuHCl-buffert i 2 timmar.
- Fortsätt med Ni-NTA-rening under denaturerade förhållanden. Tvätta kolonnen med 3 kolumnvolymer av kolonntvättbuffert. Elute acetylerat histonprotein med 10 ml elueringsbuffert.
OBS: Försöker koncentrera proteinet här är ett alternativ men acetylerade histoner är mycket oförutsägbara och kan lätt fälla ut. Det rekommenderas inte att koncentrera sig över 2 ml i total volym. - Dialysera det acetylerade histonproteinet kraftigt mot 5% ättiksyrabuffert för att avlägsna salter. Dialysera i 3 timmar åt gången vid 4 °C och växla mot färsk buffert minst 6 gånger.
OBS: För förbättrad proteinrenhet finns det möjlighet att dialysera mot rent vatten. Detta orsakar dock betydande nederbörd och minskning av utbytet som kan vara oönskade för lågkastande acetylerade histonproteiner. - Aliquot och lyophilize protein, och lagra på obestämd tid vid -80 °C. Vilda typ av histonproteiner ger i allmänhet 10-50 mg/L medan acetylerade histonproteiner ger mindre än 10 mg/L beroende på det specifika lysinstället. Till exempel, H3K79Ac genomsnitt 5 mg/L.
3. Proteinuttryck av vild typ
- För att montera fulla nukleosomer, uttryck alla 4 histonproteiner. Vid uttryck och rening av vilda histoner är protokollet detsamma som de acetylerade histonerna utom följande:
- Utför inte samomvandling. Använd inte pEVOL-AcKRS för hög typ av histonuttryck. Justera antibiotika därefter.
- Använd inte en CobB-borttagningscelllinje eller tillsätt nikotinamid, ack eller arabinos vid induktion av cellulära uttryck.
4. Beredning av 601 DNA
OBS: En tidigare utformad optimerad DNA-sekvens för att rikta nukleosompositionering monteras med histonoktamers för att producera mononukleosom med hög effektivitet. Denna sekvens kallas 601 DNA eller Widom-sekvensen. Denna sekvens har blivit den vanliga DNA-sekvensen för in vitro-studier av nukleosomer från kromatinombyggnadsanalyser till mätningar av enenda molekyl 10.
- För att förbereda betydande mängder 601 DNA för nukleosommontering, omvandla pGEM-3z/601 till topp 10-celler och odla 10 ml kultur för plasmidförstärkning och extraktion. Använd ett plasmidextraktionskit och följ tillverkarens rekommendation.
- Använd ett internt uttryckt PFU-polymeras (effektivare) för detta förstärkningsprotokoll. Ställ in en PCR-reaktion: För 250 μL-reaktion, Använd 207,5 μL autoklaverad MQ H2O, 25 μL 10x PFU-buffert, 5 μL framåtprimer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Omvänd primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP-blandning, 2,5 μL PFU-enzym. Vi kör vanligtvis 60 reaktioner på en gång för att få tillräckligt med DNA för att montera.
- Använd en glödgningstemperatur på 52 °C i 30 s och en förlängningstid på 30 s om PFU-polymeras används. Följ annars tillverkarnas rekommenderade villkor.
- När PCR är klar, använd en PCR-rengöringssats för att rena PCR-produkten.
5. Montering av histon oktamer
- Lös upp alikvoter av histonproteinpellets H2A, H2B, H3 och H4 så att det finns ett separat lager av varje histonprotein i GuHCl Buffer med en total volym på 100 μL.
- Beräkna koncentrationen av varje histonprotein genom att mäta A280-absorbansen.
- Om absorbansen är större än 1 för något protein, späd med GuHCl-buffert för att få en mer exakt koncentration.
- Kombinera H2A- och H2B-proteiner i ett 1:1-molarförhållande och späd till en total proteinkoncentration på 4 μg/μL. Upprepa för H3 och H4.
- Dialys sekventiellt vid 4 °C mot 2 M TE-buffert över natten, 1 M TE-buffert för 2 h och 0,5 M TE-buffert i 5 timmar.
OBS: Det andra och tredje dialyssteget orsakar instabila konformationer av protein att fälla ut. Det förväntas att se skurkrollutfällning på dessa kliver. - Avlägsna fällningar genom centrifugering vid 16 800 x g vid 4 °C.
- Beräkna återigen koncentrationen av histondämpare (H2A/H2B-blandning) och tetramerer (H3/H4-blandningen) som mäter A280-absorbansen.
- Blanda dimrar och tetramerer i ett 1:1 molarförhållande och justera NaCl till 2 M genom tillsats av fast NaCl.
- Histone octamer kan förvaras vid 4 °C och är stabilare än dimrar och tetramerer. Frys aldrig histone octamer eftersom detta kan orsaka demontering.
- Om montering med acetylerade histoner, helt enkelt ersätta det vilda typproteinet med det acetylerade proteinet i proceduren.
6. Nukleosommontering
- Använd 100x TE-buffert och solid NaCl för att justera 601 DNA till 2M TE-buffert. Tillsätt 601 DNA i 2M TE-buffert till histonoktamer i ett molarförhållande på 0,85:1 till 0,90:1. Ett lägre dna-förhållande kan läggas till om fritt DNA finns i gelförskjutningsanalysen.
- Överför DNA-histonblandningen en dialyspåse och placera i ca 200 ml 2M TE-buffert (eller mer om du monterar flera prover) och rör försiktigt vid 4 °C.
- Ställ in en peristaltisk pump för att rensa för att långsamt droppa i ingen salt TE-buffert. När volymen har ungefär fördubblats, häll ut halva volymen. Gör detta minst 4 gånger totalt. Med en pump kan detta ta 4-8 h beroende på startvolymen. Nukleosomer bildas när saltkoncentrationen reduceras till 150 mM (mätt med salthaltsmätare).
- Efter att saltkoncentrationen har reducerats till 150 mM, dialysera mot en 20 mM TE-buffert över natten.
- Avlägsna fällningar genom centrifugering och mät kärnomens koncentration med A260-avläsning med hjälp av en plåtläsare.
- Tillsätt His-TEV protease (TEV: nukleosom 1:30, w:w ) och inkubera över natten vid 4 °C för att ta bort alla histidintaggar. Ta bort histidintagarförnödenheterna från nukleosomlösningen genom att Ni-NTA harts dra ner.
- För att placera kärnan och homogenisera provet, inkubera vid 60 °C i 1 timme.
OBS: För acetylerade platser som är särskilt instabila, detta steg kanske inte är tillrådligt. - Förvara nukleosomer på kort sikt (några veckor) vid 4 °C.
- För långtidslagring, dialyskärnor mot lagringsbuffert och förvaras vid -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimrar, tetramerer och oktamers kan bedömas genom att köra en 12% SDS PAGE gel (Figur 1 och Figur 2). Här kan du se att några av de acetylerade tetramererna har ett lägre utbyte än andra (Figur 1). Faktum är att ju närmare kärnregionen, desto lägre avkastning observerades. Detta beror sannolikt på att acetyleringen stör monteringen av tetramern ju närmare du kommer kärnregionerna. En liknande påverkan observeras efter montering av oktamers (figur 2). Efter montering av oktamers med 601 DNA-sekvens kan kärnan bedömas med en 5% 1x TBE Native PAGE gel följt med färgning med ethidiumbromid (Figur 3). Före TEV-matsmältningen observeras nukleosombandet nära 10k basparmärket. Efter TEV-matsmältningen skiftar nukleosombandet nedåt i förhållande till stegen. Före termisk positionering kommer de observerade nukleosombanden att vara mycket breda och eventuellt strimma (figur 4).
Figur 1:Histone dimers och tetramerer. Representativ 12% SDS PAGE gel av vild typ histon dimer (körfält 2) och H3 acetylerade tetramerer (körfält 3-9). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Histone octamers. Representativ 12% SDS PAGE gel av H3 acetylerade histon oktamers (körfält 2-11). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Monterade sitt märkta H3K64Ac-nukleosomkomplex. Representativ 1x TBE Native PAGE gel av H3K64Ac nukleosomkomplex (körfält 2) jämfört med gratis 601 DNA (Lane 4) visualiserat av ethidiumbromid. Körfält 3 visar H3K64Ac nukleosom efter inkubation vid 60 °C i en timme. Det observeras i körfält 3 att alla kärnor har demonterats. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Monterat TEV smält nukleosomkomplex. Representativ 1x TBE Native PAGE gel av vild typ TEV smält nukleosom komplex och fri 601 DNA. En jämförelse av före och efter nukleosom termisk positionering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att följa detta protokoll i varje detalj under ett experiment. Nukleosomer är inte särskilt stabila och mycket försök och fel har gått till att bestämma detta protokoll. Det är viktigt att ta bort fällningar i varje steg (eller när det observeras) eftersom partiklar lätt kan störa monteringsprocesserna. Förvara alltid histonsprover på is. Om nukleosomer lagras vid 4 °C för länge kan de spontant demonteras. Var noga med att kontrollera eventuella prover från Native PAGE om de förvaras vid 4 °C i mer än 2 veckor före användning i något experiment. Undvik virvelkjolar och nukleosomer eftersom detta också kan leda till att de demonteras. Om problem uppstår att montera dimers, tetramerer eller oktamers är detta vanligtvis vägledande för dålig proteinkvalitet. Kontrollera proteinkvaliteten med 15% SDS-PAGE. Ett alternativ om proteinrenhet är låg är att dialysera proteinet mot rent vatten. Detta kommer att orsaka kraftig nederbörd och kraftigt minska proteinutbytet, men kommer att producera ett renare prov. Inkorporering och nukleosomal stabilitet för varje histon acetylering webbplats varierar kraftigt. I allmänhet är ju närmare platsen är N-terminaldomänen, desto lägre utbyte under histonproteinuttryck. För nukleosomstabilitet är ju närmare acetyleringsstället är nukleosomkärnan eller DNA-bindningsställena, desto mindre stabil är den monterade kärnan. Om stabilitetsproblem uppstår är det viktigt att alltid hålla nukleosomprovet på is. Det kan vara nödvändigt att utelämna nukleosompositioneringssteget vid 60 °C eftersom detta kan orsaka demontering eller nederbörd. En stor begränsning av acetylerade nukleosomer är deras instabilitet. Det kan vara omöjligt att förforma analyser vid högre temperaturer som 37 °C utan att orsaka nukleosomutfällning. Om experimentella förfaranden tillåter, utför dem vid 4 °C för att förhindra utfällning av den acetylerade kärnan.
Denna metod för att producera nukleosomer är särskilt användbar för att producera modifierade nukleosomer för bindande experiment och strukturbestämningar. Denna metod producerar nukleosomer med högre renhet och en känd nukleosomal DNA-sekvens, vilket eliminerar förvirrande variabler som resulterar i bättre kontrollerade experiment och bilder med högre upplösning. Det är avgörande för strukturbestämningar att nukleosomprovet är homogent med en känd DNA-sekvens, annars blir det nästan omöjligt att få högupplösta bilder.
Det finns ett överflöd av potentiella tillämpningar av denna metod. Specifikt inom epigenetik. Det kan vara otroligt svårt att få modifierade proteiner. Att få modifierade proteiner är avgörande för att sondera strukturen och funktionen hos författare, läsare och suddgummi i de många epigenetiska vägarna som är dåligt förstådda. Vi har tidigare använt denna teknik för att undersöka tillgängligheten av nukleosomal DNA till Pst1 matsmältning vid H3 acetylering platser K18, K36 och K56 genom att montera varje mutant oktamer med en modifierad 601 DNA-sekvens som innehåller en Pst1 matsmältning webbplats. Denna teknik kan modifieras ytterligare för att införliva andra nationella behöriga myndigheter än AcK. PylRS kan konstrueras för att införliva en mängd andra nationella behöriga myndigheter. Vi har också införlivat Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysin (AzHeK) av bärnsten kodon i Escherichia coli för rekombinant uttryck av flera AzHeK-innehållande histon H3 proteiner för att undersöka histon deacylation verksamhet sirt7 på flera acetylering platser. Detta tillvägagångssätt visade att SIRT7 har hög aktivitet mot deacylering av H3K36 och är också katalytiskt aktiv för att deacylera H3K37. H3K36 deacylation visade sig vidare vara nukleosomberoende och kan förbättras avsevärt genom att lägga till ett kort dubbelsträngat DNA till akrylkärna substrat som efterliknar överbryggande DNA mellan nukleosomer i inhemska kromatin6.
Den här metoden kan också ändras för att producera vilda nukleosomer utan ändringar som kan vara användbara i en mängd olika scenarier. Vår grupp publicerade nyligen en struktur i samarbete med Dr. Pingwei Lis grupp som visar den snäva bindningen av cyklisk GMP-AMP-syntas (cGAS) till en negativt laddad sur patch bildad av histon H2A och H2B via sin andra DNA-bindningsplats11. cGAS är en dsDNA-sensor som katalyserar syntesen av en cyklisk dinukleotid cGAMP, som förmedlar induktion av typ I-interferoner genom STING-TBK1-IRF3-signalaxeln12,13,14,15,16.
Fördelen med att använda helt monterade nukleosomer är att det mer liknar det ursprungliga tillståndet hos nukleosomer som fungerar som en bättre modell för att undersöka aktiviteter eller bindningsförmåga hos ett antal epigenetiska relaterade proteiner. Det finns många exempel på begränsad eller helt frånvarande enzymaktivitet mot nakna DNA- eller histonpeptidsubstrat som när de undersöks med nukleosomsubstrat drastiskt förändrar resultaten. Som med exemplet ovan upptäcktes en ny deacylation webbplats för SIRT7 med hjälp av en nukleosom substrat som annars skulle ha varit okänd. Det är viktigt att använda inhemska substrat när man undersöker dessa typer av system. Denna teknik kan användas för att undersöka avläsnings-, skriv- och raderingsaktiviteten eller bindningsförmågan hos alla modifieringar som kan införlivas av pyrrolysingenetisk kodexpansionsteknik. Pyrrolysyl-tRNA-syntasen är redan infödd promiskuös och har konstruerats för en mängd andra substrat som redan öppnar dörren för att använda denna teknik i ett antal system vilket gör den primära begränsande faktorn forskarens kreativitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen att deklarera av någon av författarna.
Acknowledgments
Vi vill tacka dr Wesley Wang för att han lade grunden för protokollet och hans värdefulla mentorskap. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (Grants R01GM127575 och R01GM121584) och Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
