Summary
Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.
Abstract
Proteínas histonas acetiladas podem ser facilmente expressas em Escherichia coli codificando um mutante, Nε-acetil-lysine (AcK)-específica Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) e seu tRNA cognato (tRNAPyl) para reunir mononucleosmos estabelecidos com histones acetiladas específicas. MmAcKRS1 e tRNAPyl entregam AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica tem sido usada extensivamente para incorporar AcK em locais de lise H3. A sithetase pirrolysíl-tRNA (PylRS) também pode ser facilmente evoluída para incorporar outros aminoácidos não-orônicos (ncAAs) para modificação ou funcionalização de proteínas específicas do local. Aqui detalhamos um método para incorporar o AcK usando o sistema MmAcKRS1 no histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas em mononucleosmos reconstituídos. Mononucleososes reconstituídos acetilados podem ser usados em ensaios bioquímicos e de ligação, determinação da estrutura e muito mais. A obtenção de mononucleosmos modificados é crucial para projetar experimentos relacionados à descoberta de novas interações e compreensão da epigenética.
Introduction
Utilizamos PylRS e tRNAPyl para sintetizar e montar mononucleosmos reconstituídos com histones acetilados específicos do local. A PylRS provou ser inestimável como uma ferramenta de expansão de código genético para produzir proteínas com modificações pós-translacionais (PTMs) e foi geneticamente evoluída para incorporar cerca de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora em um códon de parada âmbar, removendo a concorrência de outros aminoácidos durante a tradução. PylRS foi descoberto pela primeira vez na arquiaia metogênica, e desde então tem sido utilizado em biologia química para incorporar novos grupos químicos reativos em proteínas1,2.
O MMAcKRS1 foi evoluído de Metanoosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizado em nosso laboratório para a síntese de proteínas acetiladas3,4,5,6. MmAcKRS1 fornece AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica foi usada anteriormente para incorporar ack em k4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, e K79 histone H3 lysine sites para estudar a atividade de Sirtuin 1, 2, 6, e 7 em mononucleosmos acetilados4,5,6. Aqui detalhamos este método para expressar histones acetilados e nucleosómos acetilados reconstituídos.
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Protocol
1. Construção plasmid
- Comece decidindo qual proteína de histona será acetilada e em qual sítio de lise. Mutação do site para o codon de parada âmbar (TAG) usando mutagênese direcionada ao site.
NOTA: Existem quatro plasmídeos previamente projetados utilizados para a expressão de proteínas histonas. Todas as quatro proteínas histonas foram clonadas no vetor pETDuet-1 com uma etiqueta de histidina n-terminal. Histone H4 também inclui uma tag SUMO, a origem do colE1 de replicação com um número de cópia de aproximadamente 40, resistente à ampicilina, e um promotor T7.- Projete primers para frente e reverso que contenham uma mutação TAG no local desejado (substituindo um codon de lysina existente pelo codon de parada âmbar) em um dos quatro plasmídeos de proteína histona.
- Use PCR de plasmídeo inteiro para amplificar o TAG contendo plasmídeo. Determine uma temperatura de ressarcial apropriada para os primers. Em geral, a temperatura de fusão (Tm)dos primers menos 5 °C será suficiente. Se houver dificuldade para obter um produto PCR, um gradiente de temperatura em torno de Tm - 5 °C pode ser usado para otimizar a temperatura de ressarcimento para amplificação.
NOTA: Neste experimento foi utilizada uma polimerase pfu expressa internamente para 30 ciclos com as seguintes condições: 94 °C para 30 s (desinaturação), temperatura de ressarcial para 30 s e 72 °C para 6 min (ou 1 min por quilobase-pares). Para obter mais detalhes sobre este tipo de método PCR, consulte Liu e Naismith7. - Limpe o produto PCR com um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante. Analise o produto PCR por eletroforese de gel agarose e posterior coloração de brometo de ethidium.
- Liga o plasmídeo incubando com liga ligase T4 durante a noite a 16 °C.
- Primeiro transforme a TAG contendo plasmídeo (AmpR)em Escherichia coliquimicamente competente . Escolha um mínimo de 4 colônias da transformação e purifique o plasmídeo. Faça estoques de células de cada um com glicerol usando métodos padrão e armazene a -80 °C. Envie para sequenciamento para confirmar a mutação TAG desejada.
- Uma vez confirmada a sequência, co-transforme o plasmídeo contendo TAG (AmpR) com pEVOL-AckRS (ChlR) em CobB quimicamente competente (a única deacetylase histone lysine conhecida em células BL21 de E. coli.) usando o método de choque térmico. pEVOL é um plasmid com um número de cópia média para baixo número de cópia p15A de origem.
NOTA: A série pEVOL de plasmídeos foi construída com base em estudos anteriores que mostraram uma expressão aumentada do par ortogonal aaRS/tRNATyr foi eficaz na diminuição da truncação proteica e no aumento do rendimento global das proteínas mutantes8. Se as células de exclusão de CobB não estiverem acessíveis, proceda com células BL21 quimicamente competentes. CobB é uma deacetilase de histonina de histonina e nicotinamida semelhante a histuina sirtuina e nicotinamida pode ser adicionada a uma concentração final de 5 mM durante a expressão da proteína histona para inibir o CobB como uma abordagem alternativa9. - Faça um estoque de celular e armazene a -80 °C.
2. Expressão de proteína histona acetilada
- Prepare 1 L de mídia 2YT autoclaved (ou volume de escolha) em um frasco de cultura.
- Inocular 20 mL de mídia 2YT contendo os antibióticos apropriados com o estoque de células co-transformadas que tem o plasmídeo contendo TAG (AmpR) e pEVOL-AckRS (ChlR) e crescer a 37 °C a OD = 0,6 (4-6 h).
- Adicione os antibióticos apropriados ao 1 L de mídia 2YT autoclaved e inoculada com a cultura inicial de 20 mL. Cresça a 37 °C a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).
- Adicione agentes indutores e acetilizesina (AcK) às concentrações finais de IPTG 1 mM, 0,2% arabinose e AcK 5 mM.
- Cresça a cultura a 37 °C para 6-8 h.
- Células de pelota a 2.700 x g por 15 min.
- Armazene a pelota da célula a -80 °C durante a noite.
- A partir deste passo em diante mantenha a amostra no gelo o tempo todo. Dissolva a pelota celular em 50 mL de tampão de histona por 1 L de cultura.
- Sonicate de acordo com o seguinte ciclo: 1 s on, 1 s off, total at time: 3 min a 60% de amplitude.
- Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 45 min.
- Descarte os corpos de inclusão de supernasciente e resuspend em 30 mL de tampão de histona. A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 30 min.
- Descarte os corpos de inclusão supernasce e resuspend em 30 mL de tampão de lavagem de pelotas. Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 30 min.
- Descarte os corpos de inclusão supernasce e dissolvido em 25 mL de 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl). Incubar com agitação a 37 °C por 1h.
NOTA: Se necessário, os corpos de inclusão podem ser incubados com agitação durante a noite a 4 °C. - A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 45 min. Incubar o supernaente com 1 mL de resina Ni-NTA equilibrada com tampão guhcl de 6 M por 2 h.
- Prossiga com a purificação ni-NTA em condições desnaturadas. Lave a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem de coluna. Elute acetilou proteína histona com 10 mL de tampão de eluição.
NOTA: Tentar concentrar a proteína aqui é uma opção, mas histones acetilados são muito imprevisíveis e podem facilmente precipitar. Não é recomendável concentrar-se além de 2 mL em volume total. - Digele extensivamente a proteína histona acetilada contra 5% de tampão de ácido acético para remover sais. Dialisar por 3h de cada vez a 4 °C, trocando por tampão fresco mínima de 6 vezes.
NOTA: Para uma melhor pureza proteica, há a opção de diálise contra água pura. No entanto, isso causa precipitação significativa e redução no rendimento que pode ser indesejável para proteínas histonas acetiladas de baixo rendimento. - Aliquot e proteína liofilizada, e armazenar indefinidamente a -80 °C. As proteínas histonas do tipo selvagem geralmente produzem 10-50 mg/L, enquanto as proteínas de histona acetiladas produzem menos de 10 mg/L, dependendo do local específico da lise. Por exemplo, H3K79Ac tem uma média de 5 mg/L.
3. Expressão de proteína histona tipo selvagem
- Para montar nucleossomos completos, expresse todas as 4 proteínas histonas. Ao expressar e purificar histones do tipo selvagem, o protocolo é o mesmo que as histonas acetiladas, exceto as seguintes:
- Não realize a co-transformação. Não use pEVOL-AcKRS para expressão histona tipo selvagem. Ajuste os antibióticos de acordo.
- Não use uma linha celular de exclusão de CobB ou adicione nicotinamida, AcK ou arabinose durante a indução da expressão celular.
4. Preparação de 601 DNA
NOTA: Uma sequência de DNA otimizada previamente projetada para o posicionamento nucleossomo direto é montada com octamers de histona para produzir mononucleossomo com alta eficiência. Esta sequência é referida como 601 DNA ou a sequência de Widom. Esta sequência tornou-se a sequência padrão de DNA para estudos in vitro de nucleososos desde ensaios de remodelação de cromatina até medições de molécula única10.
- Para preparar quantidades significativas de DNA 601 para montagem nucleosômica, transforme pGEM-3z/601 em células Top 10 e cresça 10 mL de cultura para amplificação e extração plasmóides. Use um kit de extração de plasmídeos e siga a recomendação do fabricante.
- Use uma polimerase PFU expressa internamente (mais eficiente) para este protocolo de amplificação. Configure uma reação pcr: Para uma reação de 250 μL, use 207,5 μL autoclaved MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccgg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. Normalmente corremos 60 reações de uma vez para obter DNA suficiente para montar.
- Use uma temperatura de ressarção de 52 °C para 30 s e um tempo de extensão de 30 s se usar polimerase PFU. Caso contrário, siga as condições recomendadas pelos fabricantes.
- Uma vez feito o PCR, use um kit de limpeza PCR para purificar o produto PCR.
5. Montagem de histone octamer
- Dissolva alíquotas de pelotas de proteína histona H2A, H2B, H3 e H4 para que haja um estoque separado de cada proteína histona em Tampão guhcl com um volume total de 100 μL.
- Calcule a concentração de cada proteína histona medindo a absorvância A280.
- Se a absorvância for maior que 1 para qualquer proteína, dilui com o tampão guhcl para obter uma concentração mais precisa.
- Combine proteínas H2A e H2B em uma razão molar de 1:1 e dilua para uma concentração proteica total de 4 μg/μL. Repita para H3 e H4.
- Dialyze sequencialmente a 4 °C contra 2 M TE tampão durante a noite, 1 M TE tampão por 2 h e 0,5 M TE tampão por 5 h.
NOTA: O segundo e terceiro passos da diálise faz com que as conformações instáveis de proteínas precipitam. Espera-se que haja precipitação pesada nestas etapas. - Remova precipitados por centrifugação a 16.800 x g a 4 °C.
- Novamente, calcule a concentração de dimers de histona (mistura H2A/H2B) e tetramers (mistura H3/H4) medindo a absorvância A280.
- Misture dimers e tetramers em uma relação molar de 1:1 e ajuste NaCl para 2 M pela adição de NaCl sólido.
- O octamer histona pode ser armazenado a 4 °C e é mais estável do que os dimers e tetramers. Nunca congele a octamer de histona, pois isso pode causar desmontagem.
- Se montar com histones acetilados, basta substituir a proteína do tipo selvagem pela proteína acetilada no procedimento.
6. Montagem nucleossomo
- Use tampão 100x TE e NaCl sólido para ajustar 601 DNA ao buffer te de 2M. Adicione o DNA 601 em tampão 2M TE ao octamer histona em uma razão molar de 0,85:1 a 0,90:1. Uma menor proporção de DNA pode ser adicionada se o DNA livre estiver presente na análise de mudança de gel.
- Transfira a mistura DNA-histona de um saco de diálise e coloque em cerca de 200 mL de tampão de 2M TE (ou mais se montar várias amostras) e mexa suavemente a 4 °C.
- Ajuste uma bomba peristáltica para limpar para gotejar lentamente sem tampão de TE de sal. Quando o volume tiver aproximadamente dobrado, despeje metade do volume. Faça isso pelo menos 4 vezes no total. Com uma bomba, pode levar de 4 a 8 h, dependendo do volume inicial. Os nucleosmos formam-se quando a concentração de sal é reduzida para 150 mM (medida pelo medidor de salinidade).
- Após a concentração de sal ser reduzida para 150 mM, dilíque contra um buffer TE de 20 mM durante a noite.
- Remova precipitados por centrifugação e meça a concentração dos nucleosmos por uma leitura260 usando um leitor de placas.
- Adicione protease His-TEV (TEV: nucleossomo 1:30, w:w ) e incubar durante a noite a 4 °C para remover todas as tags de histidina. Remova as impurezas da tag histidina da solução nucleossom pela resina Ni-NTA puxada para baixo.
- Para posicionar o nucleossomo e homogeneizar a amostra, incubar a 60 °C por 1h.
NOTA: Para locais acetilados que são particularmente instáveis, esta etapa pode não ser aconselhável. - Armazene nucleososomos por curto prazo (algumas semanas) a 4 °C.
- Para armazenamento a longo prazo, dilyze nucleossomos contra buffer de armazenamento e armazene a -80 °C.
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Representative Results
Dimers, tetramers e octamers podem ser avaliados executando um gel de PÁGINA SDS de 12%(Figura 1 e Figura 2). Aqui você pode ver que alguns dos tetramers acetilados têm um rendimento menor do que outros(Figura 1). De fato, quanto mais perto da região central, menor o rendimento observado. Isso é mais provável devido à acetilação interferindo na montagem do tetramer quanto mais perto você chegar das regiões centrais. Um efeito semelhante é observado após a montagem de octamers(Figura 2). Após a montagem de octamers com sequência de DNA de 601, o nucleossomo pode ser avaliado usando um gel de 5% 1x TBE Native PAGE seguido de coloração com brometo de ethidium(Figura 3). Antes da digestão TEV, a banda nucleossomo é observada perto da marca do par base de 10k. Após as digestões do TEV, a banda nucleossomo muda para baixo em relação à escada. Antes do posicionamento térmico, as bandas nucleossomees observadas serão muito amplas, e possivelmente raia(Figura 4).
Figura 1: Histone dimers e tetramers. Representante 12% SDS PAGE gel de tipo selvagem histone dimer (pista 2) e tetramers acetilados H3 (pistas 3-9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Octamers histone. Representante 12% SDS PAGE gel de H3 acetilado octamers histone (pistas 2-11). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reuniu seu complexo nucleossomo H3K64Ac marcado. Representante 1x Gel de PÁGINA Nativa TBE do complexo nucleossomo H3K64Ac (pista 2) em comparação com o DNA 601 gratuito (Pista 4) visualizado por brometo de etídio. A faixa 3 mostra nucleossomo H3K64Ac após a incubação a 60 °C por uma hora. Observa-se na faixa 3 que todo nucleossomo se desmontou. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Complexo nucleossomo digerido TEV montado. Representante 1x Gel de PÁGINA nativa TBE do tipo selvagem TEV digeriu complexo nucleossomo, e DNA 601 livre. Uma comparação de antes e depois do posicionamento térmico nucleossomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
É essencial seguir este protocolo em cada detalhe durante um experimento. Os nucleosmos não são muito estáveis e muita tentativa e erro foi para determinar este protocolo. É fundamental remover precipitados a cada passo (ou sempre observado) porque as partículas podem interferir facilmente nos processos de montagem. Sempre mantenha amostras de histona no gelo. Se os nucleosómos são armazenados a 4 °C por muito tempo, eles podem desmontar espontaneamente. Certifique-se de verificar quaisquer amostras por Native PAGE se armazenadas a 4 °C por mais de 2 semanas antes de usar em qualquer experimento. Evite octamers vórtices e nucleossomos, pois isso também pode fazer com que eles se desmontem. Se forem encontrados problemas de montagem de dimers, tetramers ou octamers, isso geralmente indica a má qualidade da proteína. Verifique a qualidade da proteína em 15% de SDS-PAGE. Uma opção se a pureza da proteína é baixa é dilisar a proteína contra água pura. Isso causará precipitação pesada e reduzirá muito o rendimento da proteína, mas produzirá uma amostra mais pura. A incorporação e estabilidade nucleosômica de cada sítio de acetilação de histona varia muito. Em geral, quanto mais próximo o local estiver do domínio n-terminal, menor será o rendimento durante a expressão da proteína histona. Para estabilidade nucleosíso, quanto mais próximo o local de acetilação estiver do núcleo nucleossomo ou dos locais de ligação de DNA, menos estável será o nucleossomo montado. Se os problemas de estabilidade forem encontrados, é crucial manter sempre a amostra nucleossomo no gelo. Pode ser necessário omitir a etapa de posicionamento nucleossomo a 60 °C, pois isso pode causar desmontagem ou precipitação. Uma grande limitação dos nucleosmos acetilados é sua instabilidade. Pode ser impossível pré-formar ensaios a temperaturas mais altas, como 37 °C sem causar precipitação nucleosômica. Se os procedimentos experimentais permitirem, execute-os a 4 °C para evitar a precipitação do nucleossomo acetilado.
Este método de produção de nucleosómos é particularmente útil para produzir nucleosómos modificados para experimentos de ligação e determinações estruturais. Este método produz nucleososmos com maior pureza e uma sequência de DNA nucleossômico conhecida, que elimina variáveis confusas que resultam em experimentos mais controlados e imagens de maior resolução. É crucial para as determinações da estrutura que a amostra nucleossomo é homogênea com uma sequência de DNA conhecida, caso contrário, será quase impossível obter imagens de alta resolução.
Há uma abundância de aplicações potenciais deste método. Especificamente, no campo da epigenética. Pode ser incrivelmente difícil obter proteínas modificadas. A obtenção de proteínas modificadas é crucial para sondar a estrutura e a função dos escritores, leitores e borrachas nas muitas vias epigenéticas que são mal compreendidas. Anteriormente, utilizamos esta técnica para sondar a acessibilidade do DNA nucleosômico à digestão Pst1 nos locais de acetilação H3 K18, K36 e K56, montando cada octamer mutante com uma sequência de DNA modificada 601 que contém um local de digestão PST1. Esta técnica pode ser modificada para incorporar NCAAs que não o AcK. PylRS pode ser projetado para incorporar uma série de outras NCAAs. Também incorporamos Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysine (AzHeK) por codon âmbar em Escherichia coli para expressão recombinante de várias proteínas histonas que contêm AzHeK para investigar a atividade de desacylação histone de SIRT7 em vários locais de acetilação. Esta abordagem revelou que sirt7 tem alta atividade para a desacilação de H3K36 e também é catalicamente ativo para desalicalar H3K37. A desálise H3K36 mostrou-se ainda dependente do nucleossomo e pode ser significativamente aprimorada adicionando um DNA de dupla-rosca curto ao substrato acil-nucleossomo que imita o DNA de ponte entre nucleosómos na cromatina nativa6.
Este método também pode ser modificado para produzir nucleosósmos selvagens sem modificações que podem ser úteis em uma variedade de cenários. Nosso grupo publicou recentemente uma estrutura em colaboração com o grupo do Dr. Pingwei Li mostrando a ligação apertada de sintetizador Cíclico GMP-AMP (cGAS) a um patch ácido carregado negativamente formado por histone H2A e H2B através de seu segundo site de ligação de DNA11. cGAS é um sensor dsDNA que catalisa a síntese de um cGAMP dinucleotídeo cÍclico, que media a indução de interferons tipo I através do eixo de sinalização STING-TBK1-IRF312,13,14,15,16.
O benefício do uso de nucleosósmos totalmente montados é que ele se assemelha mais ao estado nativo dos nucleosmos que servem como um modelo melhor para sondar as atividades ou habilidades de ligação de qualquer número de proteínas relacionadas à epigenética. Existem inúmeros exemplos de atividade enzimada limitada ou totalmente ausente em relação ao DNA nu ou substratos de peptídeos histonas que quando sondados com substratos nucleossomos alteram drasticamente os resultados. Como no exemplo mencionado acima, um novo site de desatarlação foi descoberto para SIRT7 usando um substrato nucleossomo que teria sido desconhecido de outra forma. É crucial usar substratos nativos ao sondar esses tipos de sistemas. Esta técnica pode ser usada para sondar a atividade de leitura, escrita e apagamento ou capacidade de vinculação de qualquer modificação que possa ser incorporada pela técnica de expansão do código genético pirrolise. A síntese pirrolysíl-tRNA já é nativamente promíscua e foi projetada para uma série de outros substratos que já abrem a porta para o uso dessa técnica em qualquer número de sistemas que fazem do fator limitante primário a criatividade do pesquisador.
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Disclosures
Não há interesses financeiros concorrentes para declarar por nenhum dos autores.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Wesley Wang por estabelecer as bases para este protocolo e sua valiosa mentoria. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e pela Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
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