Summary
Her presenterer vi en metode for å uttrykke acetylerte histoneproteiner ved hjelp av genetisk kodeutvidelse og montere rekonstituerte nukleosomer in vitro.
Abstract
Acetylerte histoneproteiner kan lett uttrykkes i Escherichia coli som koder for mutant, Nε-acetyl-lysin (AcK)-spesifikk Methanosarcina mazi pyrrolysin tRNA-syntetase (MmAcKRS1) og dens konjatur tRNA (tRNAPyl) for å montere rekonstituerte mononukleosomer med site spesifikke acetytonert hissyton. MmAcKRS1 og tRNAPyl leverer AcK på et gult mutasjonssted i mRNA etter eget valg under oversettelse i Escherichia coli. Denne teknikken har blitt brukt mye for å innlemme AcK på H3 lysinsteder. Pyrrolysyl-tRNA-syntetase (PylRS) kan også enkelt utvikles for å inkorporere andre ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAer) for stedsspesifikk proteinmodifisering eller funksjonalisering. Her beskriver vi en metode for å inkorporere AcK ved hjelp av MmAcKRS1-systemet i histone H3 og integrere acetylerte H3-proteiner i rekonstituerte mononukleosomer. Acetylerte rekonstituerte mononukleosomer kan brukes i biokjemiske og bindende analyser, strukturbestemmelse og mer. Å skaffe modifiserte mononukleosomer er avgjørende for å designe eksperimenter knyttet til å oppdage nye interaksjoner og forstå epigenetikk.
Introduction
Vi har brukt PylRS og tRNAPyl til å syntetisere og montere rekonstituerte mononukleosomer med stedsspesifikke acetylerte histoner. PylRS har vist seg uvurderlig som et genetisk kodeutvidelsesverktøy for å produsere proteiner med postoversettelsesendringer (PTMer) og har blitt genetisk utviklet for å innlemme rundt 200 forskjellige ncAAer. PylRS inkorporerer på en gul stopp codon, fjerne konkurranse fra andre aminosyrer under oversettelse. PylRS ble først oppdaget i metanogene arkaea, og har siden blitt brukt i kjemisk biologi for å innlemme nye reaktive kjemiske grupper i proteiner1,2.
MmAcKRS1 ble utviklet fra Methanosarcina mazei PylRS og ofte brukt i vårt laboratorium for syntese av acetylerte proteiner3,4,5,6. MmAcKRS1 leverer AcK på et gult mutasjonssted i mRNA etter eget valg under oversettelse i Escherichia coli. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å inkorporere AcK på K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 og K79 histone H3 lysin nettsteder for å studere aktiviteten til Sirtuin 1, 2, 6 og 7 på acetylerte mononukleosomer4,5,6. Her beskriver vi denne metoden for å uttrykke acetylerte histoner og rekonstituere acetylerte nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruksjon
- Begynn med å bestemme hvilket histonprotein som skal acetyleres og hvor lysinstedet. Muter nettstedet til amber stop codon (TAG) ved hjelp av nettstedet rettet mutagenese.
MERK: Det er fire tidligere designede plasmider som brukes til uttrykk for histoneproteiner. Alle fire histoneproteiner ble klonet inn i pETDuet-1-vektoren med en N-terminal histidin-tag. Histone H4 inkluderer også en SUMO-tag, opprinnelsen til replikering colE1 med et kopinummer på ca. 40, ampicillinresistent og en T7-promotor.- Design fremover og omvendt primere som inneholder en TAG mutasjon på ønsket sted (erstatte en eksisterende lysin codon med amber stop codon) i en av de fire histone protein plasmider.
- Bruk helplasmid PCR for å forsterke TAG som inneholder plasmid. Bestem en passende glødetemperatur for primerne. Generelt vil smeltetemperaturen (Tm) til primerne minus 5 °C være tilstrekkelig. Hvis det oppleves vanskeligheter med å skaffe et PCR-produkt, kan en temperaturgradient rundt Tm - 5 °C brukes til å optimalisere glødetemperaturen for forsterkning.
MERK: I dette eksperimentet ble en intern uttrykt PFU-polymerase brukt i 30 sykluser med følgende forhold: 94 °C i 30 s (denaturering), glødetemperatur i 30 s og 72 °C i 6 minutter (eller 1 min per kilobasepar). Hvis du vil ha mer informasjon om denne typen PCR-metode, kan du se Liu og Naismith7. - Rydd opp i PCR-produktet med et PCR-oppryddingssett ved å følge produsentens protokoll. Analyser PCR-produktet ved agarose gelelektroforese og påfølgende ethidiumbromidfarging.
- Ligate plasmid ved å inkubere med T4 ligase over natten ved 16 °C.
- Først transformere TAG som inneholder plasmid (AmpR) til kjemisk kompetent Escherichia coli. Velg minst 4 kolonier fra transformasjonen og rens plasmidet. Lag cellelagrene til hver med glyserol ved hjelp av standardmetoder og lagre ved -80 °C. Send til sekvensering for å bekrefte ønsket TAG-mutasjon.
- Når sekvensen er bekreftet, kan du samtidig transformere TAG-inneholdende plasmid (AmpR) med pEVOL-AckRS (ChlR) til kjemisk kompetent CobB (den eneste histone lysin deacetylase kjent i E. coli.) slette BL21 celler ved hjelp av varmesjokkmetoden. pEVOL er en plasmid med et midtkopitall til lavt kopieringsnummer p15A opprinnelse.
MERK: pEVOL-serien av plasmider ble konstruert basert på tidligere studier som viste et økt uttrykk for ortogonalt aaRS / tRNATyr-par var effektivt for å redusere proteinavkorting og i økende samlet utbytte av mutantproteiner8. Hvis CobB-slettingsceller ikke er tilgjengelige, fortsett med kjemisk kompetente BL21-celler. CobB er en Sirtuin-lignende histone lysin deacetylase og Nicotinamide kan tilsettes ved en 5 mM endelig konsentrasjon under histone protein uttrykk for å hemme CobB som en alternativ tilnærming9. - Lag en celle lager og lagre ved -80 °C.
2. Acetylated histone protein uttrykk
- Forbered 1 L autoklavede 2YT-medier (eller valgvolum) i en kulturflaske.
- Inokuler 20 ml 2YT-medier som inneholder passende antibiotika med den samtidig transformerte cellebestanden som har TAG-inneholdende plasmid (AmpR) og pEVOL-AckRS (ChlR) og vokser ved 37 °C til OD = 0,6 (4-6 t).
- Tilsett passende antibiotika til 1 L autoklavede 2YT-medier og inokuler med 20 ml startkultur. Vokse ved 37 °C til OD = 0,6-0,8 (2-3 t).
- Legg induserende midler og acetylysin (AcK) til de endelige konsentrasjonene av IPTG 1 mM, 0,2% arabinose og AcK 5 mM.
- Vokse kulturen ved 37 °C i 6-8 timer.
- Pelletsceller på 2700 x g i 15 min.
- Oppbevar cellepellet ved -80 °C over natten.
- Fra dette trinnet og fremover holder du prøven på is hele tiden. Løs opp cellepelleten i 50 ml histone lysisbuffer per 1 liter kultur.
- Soniker i henhold til følgende syklus: 1 s på, 1 s av, totalt i tide: 3 min ved 60% amplitude.
- Pellet inkluderingsorganer på 41 600 x g i 45 min.
- Kast de supernatante og resuspend inkluderingslegemene i 30 ml histone lysis buffer. Pellet inkludering bodes på 41,600 x g i 30 min.
- Kast de supernatante og resuspend inkluderingslegemene i 30 ml pelletsvaskbuffer. Pellet inkluderingsorganer på 41,600 x g i 30 min.
- Kast de supernatante og oppløste inklusjonsorganene i 25 ml 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl)-buffer. Inkuber med agitasjon ved 37 °C i 1 time.
MERK: Om nødvendig kan inkluderingsorganer inkuberes med agitasjon over natten ved 4 °C. - Pellet inkludering bodes på 41,600 x g i 45 min. Inkuber supernatanten med 1 ml Ni-NTA-harpiks likevektet med 6 M GuHCl-buffer i 2 timer.
- Fortsett med Ni-NTA rensing under denaturerte forhold. Vask kolonnen med 3 kolonnevolumer av kolonnevaskbuffer. Elute acetylert histonprotein med 10 ml elutionbuffer.
MERK: Forsøk på å konsentrere proteinet her er et alternativ, men acetylerte histoner er svært uforutsigbare og kan lett utfelle. Det anbefales ikke å konsentrere seg forbi 2 ml i totalt volum. - Dialyze i stor grad det acetylerte histonproteinet mot 5% eddiksyrebuffer for å fjerne salter. Dialyze i 3 timer om gangen ved 4 °C, vekslende for fersk buffer minst 6 ganger.
MERK: For forbedret proteinrenhet er det et alternativ å dialyze mot rent vann. Dette forårsaker imidlertid betydelig nedbør og reduksjon i utbyttet som kan være uønsket for lavavkastende acetylerte histoneproteiner. - Aliquot og lyofilisere protein, og lagre på ubestemt tid ved -80 °C. Wild type histone proteiner gir vanligvis 10-50 mg / L mens acetylerte histoneproteiner gir mindre enn 10 mg / L avhengig av det spesifikke lysinstedet. For eksempel H3K79Ac gjennomsnitt 5 mg / L.
3. Wild-type histone protein uttrykk
- For å montere fulle nukleosomer, uttrykk alle 4 histone proteiner. Når du uttrykker og renser wild-type histoner, er protokollen den samme som de acetylerte histoner unntatt følgende:
- Ikke utfør samtidig transformasjon. Ikke bruk pEVOL-AcKRS for wild-type histone-uttrykk. Juster antibiotika deretter.
- Ikke bruk en KobB-slettingscellelinje eller tilsett Nikotinamid, AcK eller arabinose under induksjon av cellulært uttrykk.
4. Fremstilling av 601 DNA
MERK: En tidligere designet optimalisert DNA-sekvens for å dirigere nukleosomposisjonering er montert med histone octamers for å produsere mononukleosom med høy effektivitet. Denne sekvensen kalles 601 DNA eller Widom-sekvensen. Denne sekvensen har blitt standard DNA-sekvens for in vitro-studier av nukleosomer fra kromatin ombyggingsanalyser til enkeltmolekylmålinger10.
- For å forberede betydelige mengder 601 DNA for nukleosommontering, forvandle pGEM-3z/601 til Topp 10 celler og vokse 10 ml kultur for plasmid forsterkning og ekstraksjon. Bruk et plasmid ekstraksjonssett og følg produsentens anbefaling.
- Bruk en egen uttrykt PFU-polymerase (mer effektiv) for denne forsterkningsprotokollen. Sett opp en PCR-reaksjon: For 250 μL reaksjon, bruk 207,5 μL autoklavert MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Fremover Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Revers Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP blanding, 2,5 μL PFU-enzym. Vi kjører vanligvis 60 reaksjoner samtidig for å få nok DNA til å montere.
- Bruk en glødetemperatur på 52 °C i 30 s og en forlengelsestid på 30 s hvis du bruker PFU-polymerase. Ellers følg produsentene anbefalte forhold.
- Når PCR er ferdig, kan du bruke et PCR-oppryddingssett du velger for å rense PCR-produktet.
5. Montering av histone octamer
- Løs opp aliquots av histone proteinpellets H2A, H2B, H3 og H4 slik at det er en egen bestand av hvert histoneprotein i GuHCl Buffer med et totalt volum på 100 μL.
- Beregn konsentrasjonen av hvert histoneprotein ved å måle A280-absorbansen.
- Hvis absorbansen er større enn 1 for noe protein, fortynn med GuHCl-buffer for å få en mer nøyaktig konsentrasjon.
- Kombiner H2A- og H2B-proteiner i et 1:1 molarforhold og fortynn til en total proteinkonsentrasjon på 4 μg/μL. Gjenta for H3 og H4.
- Dialyze sekvensielt ved 4 °C mot 2 M TE-buffer over natten, 1 M TE-buffer for 2 t og 0,5 M TE-buffer i 5 timer.
MERK: Det andre og tredje trinnene i dialysen fører til ustabile konformasjoner av protein for å utfelle. Det er ventet kraftig nedbør på disse trappene. - Fjern utfelling ved sentrifugering ved 16 800 x g ved 4 °C.
- Igjen, beregn konsentrasjonen av histone dimers (H2A / H2B blanding) og tetramers (H3 / H4 blanding) som måler A280 absorbansen.
- Bland dimmere og tetramere i et 1:1 molarforhold og juster NaCl til 2 M ved å legge til solid NaCl.
- Histone octamer kan lagres ved 4 °C og er mer stabil enn dimmere og tetramerer. Frys aldri hanstone octamer, da dette kan forårsake demontering.
- Hvis du monterer med acetylerte histoner, erstatter du bare det ville proteinet med det acetylerte proteinet i prosedyren.
6. Nukleosom montering
- Bruk 100x TE-buffer og heldekkende NaCl til å justere 601 DNA til 2M TE-buffer. Legg til 601 DNA i 2M TE-bufferen i histone octamer i et molarforhold på 0,85:1 til 0,90:1. Et lavere forhold mellom DNA kan tilsettes hvis det finnes gratis DNA i gelskiftanalysen.
- Overfør DNA-histone-blandingen en dialysepose og plasser i ca. 200 ml 2M TE-buffer (eller mer hvis du monterer flere prøver) og rør forsiktig ved 4 °C.
- Angi at en peristaltisk pumpe skal renses for sakte å dryppe uten salt-TE-buffer. Når volumet er omtrent doblet, hell ut halvparten av volumet. Gjør dette minst 4 ganger totalt. Med en pumpe kan dette ta 4-8 timer avhengig av startvolumet. Nukleosomer dannes når saltkonsentrasjonen reduseres til 150 mM (målt ved saltholdighetsmåler).
- Når saltkonsentrasjonen er redusert til 150 mM, kan du ringe mot en TE-buffer på 20 mM over natten.
- Fjern utfellinger ved sentrifugering og mål konsentrasjonen av nukleosomene ved hjelp av A260-avlesning ved hjelp av en plateleser.
- Legg til His-TEV-protease (TEV: nukleosom 1:30, w:w ) og inkuber over natten ved 4 °C for å fjerne alle histidinmerkene. Fjern histidin-taggen urenheter fra nukleosomløsningen ved ni-NTA harpiks trekke ned.
- For å plassere nukleosomet og homogenisere prøven, inkuber ved 60 °C i 1 time.
MERK: For acetylerte nettsteder som er spesielt ustabile, kan det hende at dette trinnet ikke er tilrådelig. - Oppbevar nukleosomer på kort sikt (noen uker) ved 4 °C.
- For langvarig lagring, dialyze nukleosomer mot lagringsbuffer og lagre ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimers, tetramers og octamers kan vurderes ved å kjøre en 12% SDS PAGE gel (Figur 1 og Figur 2). Her kan du se at noen av de acetylerte tetramerene har lavere utbytte enn andre (figur 1). Faktisk, jo nærmere kjerneområdet, jo lavere utbytte observert. Dette skyldes mest sannsynlig acetylering som forstyrrer monteringen av tetrameren jo nærmere du kommer kjerneområdene. En lignende påvirkning observeres etter montering av oktamer (Figur 2). Etter montering av oktamer med 601 DNA-sekvens, kan nukleosomet vurderes ved hjelp av en 5% 1x TBE Native PAGE gel etterfulgt av farging med ethidiumbromid (Figur 3). Før TEV-fordøyelsen observeres nukleosombåndet nær 10k baseparmerket. Etter TEV-fordøyelser skifter nukleosombåndet ned i forhold til stigen. Før termisk posisjonering vil de observerte nukleosombåndene være svært brede, og muligens strekke seg (Figur 4).
Figur 1: Histone dimers og tetramers. Representative 12% SDS PAGE gel av vill type histone dimer (lane 2) og H3 acetylated tetramers (baner 3-9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histone octamers. Representant 12% SDS PAGE gel av H3 acetylated histone octamers (baner 2-11). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Monterte sitt taggede H3K64Ac nukleosomkompleks. Representant 1x TBE Native PAGE gel av H3K64Ac nukleosomkompleks (bane 2) sammenlignet med gratis 601 DNA (Lane 4) visualisert av ethidiumbromid. Bane 3 viser H3K64Ac nukleosom etter inkubasjon ved 60 °C i en time. Det er observert i kjørefelt 3 at alt nukleosom har demontert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Montert TEV fordøyd nukleosomkompleks. Representant 1x TBE Native PAGE gel av vill type TEV fordøyd nukleosomkompleks, og gratis 601 DNA. En sammenligning av før og etter nukleosom termisk posisjonering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å følge denne protokollen i alle detaljer under et eksperiment. Nukleosomer er ikke veldig stabile, og mye prøving og feiling har gått med til å bestemme denne protokollen. Det er viktig å fjerne utfellinger på hvert trinn (eller når de observeres) fordi partikler lett kan forstyrre monteringsprosessene. Hold alltid histoneprøver på is. Hvis nukleosomer lagres ved 4 °C for lenge, kan de spontant demonteres. Sørg for å sjekke eventuelle prøver fra Native PAGE hvis de oppbevares ved 4 °C i mer enn 2 uker før bruk i et eksperiment. Unngå virveling oktamer og nukleosomer, da dette også kan føre til at de demonteres. Hvis det oppstår problemer med montering av dimmere, tetramerer eller oktatre, indikerer dette vanligvis dårlig proteinkvalitet. Kontroller proteinkvaliteten med 15% SDS-PAGE. Et alternativ hvis proteinrenheten er lav, er å dialyze proteinet mot rent vann. Dette vil føre til mye nedbør og redusere proteinutbyttet sterkt, men vil produsere en renere prøve. Inkorporering og nukleosomal stabilitet på hvert histonacetyleringssted varierer mye. Generelt er jo nærmere stedet er N-terminaldomenet, jo lavere utbyttet under histoneproteinuttrykket. For nukleosomstabilitet, jo nærmere acetyleringsstedet er nukleosomkjernen eller DNA-bindingsstedene, jo mindre stabilt er det monterte nukleosomet. Hvis det oppstår stabilitetsproblemer, er det avgjørende å alltid holde nukleosomprøven på is. Det kan være nødvendig å utelate nukleosomposisjoneringstrinnet ved 60 °C, da dette kan føre til demontering eller nedbør. En stor begrensning av acetylerte nukleosomer er deres ustabilitet. Det kan være umulig å preforme analyser ved høyere temperaturer som 37 °C uten å forårsake nukleosomal nedbør. Hvis eksperimentelle prosedyrer tillater det, utfør dem ved 4 °C for å forhindre utfelling av det acetylerte nukleosomet.
Denne metoden for å produsere nukleosomer er spesielt nyttig for å produsere modifiserte nukleosomer for bindende eksperimenter og strukturbestemmelser. Denne metoden produserer nukleosomer med høyere renhet og en kjent nukleosomal DNA-sekvens, som eliminerer forvirrende variabler som resulterer i bedre kontrollerte eksperimenter og bilder med høyere oppløsning. Det er avgjørende for strukturbestemmelser at nukleosomprøven er homogen med en kjent DNA-sekvens, ellers vil det være alt annet enn umulig å få bilder med høy oppløsning.
Det er en overflod av potensielle anvendelser av denne metoden. Spesielt innen epigenetikk. Det kan være utrolig vanskelig å skaffe modifiserte proteiner. Å skaffe modifiserte proteiner er avgjørende for å undersøke strukturen og funksjonen til forfattere, lesere og viskelær i de mange epigenetiske veiene som er dårlig forstått. Vi har tidligere brukt denne teknikken til å undersøke tilgjengeligheten av nukleosomalt DNA til Pst1 fordøyelse på H3 acetyleringssteder K18, K36 og K56 ved å montere hver mutant oktamer med en modifisert 601 DNA-sekvens som inneholder en Pst1 fordøyelsessted. Denne teknikken kan videre modifiseres for å inkorporere andre kystverket enn AcK. PylRS kan konstrueres for å innlemme en rekke andre kystverket. Vi har også innlemmet Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysin (AzHeK) av amber codon i Escherichia coli for rekombinant uttrykk for flere AzHeK-inneholdende histone H3-proteiner for å undersøke histondeacylasjonsaktiviteten til SIRT7 på flere acetyleringssteder. Denne tilnærmingen avslørte at SIRT7 har høy aktivitet mot deacylasjon av H3K36 og er også katalytisk aktiv for å deacylate H3K37. H3K36 deacylation ble videre vist å være nukleosomavhengig og kan forbedres betydelig ved å legge til et kort dobbeltstrenget DNA til acyl-nukleosom substratet som etterligner brobyggings-DNA mellom nukleosomer i innfødt kromatin6.
Denne metoden kan også endres for å produsere wild type nukleosomer uten modifikasjoner som kan være nyttige i en rekke scenarier. Vår gruppe publiserte nylig en struktur i samarbeid med Dr. Pingwei Lis gruppe som viser den tette bindingen av syklisk GMP-AMP-syntase (cGAS) til en negativt ladet sur patch dannet av histone H2A og H2B via sitt andre DNA-bindende sted11. cGAS er en dsDNA-sensor som katalyserer syntesen av en syklisk dinukleotid cGAMP, som formidler induksjonen av type I interferonerer gjennom STING-TBK1-IRF3 signalakse12,13,14,15,16.
Fordelen med å bruke fullt monterte nukleosomer er at det ligner nærmere på den opprinnelige tilstanden til nukleosomer som fungerer som en bedre modell for å sondere aktivitetene eller bindende evner til et hvilket som helst antall epigenetiske relaterte proteiner. Det er mange eksempler på begrenset eller helt fraværende enzymaktivitet mot nakne DNA- eller histonepeptidsubstrater som når de sonderes med nukleosomsubstrater drastisk endrer resultatene. Som med eksemplet nevnt ovenfor, ble et nytt deacylasjonssted oppdaget for SIRT7 ved å bruke et nukleosom substrat som ellers ville ha vært ukjent. Det er viktig å bruke innfødte substrater når du undersøker denne typen systemer. Denne teknikken kan brukes til å undersøke lese-, skrive- og sletteaktiviteten eller bindingsevnen til enhver modifikasjon som kan innlemmes av pyrrolysingenetiske kodeutvidelsesteknikken. Pyrrolysyl-tRNA-syntetase er allerede innfødt promiskuøs og har blitt konstruert for en rekke andre underlag som allerede åpner døren for bruk av denne teknikken i en rekke systemer, noe som gjør den primære begrensende faktoren til forskerens kreativitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære av noen av forfatterne.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Wesley Wang for at han la grunnlaget for denne protokollen og hans verdifulle mentorskap. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (Grants R01GM127575 og R01GM121584) og Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
