Summary
Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.
Abstract
Geacetyleerde histoneiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt in Escherichia coli die codeert voor een mutant, Nε-acetyl-lysine (AcK)-specifieke Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) en zijn cognate tRNA (tRNAPyl) om gereconstitueerde mononucleosomen te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. MmAcKRS1 en tRNAPyl leveren AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om AcK op H3 lysine sites op te nemen. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) kan ook gemakkelijk worden geëvolueerd om andere niet-canonische aminozuren (ncAAs) op te nemen voor sitespecifieke eiwitmodificatie of functionalisatie. Hier beschrijven we een methode om AcK met behulp van het MmAcKRS1-systeem in histon H3 op te nemen en acetylated H3-eiwitten te integreren in gereconstitueerde mononucleosomen. Geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen kunnen worden gebruikt bij biochemische en bindende assays, structuurbepaling en meer. Het verkrijgen van gemodificeerde mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van experimenten met betrekking tot het ontdekken van nieuwe interacties en het begrijpen van epigenetica.
Introduction
We hebben PylRS en tRNAPyl gebruikt om gereconstitueerde mononucleosomen te synthetiseren en te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. PylRS is van onschatbare waarde gebleken als een genetische code-uitbreidingstool om eiwitten te produceren met post translationele modificaties (PTM's) en is genetisch geëvolueerd om ongeveer 200 verschillende NCA's op te nemen. PylRS neemt op bij een amber stop codon, waardoor concurrentie van andere aminozuren tijdens de vertaling wordt verwijderd. PylRS werd voor het eerst ontdekt in methanogene archaea en is sindsdien gebruikt in de chemische biologie om nieuwe reactieve chemische groepen op te nemen in eiwitten1,2.
MmAcKRS1 is geëvolueerd uit Methanosarcina mazei PylRS en wordt vaak gebruikt in ons laboratorium voor de synthese van geacetyleerde eiwitten3,4,5,6. MmAcKRS1 levert AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is eerder gebruikt om AcK op K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 en K79 histon H3 lysine sites te bestuderen om de activiteit van Sirtuin 1, 2, 6 en 7 op geacetyleerde mononucleosomen4,5,6te bestuderen . Hier beschrijven we deze methode om geacetyleerde histonen uit te drukken en geacetyleerde nucleosomen te reconstitueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmide bouw
- Begin met te beslissen welk histoneiwit zal worden geacetyleerd en op welke lysineplaats. Muteer de site naar de amber stop codon (TAG) met behulp van site directed mutagenesis.
OPMERKING: Er zijn vier eerder ontworpen plasmiden die worden gebruikt voor de expressie van histoneiwitten. Alle vier histoneiwitten werden gekloond in de pETDuet-1 vector met een N-terminale histidine tag. Histone H4 bevat ook een SUMO-tag, de oorsprong van replicatie colE1 met een kopienummer van ongeveer 40, ampicillinebestendig en een T7-promotor.- Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers die een TAG-mutatie op de gewenste plaats bevatten (een bestaande lysinecodon vervangen door de amberstopcodon) in een van de vier histoneiwitplasmiden.
- Gebruik whole-plasmid PCR om de TAG met plasmide te versterken. Bepaal een geschikte gloeitemperatuur voor de primers. Over het algemeen is de smelttemperatuur (Tm) van de primers minus 5 °C voldoende. Als er problemen zijn bij het verkrijgen van een PCR-product, kan een temperatuurgradiënt rond Tm - 5 °C worden gebruikt om de gloeitemperatuur voor versterking te optimaliseren.
OPMERKING: In dit experiment werd gedurende 30 cycli een in-house uitgedrukt PFU-polymerase gebruikt met de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 30 s (denaturatie), gloeitemperatuur gedurende 30 s en 72 °C gedurende 6 min (of 1 min per kilobase-paar). Voor meer informatie over dit type PCR-methode zie Liu en Naismith7. - Ruim het PCR-product op met een PCR-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer het PCR-product door agarosegelelektroforese en daaropvolgende ethidiumbromidekleuring.
- Ligateer de plasmide door 's nachts bij 16 °C te broeden met T4-ligase.
- Transformeer eerst de TAG met plasmide (AmpR) in chemisch competente Escherichia coli. Kies minimaal 4 kolonies uit de transformatie en zuiver de plasmide. Maak celvoorraden van elk met glycerol met behulp van standaardmethoden en bewaar bij -80 °C. Stuur voor sequencing om de gewenste TAG-mutatie te bevestigen.
- Zodra de sequentie is bevestigd, co-transformeert u de TAG-bevattende plasmide (AmpR) met pEVOL-AckRS (ChlR) in chemisch competente CobB (de enige histon lysine deacetylase bekend in E. coli.) deletie BL21 cellen met behulp van de hitteschokmethode. pEVOL is een plasmide met een mid-copy-number naar low-copy-number p15A origin.
OPMERKING: De pEVOL-reeks plasmiden werd geconstrueerd op basis van eerdere studies waaruit bleek dat een verhoogde expressie van het orthogonale aaRS/tRNATyr-paar effectief was bij het verminderen van eiwitafkaping en bij het verhogen van de totale opbrengsten van gemuteerde eiwitten8. Als CobB-deletiecellen niet toegankelijk zijn, gaat u verder met chemisch competente BL21-cellen. CobB is een Sirtuin-achtige histonlysine deacetylase en Nicotinamide kan worden toegevoegd bij een 5 mM eindconcentratie tijdens histon eiwitexpressie om CobB te remmen als alternatieve benadering9. - Maak een celvoorraad en bewaar bij -80 °C.
2. Geacetyleerde histon eiwitexpressie
- Bereid 1 L autoclaaf 2YT-media (of volume naar keuze) in een kweekkolf.
- Ent 20 ml 2YT-media met de juiste antibiotica met de co-getransformeerde celvoorraad met de TAG-bevattende plasmide (AmpR) en pEVOL-AckRS (ChlR) en groei bij 37 °C tot OD = 0,6 (4-6 uur).
- Voeg de juiste antibiotica toe aan de 1 L autoclaaf 2YT-media en inenteer met de 20 ml startcultuur. Groeien bij 37 °C tot OD = 0,6-0,8 (2-3 uur).
- Voeg inducerende middelen en acetyllysine (AcK) toe aan de eindconcentraties van IPTG 1 mM, 0,2% arabinose en AcK 5 mM.
- Kweek de cultuur bij 37 °C gedurende 6-8 uur.
- Pelletcellen op 2.700 x g gedurende 15 min.
- Bewaar de celkorrel 's nachts bij -80 °C.
- Houd vanaf deze stap het monster altijd op ijs. Los de celkorrel op in 50 ml histonlysebuffer per 1 L cultuur.
- Sonicaat volgens de volgende cyclus: 1 s aan, 1 s uit, totaal op tijd: 3 min bij 60% amplitude.
- Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 45 min.
- Gooi de supernatant en resuspend inclusie lichamen in 30 ml histon lysis buffer. Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 30 min.
- Gooi de supernatant en resuspend inclusielichamen weg in 30 ml pelletwasbuffer. Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 30 min.
- Gooi het supernatant weg en los inclusielichamen op in 25 ml 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl) buffer. Incubeer met agitatie bij 37 °C gedurende 1 uur.
OPMERKING: Indien nodig kunnen inclusielichamen 's nachts bij 4 °C worden geïncubeerd met agitatie. - Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 45 min. Incubeer het supernatant met 1 ml Ni-NTA hars geëquilibreerd met 6 M GuHCl buffer gedurende 2 uur.
- Ga verder met Ni-NTA zuivering onder gedenatureerde omstandigheden. Was de kolom met 3 kolomvolumes kolomwasbuffer. Elute acetylated histon eiwit met 10 ml elutie buffer.
OPMERKING: Proberen om het eiwit hier te concentreren is een optie, maar geacetyleerde histonen zijn zeer onvoorspelbaar en kunnen gemakkelijk neerslaan. Het wordt niet aanbevolen om zich te concentreren voorbij 2 ml in het totale volume. - Dialyzeer het geacetyleerde histoneiwit uitgebreid tegen 5% azijnzuurbuffer om zouten te verwijderen. Dialyze gedurende 3 uur per keer bij 4 °C, minimaal 6 keer inwisselen voor verse buffer.
OPMERKING: Voor een betere eiwitzuiverheid is er een optie om te dialyseren tegen zuiver water. Dit veroorzaakt echter aanzienlijke neerslag en vermindering van de opbrengst, wat ongewenst kan zijn voor laagproductieve geacetyleerde histoneiwitten. - Aliquot en lyophilize eiwit, en bewaren voor onbepaalde tijd bij -80 °C. Wild type histon eiwitten leveren over het algemeen 10-50 mg/L, terwijl geacetyleerde histon eiwitten minder dan 10 mg/L opleveren, afhankelijk van de specifieke lysine site. H3K79Ac is bijvoorbeeld gemiddeld 5 mg/L.
3. Wild-type histon eiwitexpressie
- Om volledige nucleosomen te assembleren, drukt u alle 4 histoneiwitten uit. Bij het uitdrukken en zuiveren van histonen van het wilde type is het protocol hetzelfde als de geacetyleerde histonen, behalve de volgende:
- Voer geen co-transformatie uit. Gebruik pEVOL-AcKRS niet voor wild type histon expressie. Pas antibiotica dienovereenkomstig aan.
- Gebruik geen CobB-deletiecellijn en voeg geen Nicotinamide, AcK of arabinose toe tijdens inductie van cellulaire expressie.
4. Voorbereiding van 601 DNA
OPMERKING: Een eerder ontworpen geoptimaliseerde DNA-sequentie om nucleosoompositionering te sturen, wordt geassembleerd met histonocomeren om mononucleosoom met een hoog rendement te produceren. Deze sequentie wordt 601 DNA of de Widom-sequentie genoemd. Deze sequentie is de standaard DNA-sequentie geworden voor in vitro studies van nucleosomen van chromatineremodelleringstesten tot metingen met één molecuul10.
- Om aanzienlijke hoeveelheden van 601 DNA voor nucleosoomassemblage te bereiden, transformeert u pGEM-3z/601 in Top 10-cellen en kweekt u 10 ml cultuur voor plasmideversterking en extractie. Gebruik een plasmide-extractiekit en volg de aanbeveling van de fabrikant op.
- Gebruik een in-house uitgedrukte PFU polymerase (efficiënter) voor dit versterkingsprotocol. Stel een PCR-reactie in: Gebruik voor een reactie van 250 μL 207,5 μL autoclaaf MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL. We voeren meestal 60 reacties tegelijk uit om genoeg DNA te krijgen om te assembleren.
- Gebruik een gloeitemperatuur van 52 °C gedurende 30 s en een verlengingstijd van 30 s bij gebruik van PFU-polymerase. Volg anders de door de fabrikant aanbevolen voorwaarden.
- Zodra PCR klaar is, gebruikt u een PCR-opruimkit naar keuze om het PCR-product te zuiveren.
5. Assemblage van histone octamer
- Los aliquots van histon eiwitkorrels H2A, H2B, H3 en H4 op, zodat er een aparte voorraad van elk histoneiwit in GuHCl Buffer is met een totaal volume van 100 μL.
- Bereken de concentratie van elk histoneiwit door de A280-absorptie te meten.
- Als de absorptie groter is dan 1 voor elk eiwit, verdun dan met guhcl buffer om een nauwkeurigere concentratie te krijgen.
- Combineer H2A- en H2B-eiwitten in een molaire verhouding van 1:1 en verdun tot een totale eiwitconcentratie van 4 μg/μL. Herhaal dit voor H3 en H4.
- Dialyseer 's nachts bij 4 °C tegen 2 M TE-buffer, 1 M TE-buffer gedurende 2 uur en 0,5 M TE-buffer gedurende 5 uur.
OPMERKING: De tweede en derde stap van dialyse zorgt ervoor dat onstabiele conformaties van eiwitten neerslaan. Er wordt verwacht dat er bij deze stappen zware neerslag zal vallen. - Verwijder neerslag door centrifugeren bij 16.800 x g bij 4 °C.
- Bereken nogmaals de concentratie histon dimers (H2A/H2B mengsel) en tetrameren (H3/H4 mengsel) die de A280 absorptie meten.
- Meng dimers en tetrameren in een molaire verhouding van 1:1 en stel NaCl in op 2 M door toevoeging van vaste NaCl.
- Histon octameer kan worden bewaard bij 4 °C en is stabieler dan dimers en tetrameren. Bevries nooit zijn toonoctameer, omdat dit demontage kan veroorzaken.
- Als u zich assembleert met geacetyleerde histonen, vervangt u gewoon het wilde type eiwit door het geacetyleerde eiwit in de procedure.
6. Nucleosoomassemblage
- Gebruik 100x TE buffer en solid NaCl om 601 DNA aan te passen aan 2M TE buffer. Voeg het 601 DNA in 2M TE buffer toe aan histon octameer in een molaire verhouding van 0,85:1 tot 0,90:1. Een lagere verhouding DNA kan worden toegevoegd als er vrij DNA aanwezig is in de gelverschuivingsanalyse.
- Breng het DNA-histonmengsel over in een dialysezak en plaats het in ongeveer 200 ml 2 M TE-buffer (of meer bij het samenstellen van meerdere monsters) en roer heel voorzichtig bij 4 °C.
- Stel een peristaltische pomp in om te zuiveren om langzaam te druppelen in geen zout TE-buffer. Wanneer het volume ongeveer verdubbeld is, giet je de helft van het volume uit. Doe dit in totaal minstens 4 keer. Bij een pomp kan dit 4-8 uur duren, afhankelijk van het startvolume. Nucleosomen vormen zich wanneer de zoutconcentratie wordt verlaagd tot 150 mM (gemeten met een zoutgehaltemeter).
- Nadat de zoutconcentratie is verlaagd tot 150 mM, dialyseer u 's nachts tegen een TE-buffer van 20 mM.
- Verwijder neerslag door centrifugeren en meet de concentratie van de nucleosomen met een260-aflezing met behulp van een plaatlezer.
- Voeg His-TEV protease (TEV: nucleosoom 1:30, w:w ) toe en incubeer 's nachts bij 4 °C om alle histidinetags te verwijderen. Verwijder de histidine tag onzuiverheden uit de nucleosoomoplossing door Ni-NTA hars naar beneden te trekken.
- Om het nucleosoom te plaatsen en het monster te homogeniseren, incubeer u gedurende 1 uur bij 60 °C.
OPMERKING: Voor acetylated sites die bijzonder onstabiel zijn, is deze stap mogelijk niet aan te raden. - Bewaar nucleosomen voor korte termijn (enkele weken) bij 4 °C.
- Voor langdurige opslag, dialyze nucleosomen tegen opslagbuffer en opslaan bij -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimers, tetrameren en octameren kunnen worden beoordeeld door een 12% SDS PAGE gel te gebruiken (figuur 1 en figuur 2). Hier kunt u zien dat sommige van de geacetyleerde tetrameren een lagere opbrengst hebben dan andere (Figuur 1). In feite, hoe dichter bij het kerngebied, hoe lager de waargenomen opbrengst. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de acetylatie interfereren met de assemblage van de tetrameer hoe dichter je bij de kerngebieden komt. Een soortgelijk effect wordt waargenomen na het assembleren van octameren (figuur 2). Na het assembleren van octameren met 601 DNA-sequentie kan het nucleosoom worden beoordeeld met behulp van een 5% 1x TBE Native PAGE-gel gevolgd door kleuring met ethidiumbromide (figuur 3). Vóór de TEV-spijsvertering wordt de nucleosoomband waargenomen in de buurt van de 10k-basispaarmarkering. Na TEV-vertering verschuift de nucleosoomband ten opzichte van de ladder. Vóór de thermische positionering zullen de waargenomen nucleosoombanden zeer breed zijn en mogelijk strepen (figuur 4).
Figuur 1: Histone dimers en tetrameren. Representatieve 12% SDS PAGE gel van wild type histon dimer (baan 2) en H3 acetylated tetrameren (baan 3-9). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Histone octameren. Representatieve 12% SDS PAGE gel van H3 geacetyleerde histon octameren (banen 2-11). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Geassembleerd zijn getagd H3K64Ac nucleosoom complex. Representatieve 1x TBE Native PAGE gel van H3K64Ac nucleosoom complex (baan 2) in vergelijking met vrij 601 DNA (Lane 4) gevisualiseerd door ethidiumbromide. Baan 3 toont H3K64Ac nucleosoom na incubatie bij 60 °C gedurende een uur. In baan 3 wordt waargenomen dat alle nucleosoom is gedemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Geassembleerd TEV verteerd nucleosoom complex. Representatieve 1x TBE Native PAGE gel van wild type TEV verteerd nucleosoom complex, en gratis 601 DNA. Een vergelijking van voor en na nucleosoom thermische positionering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is essentieel om dit protocol in elk detail te volgen tijdens een experiment. Nucleosomen zijn niet erg stabiel en er is veel vallen en opstaan gegaan bij het bepalen van dit protocol. Het is belangrijk om neerslag bij elke stap (of wanneer waargenomen) te verwijderen, omdat deeltjes gemakkelijk de assemblageprocessen kunnen verstoren. Hou zijn toonmonsters altijd op ijs. Als nucleosomen te lang bij 4 °C worden bewaard, kunnen ze spontaan uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat u monsters van Native PAGE controleert als deze langer dan 2 weken bij 4 °C worden bewaard voordat u ze in een experiment gebruikt. Vermijd vortexende octameren en nucleosomen, omdat dit er ook voor kan zorgen dat ze uit elkaar gaan. Als er problemen worden ondervonden bij het assembleren van dimers, tetrameren of octameren, is dit meestal indicatief voor een slechte eiwitkwaliteit. Controleer de eiwitkwaliteit met 15% SDS-PAGE. Een optie als de eiwitzuiverheid laag is, is om het eiwit te dialyseren tegen zuiver water. Dit zal zware neerslag veroorzaken en de eiwitopbrengst sterk verminderen, maar zal een zuiverder monster produceren. De integratie en nucleosomale stabiliteit van elke histonacetylatieplaats varieert sterk. Over het algemeen geldt: hoe dichter de site bij het N-terminal domein ligt, hoe lager de opbrengst tijdens histon eiwitexpressie. Voor nucleosoomstabiliteit, hoe dichter de acetylatieplaats bij de nucleosoomkern of DNA-bindingsplaatsen ligt, hoe minder stabiel het geassembleerde nucleosoom. Als er stabiliteitsproblemen worden ondervonden, is het cruciaal om het nucleosoommonster altijd op ijs te houden. Het kan nodig zijn om de nucleosoompositioneringsstap bij 60 °C weg te laten, omdat dit demontage of neerslag kan veroorzaken. Een belangrijke beperking van geacetyleerde nucleosomen is hun instabiliteit. Het kan onmogelijk zijn om assays voor te vormen bij hogere temperaturen zoals 37 °C zonder nucleosomale neerslag te veroorzaken. Als experimentele procedures dit toelaten, voer ze dan uit bij 4 °C om neerslag van het geacetyleerde nucleosoom te voorkomen.
Deze methode voor het produceren van nucleosomen is met name nuttig voor het produceren van gemodificeerde nucleosomen voor bindingsexperimenten en structuurbepalingen. Deze methode produceert nucleosomen met een hogere zuiverheid en een bekende nucleosomale DNA-sequentie, die verwarrende variabelen elimineert, wat resulteert in beter gecontroleerde experimenten en afbeeldingen met een hogere resolutie. Het is cruciaal voor structuurbepalingen dat het nucleosoommonster homogeen is met een bekende DNA-sequentie, anders is het bijna onmogelijk om beelden met hoge resolutie te verkrijgen.
Er is een overvloed aan potentiële toepassingen van deze methode. In het bijzonder op het gebied van epigenetica. Het kan ongelooflijk moeilijk zijn om gemodificeerde eiwitten te verkrijgen. Het verkrijgen van gemodificeerde eiwitten is cruciaal voor het onderzoeken van de structuur en functie van de schrijvers, lezers en gummen in de vele epigenetische paden die slecht worden begrepen. We hebben deze techniek eerder gebruikt om de toegankelijkheid van nucleosomale DNA tot Pst1-spijsvertering op de H3-acetylatielocaties K18, K36 en K56 te onderzoeken door elk mutant octameer samen te stellen met een aangepaste 601 DNA-sequentie die een Pst1-vergistingsplaats bevat. Deze techniek kan verder worden aangepast om andere NBA's dan AcK op te nemen. PylRS kan worden ontworpen om een groot aantal andere NBA's op te nemen. We hebben ook Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysine (AzHeK) door amber codon in Escherichia coli opgenomen voor recombinante expressie van verschillende AzHeK-bevattende histon H3-eiwitten om de histondenacylatieactiviteit van SIRT7 op verschillende acetylatielocaties te onderzoeken. Deze aanpak toonde aan dat SIRT7 een hoge activiteit heeft ten aanzien van deacylatie van H3K36 en ook katalytisch actief is om H3K37 te diakenen. H3K36-deacylatie bleek verder nucleosoomafhankelijk te zijn en kan aanzienlijk worden verbeterd door een kort dubbelstrengs DNA toe te voegen aan het acyl-nucleosoomsubstraat dat het overbruggende DNA tussen nucleosomen in native chromatinenabootst 6.
Deze methode kan ook worden gewijzigd om nucleosomen van het wilde type te produceren zonder wijzigingen die nuttig kunnen zijn in verschillende scenario's. Onze groep publiceerde onlangs een structuur in samenwerking met de groep van Dr. Pingwei Li die de nauwe binding van cyclische GMP-AMP synthase (cGAS) aan een negatief geladen zure patch gevormd door histon H2A en H2B via zijn tweede DNA-bindingsplaats11toont. cGAS is een dsDNA-sensor die de synthese van een cyclische dinucleotide cGAMP katalyseert, die de inductie van interferonen van type I bemiddelt via de STING-TBK1-IRF3-signaleringsas12,13,14,15,16.
Het voordeel van het gebruik van volledig geassembleerde nucleosomen is dat het meer lijkt op de inheemse toestand van nucleosomen die dienen als een beter model om de activiteiten of bindingscapaciteiten van een willekeurig aantal epigenetische gerelateerde eiwitten te onderzoeken. Er zijn tal van voorbeelden van beperkte of volledig afwezige enzymactiviteit naar naakte DNA- of histonpeptidesubstraten die, wanneer onderzocht met nucleosoomsubstraten, de resultaten drastisch veranderen. Net als bij het hierboven genoemde voorbeeld werd een nieuwe deacylatiesite ontdekt voor SIRT7 met behulp van een nucleosoomsubstraat dat anders onbekend zou zijn geweest. Het is cruciaal om inheemse substraten te gebruiken bij het onderzoeken van dit soort systemen. Deze techniek kan worden gebruikt om de lees-, schrijf- en wisactiviteit of het bindvermogen van elke wijziging die kan worden opgenomen door de pyrrolysine genetische code-uitbreidingstechniek te onderzoeken. De pyrrolysyl-tRNA synthetase is al native promiscue en is ontworpen voor een groot aantal andere substraten die al de deur openen voor het gebruik van deze techniek in een aantal systemen waardoor de primaire beperkende factor de creativiteit van de onderzoeker is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen concurrerende financiële belangen om door een van de auteurs te verklaren.
Acknowledgments
We willen Dr. Wesley Wang bedanken voor het leggen van de basis voor dit protocol en zijn waardevolle mentorschap. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (Grants R01GM127575 en R01GM121584) en Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
