Summary
Fragmentbaserad screening med NMR är en robust metod för att snabbt identifiera småmolekylära bindemedel till biomakromolekyler (DNA, RNA eller proteiner). Protokoll som beskriver automationsbaserad provberedning, NMR-experiment & förvärvsförhållanden och analysarbetsflöden presenteras. Tekniken möjliggör optimalt utnyttjande av både 1H och 19F NMR-aktiva kärnor för detektion.
Abstract
Fragmentbaserad screening (FBS) är ett väl validerat och accepterat koncept inom läkemedelsupptäcktsprocessen både inom akademin och industrin. Den största fördelen med NMR-baserad fragmentscreening är dess förmåga att inte bara detektera bindemedel över 7-8 storleksordningar av affinitet utan också att övervaka renhet och kemisk kvalitet hos fragmenten och därmed producera högkvalitativa träffar och minimala falska positiva eller falska negativ. En förutsättning inom FBS är att utföra initial och periodisk kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket, bestämma löslighet och kemisk integritet hos fragmenten i relevanta buffertar och upprätta flera bibliotek för att täcka olika byggnadsställningar för att rymma olika makromolekylmålklasser (proteiner / RNA / DNA). Vidare krävs en omfattande NMR-baserad screeningprotokolloptimering med avseende på provkvantiteter, förvärvshastighet och analys på nivå med biologisk konstruktion / fragmentrum, i tillståndsrum (buffert, tillsatser, joner, pH och temperatur) och i ligandrum (ligandanaloger, ligandkoncentration). Åtminstone inom akademin har dessa screeninginsatser hittills genomförts manuellt på ett mycket begränsat sätt, vilket leder till begränsad tillgång till screeninginfrastruktur, inte bara i läkemedelsutvecklingsprocessen utan också i samband med utveckling av kemisk sond. För att möta kraven ekonomiskt presenteras avancerade arbetsflöden. De drar nytta av den senaste toppmoderna avancerade hårdvaran, med vilken vätskeprovuppsamlingen kan fyllas på ett temperaturkontrollerat sätt i NMR-rören på ett automatiserat sätt. 1H/19F NMR-ligandbaserade spektra samlas sedan in vid en given temperatur. Provväxlare med hög genomströmning (HT-provväxlare) kan hantera mer än 500 prover i temperaturkontrollerade block. Detta tillsammans med avancerade mjukvaruverktyg påskyndar datainsamling och analys. Vidare beskrivs tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.
Introduction
Fragmentbaserad screening är nu en vanlig metod för att identifiera ganska enkla och lågmolekylära molekyler (MW <250 Da) som visar svag bindning till makromolekylära mål inklusive proteiner, DNA och RNA. Initiala träffar från primära skärmar tjänar som grund för att genomföra en sekundär skärm av kommersiellt tillgängliga större analoger av träffarna och sedan använda kemibaserade fragmenttillväxt eller länkningsstrategier. För en framgångsrik fragmentbaserad drug discovery (FBDD) plattform krävs i allmänhet en robust biofysisk metod för att upptäcka och karakterisera svaga träffar, ett fragmentbibliotek, ett biomolekylärt mål och en strategi för uppföljningskemi. Fyra vanligt förekommande biofysiska metoder inom läkemedelsupptäcktskampanjerna är termiska skiftanalyser, ytplasmonresonans (SPR), kristallografi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR).
NMR-spektroskopi har visat varierande roller inom FBDS olika stadier. Förutom att säkerställa den kemiska renheten och lösligheten hos fragmenten i ett fragmentbibliotek upplöst i ett optimerat buffertsystem, kan ligandobserverade NMR-experiment detektera fragmentbindning till ett mål med låg affinitet och de målobserverade NMR-experimenten kan avgränsa fragmentets bindningsepitop, vilket möjliggör detaljerade struktur-aktivitetsrelationsstudier. Inom epitopkartläggning kan NMR-baserade kemiska skiftförändringar inte bara identifiera de ortosteriska bindningsställena utan även allosteriska platser som kan vara kryptiska och endast tillgängliga i så kallade exciterade konformationstillstånd hos det biomolekylära målet. Om det biomolekylära målet redan binder en endogen ligand kan de identifierade fragmentträffarna enkelt klassificeras som allosteriska eller ortosteriska genom att utföra NMR-baserade tävlingsexperiment. Att bestämma dissociationskonstanten (KD) för ligand-målinteraktionen är en viktig aspekt i FBDD-processen. NMR-baserade kemiska skifttitreringar, antingen ligand eller mål observerade kan lätt utföras för att bestämma KD. En stor fördel med NMR är att interaktionsstudierna utförs i lösning och nära fysiologiska förhållanden. Således kan alla konformationstillstånd för analys av ligand/fragmentinteraktion med dess mål undersökas. Vidare är NMR-baserade tillvägagångssätt inte bara begränsade till screening av välveckade lösliga proteiner, utan tillämpas också för att rymma större målutrymme inklusive DNA, RNA, membranbundna och inneboende oordnade proteiner1.
Fragmentbibliotek är en oumbärlig del av FBDD-processen. I allmänhet fungerar fragment som de initiala prekursorerna som så småningom blir en del (understruktur) av den nya hämmaren som utvecklats för ett biologiskt mål. Flera läkemedel (Venetoklax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) har rapporterats ha börjat som fragment och används nu framgångsrikt i klinikerna. Vanligtvis är fragment organiska molekyler med låg molekylvikt (<250 Da) med hög vattenlöslighet och stabilitet. Ett noggrant utformat fragmentbibliotek som vanligtvis innehåller några hundra fragment kan redan lova effektiv utforskning av kemiskt utrymme. Den allmänna sammansättningen av fragmentbibliotek har utvecklats över tid och oftast härletts genom att dissekera kända läkemedel i mindre fragment eller designats beräkningsmässigt. Dessa olika fragmentbibliotek innehåller huvudsakligen platta aromatiska eller heteroatomer och följer Lipinski-regeln 5 6, eller den nuvarande kommersiella trendregeln 3 7, men undviker reaktiva grupper. Vissa fragmentbibliotek härleddes också eller bestod av mycket lösliga metaboliter, naturliga produkter och/eller deras derivat8. En allmän utmaning som de flesta fragmentbiblioteken utgör är enkel nedströmskemi.
Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) vid Goethe-Universität Frankfurt är partner till iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), ett konsortium för strukturella forskningsinfrastrukturer för alla europeiska forskare från alla områden av biokemisk och biomedicinsk forskning. Inom det tidigare initiativet iNEXT som avslutades 2019 skapades ett fragmentbibliotek bestående av 768 fragment i syfte att "minimala fragment och maximal mångfald" som täcker ett stort kemiskt utrymme. Vidare, till skillnad från alla andra fragmentbibliotek, utformades iNEXT-fragmentbiblioteket också baserat på begreppet "poised fragments" i syfte att underlätta nedströms syntes av komplexa, högaffinitetsligander och hädanefter känt som internt bibliotek (Diamond, Structural Genomic Consortium och iNEXT).
Att etablera FBDD av NMR kräver arbetskraft, kunskap och instrumentering. Vid BMRZ har optimerade arbetsflöden för att stödja tekniskt stöd till fragmentscreening med NMR utvecklats. Dessa inkluderar kvalitetskontroll och löslighetsbedömning av fragmentbiblioteket 9, buffertoptimering för de valda målen, 1H eller 19F-observerad 1D-ligandbaserad screening, tävlingsexperiment för att skilja mellan ortosterisk och allosterisk bindning, 2D-baserade målobserverade NMR-experiment för epitopkartläggning och för att karakterisera interaktionen med sekundär uppsättning derivat av de initiala fragmentträffarna. BMRZ har etablerat automatiserade rutiner för analys, som också tidigare diskuterats i litteratur 10,11, av småmolekyl-proteininteraktioner och har på plats all nödvändig automatiserad infrastruktur för NMR-baserad fragmentscreening. Det har implementerat mättnadsöverföringsskillnad NMR (STD-NMR), vattenligand observerad via gradientspektroskopi (waterLOGSY) och Carr-Purcell-Meiboom-Gill-baserade (CPMG-baserade) avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer samt toppmodern automatiserad NMR-instrumentering och programvara för läkemedelsupptäckt. Medan NMR-baserad fragmentscreening är väl etablerad för proteiner, används detta tillvägagångssätt mindre vanligt för att hitta nya ligander som interagerar med RNA och DNA. BMRZ har etablerat proof of concept för nya protokoll som möjliggör identifiering av små molekyl-RNA/DNA-interaktioner. I följande avsnitt av detta bidrag rapporteras tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.
Protocol
1. Fragment bibliotek
- Internt fragmentbibliotek
OBS: Inom ramen för en av de gemensamma forskningsaktiviteterna i iNEXT utvecklades ett robust och nedströms kemivänligt första generationens fragmentbibliotek12 och därefter sattes en andra generation av biblioteket ihop i samarbete med Enamine och är känt som DSI (Diamond-SGC-iNEXT)-poised fragment library (från och med nu kallat "In-house library"). Detta bibliotek kan göras tillgängligt på BMRZ för screeningändamål.- Utvärdera fragmentbiblioteket med avseende på dess integritet och löslighet med hjälp av ett tidigare rapporterat NMR-baserat protokoll9.
OBS: Det egna biblioteket består av 768 fragment med en mycket hög kemisk mångfald (>200 Singletons). Screening i fragmentblandningar kan påskynda screeningkampanjen avsevärt. Antalet fragment i en blandning är dock begränsat på grund av signalöverlappning i 1H-NMR-spektrum. Den högre kemiska mångfalden som erbjuds av det egna biblioteket möjliggör framställning av blandningar som innehåller 12 olika fragment utan någon signifikant kemisk skiftöverlappning i 1 Hobserverade NMR-spektra. - 103 fragment inom de 768 fragmenten har en fluoratom. För 19F-screeningändamål, dela alla 103 fragment som har en fluorgrupp i 5 blandningar baserat på minst 19F kemisk skiftöverlappning. För att minimera signalöverlappning i 19F-screeningen, använd kemisk skiftinformation från mätningar av enskilda föreningar för att designa blandningar med maximalt antal fragment och minimal signalöverlappning. Varje blandning har 20-21 fragment med distinkta 19F kemiska skift som möjliggör entydig tilldelning av fragment.
- Utvärdera fragmentbiblioteket med avseende på dess integritet och löslighet med hjälp av ett tidigare rapporterat NMR-baserat protokoll9.
- Användardefinierat/tillhandahållet fragmentbibliotek
- Utföra screeningkampanjer med det användardefinierade eller tillhandahållna fragmentbiblioteket; Följande steg måste dock föregå screeningkampanjen.
- Om det inte anges av användaren i förväg, utför NMR-baserad kvalitetskontroll av fragmenten (vid BMRZ används avancerade programvaruverktyg för detta; 9, kapitel 6.1.1).
- Kontrollera lösligheten hos fragmenten i valfri buffert för det biomolekylära målet, strukturintegritet och koncentration av fragment före användning.
- Designa blandningen för att minska både signalöverlappning i NMR-spektra och mättid.
- Designblandningar enligt steg 4.2.
- Screena enstaka fragment eller en delmängd av blandningar istället för hela biblioteket.
2. Beredning av prov
OBS: Screening med hög genomströmning av NMR använder en pipetteringsrobot för provberedning. NMR-spektra, men också stabilitet under flera dagars signalförvärv av proteiner, RNA och DNA är extremt känsliga för temperaturfluktuationer och därför kommer temperaturkontrollerade automatiserade system att underlätta stabiliteten hos proverna som pipetteras. För detta ändamål kopplas ytterligare en tilläggsanordning, som arbetar mellan 4 och 40 °C, till pipetteringsroboten för vätskehantering av NMR-proverna i en temperaturkontrollerad miljö.
- Beredning av ligandblandning
- Förbered screeningprover för NMR-mätningar med hjälp av en provberedningsrobot. Robotens flexibla konfiguration möjliggör ett brett spektrum av applikationer (t.ex. återvinning av proverna från NMR-rör tillbaka till lagringsbehållare eller allmänna vätskehanteringsuppgifter). NMR-rör med olika diametrar (1,7, 2,0, 2,5, 3,0 och 5,0 mm) kan användas. Provrobotsystemet tillsammans med den avancerade styrprogramvaran läser streckkoden som tilldelats för varje behållartyp och kör vätskepåfyllningsprotokollet optimalt.
- För beredning av de interna biblioteksligandblandningarna, använd streckkodade injektionsflaskor. De streckkodade injektionsflaskorna garanterar högsta tillförlitlighet och optimal spårbarhet av proverna.
- Fördela 768 föreningar i 8 plattor med 96-brunnsformat. Stamkoncentrationen för varje enskilt fragment är 50 mM i d6-DMSO/D2O (9:1). Totalt förbereda 64 blandningar vardera innehållande 12 fragment. Den slutliga koncentrationen av varje fragment i en blandning är 4,2 mM.
OBS: Pipetteringsroboten rymmer en mängd olika behållartyper med olika geometrier (kryo- eller autoprovtagarflaskor, 96-brunnsplattor runda eller fyrkantiga djupa, streckkodade standardflaskor, mikrocentrifugrör) och hjälper till effektivt utförande av vätskeöverföringen till en mängd olika NMR-rör och rack.
Figur 1: (A) NMR-provberedning med hög genomströmning och NMR-rörfyllningsrobot installerad vid BMRZ. (B) Provväxlare med hög kapacitet med individuella temperaturkontrollerade rack installerade på en 600 MHz-spektrometer vid BMRZ-anläggningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Provberedning för screening blankprov (referensligandspektrum) och med mål (ligand i närvaro av mål)
- För beredning av NMR-screeningproverna, i närvaro av målbiomolekylen (protein/RNA/DNA) och ligandblandningen, använd 3 mm NMR HT-provväxlarrör utvalda från Brukers NMR-portfölj av standard NMR-rör.
- Överför det biomolekylära målet (t.ex. 1H screening: 10 μM RNA eller protein) i en definierad screeningbuffert till 3 mm NMR-röret (slutlig volym på 200 μl) manuellt eller med hjälp av pipetterroboten.
- Överför 10 μL (t.ex. 1H screening) av ligandblandningen i nästa steg med hjälp av robotsystemet till de streckkodade 3 mm NMR-rören som innehåller målbiomolekylen och blanda med hjälp av det inbyggda protokollet i styrprogramvaran.
OBS: NMR-rörets streckkodsnummer införlivas bekvämt och automatiskt i det förvärvade NMR-datasetet, vilket säkerställer ID-orienterat arbetsflöde utan förväxling. Tillbehöret pipetteringsrobotens temperaturkontroll gör det möjligt att hålla de förberedda proverna i NMR-rören under konstant temperatur.
- Internt definierade villkor och parametrar
- Etablera optimala buffertförhållanden för att utföra screening av RNA och protein mot det interna fragmentbiblioteket. Följande provkonditionerade används för RNA vid BMRZ: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6,2. Mg2+ är valfritt.
- Proteiner är extremt känsliga för lösningsförhållanden; Använd buffertar som är optimala för det valda målet. För var och en av dessa buffertar, förvärva ytterligare referensspektra för liganderna för att fungera som blankprov för analysen.
- Användarspecificerade villkor
OBS: I de fall där de internt fastställda villkoren inte är lämpliga för de mål som ska screenas från en potentiell användare, bör följande steg genomföras.- Utför 1H-NMR av bufferten ensam för att säkerställa minimal störning från buffertens komponenter vid utförande och analys av ligandobserverade screeningexperiment. Störande komponenter kan på lämpligt sätt ersättas med deutererade ekvivalenter.
- Begränsningar i provproduktionen (målkvantiteter)/villkor och tillgänglighet
OBS: Isolering eller rekombinant produktion av vissa biomakromolekyler kan i vissa fall visa sig vara utmanande och resultera i begränsad tillgänglighet av målet för att driva en framgångsrik läkemedelsscreeningkampanj. I fall av begränsad eller obegränsad tillgänglighet av målen kan följande alternativ användas för att genomföra en framgångsrik NMR-baserad fragmentscreening.- Om begränsad, använd 19F-NMR-baserad screening. Typiska fluorerade ligander har en enda 19F-signal; Använd därför cocktails med 25-30 fragment utan signalöverlappning. Det finns färre signaler att analysera, ingen signalstörning från buffertkomponenter och färre signaler att förlita sig på för träffidentifiering.
- Om det inte är begränsat, använd större skärmar som 1H-NMR. Det större fragmentbiblioteket kan screenas. Vanligtvis består fragment av mer än en proton, vilket innebär fler signaler att förlita sig på för analysen.
3. Villkor för NMR-förvärv
- Interna allmänt definierade villkor
- Spektrometer utrustad med HT-provväxlare (Automation)
- För screening med hög genomströmning, använd 96-brunnsplattor som endast kan mätas med en HT-provväxlare. HT-provväxlaren erbjuder också möjligheten att temperera varje rack individuellt.
- För optimal signal-till-brus, använd en spektrometer med en kryogen sond som antingen är helium- eller kvävekyld. En automatiserad tunning och matchande modul (ATM) är nödvändig för automatisering.
- Parameteruppsättningar & pulssekvenser
OBS: Många NMR-experiment kan karakterisera bindningshändelser. Träffidentifieringen varierar beroende på experimentupplägget. Följande experiment används rutinmässigt i BMRZ-screeningkampanjer. Ändringar kan dock göras för användardefinierade screeningkampanjer och enligt användarspecifikationer.- Om du använder TopSpin-programvaran, inkludera parameteruppsättningen för ligandbaserade experiment: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY. Parameteruppsättningen innehåller alla nödvändiga parametrar och pulssekvenserna: STD: stddiffesgp.3; T1ρ: t1rho_esgp2d; T2: cpmg_esgp2d; och waterLOGSY: ephogsygpno.2.
- För alla listade experiment, använd excitation sculpting13 som vattenundertryckning. För referens, använd 1D excitation sculpting (zgesgp). Antalet skanningar beror på systemets känslighet (magnetfältstyrka och sondhuvud), provkoncentrationen och valet av experimentet. En rekommendation är: 1D med NS = 64, T1ρ & T2 med NS = 128, STD med NS = 256 och waterLOGSY med NS = 384 eller 512.
- För 19F-screening, använd både 1D- och T2-experiment: 1D: F19CPD (pp = zgig) för 19 F{1 H}-sondhuvud och F19 (pp = zg) för 19F / 1H-sondhuvud; SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
- Använd en spektral bredd på 220 ppm och en excitationsfrekvens vid -140 ppm. Experimenttiden är mellan 1 och 5 timmar (säkerställa biomakromolekylens långsiktiga stabilitet) beroende på hårdvara och provkoncentration. För T2 bör CPMG-tiden växla mellan 0 ms och 200 ms.
- Bearbetning
- Registrera STD-,T1ρ - ochT2-experimenten som pseudo 2D. För att bearbeta de två enskilda 1D-spektra använder IconNMR au-programmet proc_std antingen med eller utan alternativet slappna av. Det första alternativet ger referensen 1D och skillnaden mellan två spektra. Det andra alternativet ger två separata spektra med kort och lång avkopplingstid. WaterLOGSY är en enda 1D som ska fasas med ett negativt för lösningsmedelssignalen.
- Spektrometer utrustad med HT-provväxlare (Automation)
- Användarspecifika villkor
- Anpassa någon av de tidigare nämnda parametrarna till användardefinierade villkor. Till exempel, om ett protein som tillhandahålls av anläggningens användare inte är stabilt vid den allmänt använda temperaturen, kan optimeringsexperiment utföras varierande temperatur, koncentration, buffertförhållanden etc.
4. Analys av data
- Fragmentbibliotek QC (d6-DMSO/specifik buffert) och kvantifiering
- CMC-q
OBS: Kvalitetskontroll av fragmentbibliotek är avgörande innan screeningkampanjer inleds. Dessutom måste fragmentbibliotekets långsiktiga stabilitet säkerställas för tillämpningen av flera screeningkampanjer, varför regelbunden utvärdering av bibliotekets kvalitet måste genomföras. För detta ändamål används den integrerade programvaran CMC-q och CMC-a från TopSpin för kvalitets- och kvantitetsbedömning. CMC-q och CMC-a är mjukvarumoduler inom Topspin som möjliggör smidig insamling, analys inklusive strukturverifiering med 1H-NMR-spektrum erhållet från små organiska molekyler 9.- För integritet, bereda bedömningsprover med en fragmentkoncentration på 1 mM i d6-DMSO. Förbered proverna på ett automatiserat sätt med en pipetteringsrobot genom att fylla vätskeprovuppsamlingen i ett 3 mm NMR-rör.
- För löslighetsbedömning, använd prov bestående av 1 mM förening i 50 mM natriumfosfatbuffert vid pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 90%H2O/ 10% D 2O och 1 mM 3-(trimetylsilyl)propion-2,2,3,3-d4 surt natriumsalt (TMSP-Na).
- Samla NMR-spektra vid 298 K eller 293 K med hjälp av en 600 MHz NMR-spektrometer utrustad med trippelresonans 5 mm TCI kryogen sond och en HT-provväxlare, som kan hantera 579 prover samtidigt.
- För att installera CMC-q-programvara följ instruktionerna i användarhandboken, som implementerar skapandet av en IconNMR-användare, aktiveringen av FastLaneNMR och byte av HT-provväxlaren.
- Kalibrera 90°-pulsen och spara den i TopSpin prosolbordet.
- Placera 96-provbrunnsplattan i en av de 5 rackpositionerna i HT-provväxlaren.
- För att ladda en SDF-fil (strukturdatafil) som ska innehålla dess föreslagna kemiska struktur, en unik identifierare och positionen i HT-provväxlaren för varje prov i en batch, gå till Bläddra i fönstret CMC-q-inställningar och klicka på Öppna när du har valt en fil som slutar på .sdf.
- I inställningarna för CMC.q Batch Automation anger du verifieringstypen som definierar experimentet som ska mätas, IconNMR-användaren och definierar lösningsmedlet.
- Definiera SDF-filer för sökvägen för SDF-filen, molekyl-ID och provpositionen.
- Starta förvärvet genom att klicka på Start. Klicka på Starta förvärv igen. CMC-q-installationen kan också sparas genom att klicka på Spara.
- För detaljerad beskrivning av CMC-q-installationsstegen, följ instruktionerna i användarhandboken från Bruker.
- CMC-a
- För CMC-a, använd mjukvarumodulen i Topspin som möjliggör analys inklusive strukturverifiering med 1H-NMR-spektrum erhållet från små organiska molekyler9.
- CMC-q
- Blandning design
OBS: En korrekt blandningsdesign spelar en viktig roll för screening med NMR som plattform. Ett stort antal fragment per blandning möjliggör snabbare screening men ökar risken för falskt positiva och negativa resultat. Ett lägre antal minskar den risken men ökar den tid det tar att genomföra screeningen. I allmänhet måste en signalöverlappning undvikas när man skapar blandningar. Med hjälp av det interna biblioteket kan detta försummas för 1H-screeningen eftersom biblioteket var speciellt utformat för att vara mångsidigt och visa liten signalöverlappning samtidigt som en hög kemisk mångfald bibehålls. Detta innebär i sin tur att ingen speciell designprocedur behöver genomgå för att skapa de 64 blandningarna.- Eftersom 19F-screeningen bygger på fragmenten i det interna biblioteket som innehåller fluor och biblioteket inte skapades för att minska signalöverlappningen för dessa specifika fragment, utforma en korrekt blandning.
- Mät ensammansatta spektra för alla fragment som innehåller 19F.
- Notera den kemiska skiftinformationen för varje signal.
- Enligt denna information väljer du 20-21 fragment per blandning. Detta ger i sin tur 5 blandningar som vardera innehåller 20-21 fragment utan signalöverlappning och möjliggör en halvautomatisk analys av data.
- Utföra träffidentifiering inom en ligandobserverad biomakromolekyl-ligandinteraktion
OBS: Det finns olika definitioner av en träff mellan screeningproceduren 19F och 1H. Följande träffidentifieringar har upprättats av oss och följer specifika regler. Ämnet för träffbestämning är ett mycket subjektivt sätt och kan skilja sig från användare till användare. Det är dock av yttersta vikt att reglerna för träffidentifiering inte ändras när man väl har kommit överens om det för att upprätthålla validering och trovärdighet.- 1H-skärm
- För att säkert bestämma träffar, skaffa 1D 1H-spektra, waterLOGSY och T2 avkopplingsexperiment både i närvaro och frånvaro av mål för att identifiera bindemedel. Alla tre experimenten har potential att visa en bindande händelse. Om en CSP på mer än 6 Hz är synlig i provspektra jämfört med blankspektra, betraktas detta som en indikation på en träff. Detsamma gäller om en stark positiv signal i waterLOGSY samt mer än 30% T2-reduktion i provspektra är synlig. Bindningshändelser kan visas i alla tre experimenten när man jämför provet som innehåller spektra med deras respektive blankspektra. Det kan dock hända att bindningshändelser inte syns i alla tre experimenten. På grund av detta kom man överens om att minst två av de tidigare beskrivna händelserna måste inträffa för att klassificera ett fragment som en bindande träff.
- Använd FBS-verktyget i TopSpin för att definiera tillståndet för fragment i bindande, tvetydiga, okända, aggregat och icke-bindande.
- När du är klar med en mix, godkänn den i FBS-verktyget.
- På sammanfattningsfliken i FBS-projektet klickar du på Skapa en screeningrapport. Detta öppnar ett fönster som skapar en .xlsx fil. Användaren kan sedan välja mellan alla ligander, endast bindande ligand, inte bindande ligand och tvetydiga ligander som ska rapporteras i kalkylbladet.
- 19F-skärm
- För att skilja mellan icke-bindemedel, veckobindare och starkbindare, dela integrationskvoten mellan 200 ms målmätning och 200 ms blankmätning med kvoten av 0 ms målmätning och 0 ms blankmätning används:
Detta ger värden från 0 till ~1 (träffpoängen), vilket gör det möjligt att tilldela tröskelvärden för varje bindningstillstånd. - Använd medelvärdet av referensmätningen på 200 ms som ett referenströskelvärde för att markera fall där träffpoängen överstiger 1. Detta kan inträffa om de importerade integralerna innehåller negativa värden eller om referensmätningen är högre än målmätningen. En träffpoäng på ≤ 0,67 anses vara en svag träff, < 0,33 en stark träff och allt > 0,67 som ingen träff. Ett exempel visas i figur 2.
- För att skilja mellan icke-bindemedel, veckobindare och starkbindare, dela integrationskvoten mellan 200 ms målmätning och 200 ms blankmätning med kvoten av 0 ms målmätning och 0 ms blankmätning används:
- 1H-skärm
Figur 2: Träffidentifiering för 19F-screeningen. Sektion av 19F CPMG NMR-spektra av en exemplarisk förening. Denna bildframställning förklarar egenskaperna hos ett bindemedel. 19F-CPMG-spektra för en förening förvärvad av blandningsprover i närvaro och frånvaro av RNA. Värdena representerar de normerade integralvärdena för motsvarande topp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Analys av data
- Förbered data för analys
OBS: Det är viktigt att de förvärvade uppgifterna inte har några synliga brister. Detta innebär att data där shimmingen var problematisk eller vattendämpningen var otillräcklig inte bör övervägas för analys. Snarare rekommenderas att registrera data igen och se till att allt är bra med provet (t.ex. inga luftbubblor), med temperaturen, shimmingen och vattendämpningen. Datakorrekthet kan alltid bedömas när DMSO-signaler jämförs. - 1H-screening
- För att analysera 1H screeningdata, använd FBS-verktyget (behöver ytterligare licens) i TopSpin 4.0.9.
- Följ instruktionerna i FBS-verktygshandboken för att börja med dataanalysen. Följande steg sammanfattar proceduren som rapporteras i handboken.
- Lagra BMRZ NMR-data från screeningkampanjer så att varje enskild screeningblandning har en egen katalog där en underkatalog innehåller de olika experiment som uppmätts på provet.
- För att använda FBS-verktyget, lagra referensspektra som har alla data sparade från prover utan det biomolekylära målet men med blandningarna såväl som den enskilda föreningen mätt i olika / nmr-kataloger. Detta är viktigt eftersom FBS-verktyget kommer att be om katalogvägen för var och en individuellt.
FBS-verktyget identifierar en katalog som ett screeningprojekt om följande datauppsättningar lagrades i samma katalog där blandningarna av ett screeningprov lagras (csv, FragmentScreen XML-dokument och BAK-fil). - När du använder TopSpin 4.0.9, skapa en direkt sökväg till katalogen som innehåller de förvärvade data, en så kallad DIR. Välj katalogen /nmr där alla blandningar ska ha en distinkt katalog.
- Starta FBS-verktyget i ett avskärmat exempel genom att dra FBS-projektet till mitten av TopSpin-fönstret. I den valda katalogen ska FBS-projektsymbolen visas om tidigare nämnda dataset kopierades till den.
- Fönstret Fragmentbaserade gallringsalternativ bör öppnas automatiskt när ett nytt FBS-projekt läses in för första gången. I det här fönstret väljer du en cocktailfil. Cocktailfilen är en csv-fil som innehåller tilldelningen av namnet på blandningarna, namnet på varje fragment och deras uppdelning i blandningarna. Definiera också en referensligandspektramapp som har alla uppmätta spektra för de enskilda fragmenten. Slutligen definierar du en tom referensexperimentmapp, som vanligtvis är mappen som innehåller datauppsättningarna för blandningarna utan det undersökta målet.
- Fragment Based Screening Options har en flik som heter Spectra types som låter en definiera de undersökta spektra samt färgen för att visa spektra. Ställ in Spectype enligt tidigare bearbetade data. På fliken Visningslayout definierar du de spektra som ska jämföras med varandra enligt deras specifika typer.
- Tryck på OK för att starta FBS-projektet.
- När du tittar på data öppnas ett separat fönster som sammanfattar alla cocktailblandningar och alla ligander av varje blandning i en tabell. Genom att dubbelklicka på en cell öppnas respektive dataset och jämför till exempel 1 H 1DBlank spectra med datasetet som innehåller målet.
- Innan du tilldelar bindemedel, se till att referenstoppar (DMSO för alla mätningar såväl som de enskilda föreningarna) matchar varandra och har samma kemiska skift. Om skillnader observeras, korrigera dem genom att använda alternativet för seriell bearbetning från TopSpin.
- Alternativet för seriell bearbetning finns under fliken Process under Avancerat. Den tillämpar ändringar på alla valda spektra från en datauppsättning. På så sätt kan Spectypes enkelt tilldelas experimentnummer och alla spektra kan flyttas samtidigt för att anpassa sig till referensen.
- 19F Screening
- För den första analysen av de 19F-blandningarna skapar du en integrationsfil för varje blandning. För att definiera integrationsregionen, klicka på funktionen Integrera på fliken Analysera . Se till att för varje fragment i blandningen definieras en tydlig integrationsregion för motsvarande 19F-singal.
- Använd knappen Spara/exportera integrationsregioner för att exportera integrationsfilen för framtida användning. Spara alla använda integrationsfiler i C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng, eller motsvarande sökväg i TopSpin-installationskatalogen.
- För 19F-data öppnar du en datauppsättning antingen med eller utan det undersökta målet.
- För att ladda integrationsfilen i det aktuella spektrumet, öppna fliken Analysera igen, gå till Integrera och använd knappen Läs/importera integrationsregioner , ladda motsvarande integrationsfil. Detta laddar alla definierade regioner i filen till det aktuella spektrumet.
- Spara och gå tillbaka för att hitta en lista över alla integrerade regioner på fliken Integraler . Kopiera detta till ett kalkylblad eller något annat verktyg som används för vidare analys av data.
- Upprepa denna procedur för varje blandning, med och utan mål.
- Hantering av data
- För enkel användning och produktivitet skull, ha ett enhetligt arbetsflöde inrättat för vidare analys och lagring av de förvärvade uppgifterna. För både 1H- och 19F-screening, använd ett specialdesignat kalkylblad för varje.
OBS: För 1H-screeningen användes detta enbart för datahantering och för att sammanfatta varje mål medan det för 19F-screeningen använde den i kapitel 4.3 förklarade kvoten för att automatiskt märka varje fragment som träff / ingen träff efter att integrerade data kopierades till den. Detta minskar risken för mänskliga fel under analysen, förutsatt att filen har ställts in korrekt, och gör det lättare att dela information, eftersom all viktig information samlas på ett ställe i en fil som kan öppnas av praktiskt taget vem som helst utan behov av ytterligare program för att ta en första titt på data.
- För enkel användning och produktivitet skull, ha ett enhetligt arbetsflöde inrättat för vidare analys och lagring av de förvärvade uppgifterna. För både 1H- och 19F-screening, använd ett specialdesignat kalkylblad för varje.
- Förbered data för analys
Representative Results
Kvalitetskontroll av fragmentbibliotek
Fragmenten från det egna biblioteket levererades som 50 mM stamlösningar i 90% d6-DMSO och 10% D 2 O (10% av D2O säkerställer minimering av föreningsnedbrytning på grund av upprepade frys-tina cykler14). Enstaka samlingsprover bestod av 1 mM ligand i 50 mM fosfatbuffert (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6,0 i 90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1H-NMR-experiment av fragment från iNEXT-biblioteket mättes på en 500/600 MHz NMR-spektrometer. Dessa data användes vidare för att identifiera de enskilda föreningarna i 1H-screeningkampanjer med hjälp av CMC-q-programvaran som gör det möjligt för användaren att helt förvärva spektra på ett automatiserat sätt och analystillägget CMC-a kvaliteten (löslighet och integritet) av fragment utvärderades. Resultaten från den automatiserade analysen från CMC-a visas som en grafisk utgång som liknar den som representeras i figur 3. Den grafiska utgången visar en representation av en 96-brunnsplatta. En rödfärgad cirkel betyder att detta fragment visar inkonsekvens i struktur eller koncentration. Grönfärgade brunnar indikerar att fragmentet är konsekvent.
Bild 3: Kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket. Schematisk representation av CMC-a-baserad automatiserad utgång. Fragmentegenskaper såsom koncentration och strukturell integritet bedöms. Grönt står för konsekvent, orange i detta fall står för inkonsekvent. Inkonsekventa fragment revideras manuellt enligt det visade arbetsflödet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ungefär 65% och 35% av fragmenten klassificerades som konsekventa respektive inkonsekventa i både DMSO och buffert. Vidare blev 30% av de inkonsekventa klassificerade liganderna konsekventa efter en noggrann manuell inspektion av spektra9.
19F Blandningens utformning
103 fragment innehållande en eller flera fluorgrupper från det egna biblioteket delades in i 5 blandningar (A, B, C, D, E). Varje blandning har 20 till 21 fragment. I detta fall måste blandningarna utformas noggrant för att undvika signalöverlappning. 19F tvärgående avslappningsexperiment mättes för varje blandning som applicerar CPMG-pulståg. Dessa experiment kan modifieras genom att variera avslappningsfördröjningarna. Den kemiska förskjutningen 19F av blandningar A-E kan ses i figur 4.
Figur 4: 19F 1D-NMR-spektra för blandningsprover från det egna biblioteket. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Provberedning
Provberedningen i 19F-screeningproceduren gjordes antingen manuellt eller med automatiserad pipettering med hjälp av en pipetteringsrobot. Fragmenten i varje blandning hade en koncentration av 2,5 mM i 90% d6-DMSO och 10%D2O. Den slutliga volymen av ett screeningprov var 170 μL med 5% D2Osom låsmedel. Varje blandning pipetterades två gånger, en i en buffertlösning (utan mål) och en till en målinnehållande buffertlösning. Förhållandet mellan mål och fragment sattes till 1:1, vilket resulterade i en slutlig mål-/ligandkoncentration på 50 μM. Dessutom är kontrollprover målbiomolekylen i screeningbuffert utan blandning för att säkerställa målintegritet samt ett kontrollprov med endast buffert ochD2Oför att säkerställa buffertkvalitet.
NMR-screeningdata för 19 F-1D och 19F-CPMG-T2 var mätningar som beskrivs i avsnitt 3.1. Till exempel, i fallet med RNA förvärvades en hopp-retur ekosekvens (pp = zggpjrse,15) för det enda målprovet i buffert.
Analys av data
19F-screeningproceduren tillämpades på TPP-riboswitchen thiM från E. coli och proteintyrosinkinas (PtkA) från M. tuberculosis bland flera andra mål16. Screeningbiblioteket 19F har 103 fragment som är uppdelade i 5 blandningar märkta från Mix A till E. Beredning av screeningprover kan utföras manuellt utan användning av en provpipetteringsrobot. 40 μM thiM RNA-innehållande lösning (buffertförhållanden) blandades med 3,2 μL från blandningarna. Ytterligare kontrollprover framställdes bestående av endast buffert, buffert med 5% DMSO (tidigare säkerställd stabiliteten hos biomakromolekylen i närvaro av önskad DMSO-koncentration) och buffert med RNA. Dessa 13 screeningprover bereddes och överfördes till 3 mm NMR-rör. Streckkoder för NMR-rör skannas och varje blandning i närvaro och frånvaro av RNA, samt kontrollprover mättes enligt de ovan nämnda 19F NMR-experimenten utförda vid 298 K. Screening av thiM RNA mot det interna biblioteket utfördes genom att utföra T2-mätningar med CPMG på 0 ms och 200 ms för varje prov. Korrekt shimming och vattendämpning övervakades efter avslutad mätning genom att jämföra alla DMSO-toppar när det gäller linjebreddning och intensitetsförlust av ytterligare uppmätta 1H 1D-experiment för alla prover. Bearbetning av erhållna CPMG T219F relaxation spectra utfördes med användning av ett tidigare preparerat respektive automatiserat makro i TopSpin. Dataanalys utfördes enligt instruktionerna i protokollavsnittet. De integrerade data som erhållits från TopSpin (enligt instruktionerna i protokollet) kan utvärderas snabbt och enkelt med hjälp av ett färdigt kalkylblad eller något liknande program genom att ställa in rätt villkor och trösklar. Som beskrivits tidigare är tröskelvärden användbara för att definiera bindemedel, svagt bindemedel eller icke-bindemedel. Figur 5 visar typiska resultat av CPMG-spektra för thiM RNA respektive PtkA. I vissa fall behövdes ytterligare expertgranskning.
Figur 5: Utskuren av 19 F CPMG NMR-spektra som visar intensitetsförändringarna erhållna från olika fördröjningstider för CPMG-baserade experiment . (A) Representation av ett bindemedel (träff) och ett icke-bindemedel i 19F-fragmentbaserad screening utförd på TPP-riboswitch thiM RNA från E. coli. (B) Representation av ett bindemedel och ett icke-bindemedel i 19F fragmentbaserad screening utförd på PtkA från M. tuberculosis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1h screening
Blandning design
Det använda interna biblioteket är så mångsidigt att ingen blandningsdesign utfördes för 1H-screeningändamål. Detta innebär att 64 blandningar framställdes genom att slumpmässigt välja 12 som skulle blandas i en blandning.
Provberedning
För 1H-screening av ett exemplifierande SARS-CoV-2 RNA utfördes automatiserad pipettering med hjälp av en pipetteringsrobot för att förbereda proverna. Fragmenten i varje blandning hade en koncentration av 4,2 mM i 90% d6-DMSO och 10% D2O. Den slutliga volymen av ett screeningprov var 200 μL med 5% D2Osom låsmedel. 64 prover vardera innehållande en annan blandning i 25 mM KPi, 50 mM KCl vid pH 6,2 pipetterades utan mål-RNA. Respektive 64 prover pipetterades med mål-RNA, var och en innehållande en annan blandning. RNA: Liland-förhållandet sattes till 1:20, vilket resulterade i en RNA-koncentration på 10 μM och en ligandkoncentration på 200 μM.
Analys av data
För 1H-analysen användes FBS-verktyget i TopSpin. För att avgöra om ett fragment är en träff genomfördes 1D kemisk förskjutning, waterLOGSY och T2 avslappningsexperiment. För T2-avkoppling räknades en minskning i intensitet större än 30% som en träff, medan för den kemiska förskjutningen var en förskjutning större än 6 Hz cut-off. WaterLOGSY måste visa en signifikant signalförändring (från negativ till positiv i detta fall). Om två av dessa tre kriterier var positiva räknades ett fragment som en träff. Två exempel på detta kan ses i figur 6.
Figur 6: 1H-screening utförd på ett exemplifierande SARS-CoV-2-RNA som visar träffbestämningskriterier. Förvärv av tre olika experiment (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY och 1D 1H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Träff-1 visar en T2-minskning på ~50 % och en CSP ≥ 6 Hz. WaterLOGSY visar inte en tillräckligt signifikant förändring i signalen för att också räknas som positiv. Eftersom två av tre experiment är positiva räknas detta fragment som en träff. För Hit-2 visar T2 en minskning med ~ 80% signalintensitet och en tydlig signalförändring kan ses för waterLOGSY. CSP räcker inte i det här fallet, men eftersom de två tidigare kriterierna är positiva räknas det fortfarande som en träff.
Discussion
Mångsidighet av NMR-baserad fragment / läkemedelsscreening. BMRZ har framgångsrikt implementerat toppmodern automatiserad NMR-instrumentering samt STD-NMR, waterLOGSY och avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer för läkemedelsupptäckt. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. En nyligen inköpt kryogen sond för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den nödvändiga känsligheten för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1 H (1) frikoppling under 19F-detektering. Denna prob är kopplad till den senaste generationen NMR-konsol som erbjuder möjligheten att använda de avancerade mjukvaruverktygen från Bruker, inklusive CMC-q, CMC-assist, CMC-se och FBS (ingår i TopSpin). Det fragmentbaserade screeningverktyget (FBS) ingår i den senaste versionen av TopSpin och hjälper till att analysera data med hög genomströmning bestående av STD, waterLOGSY, T2/T1 r-relaxeringsexperiment. Den flytande 1D 1H-provinsamlingen kan fyllas i NMR-rören på ett automatiserat sätt med hjälp av provfyllningsroboten. Vanligtvis fylls ett block med 96 rör (3 mm) på cirka två timmar. Plattrackarna med 96 brunnar är direkt placerade i HT-provväxlaren, som läser av blockets streckkod och tilldelar NMR-rören till experimenten som styrs av automatiseringsprogramvaran (IconNMR). Fem 96-brunnsställ kan lagras och programmeras i HT-provväxlaren samtidigt. Temperaturen på var och en av de enskilda racken kan styras och regleras separat. Dessutom kan varje enskilt prov förkonditioneras (förvärmning och rörtorkning för avlägsnande av kondenserad fuktighet) till önskad temperatur före mätningen.
Lämplighet för ett brett spektrum av applikationer. En av de breda tillämpningarna av denna automatiserade NMR-baserade screening är att identifiera och utveckla nya ligander som binder till ett biomakromolekylärt mål (DNA / RNA / proteiner). Dessa ligander kan inkludera ortosteriska och allosteriska hämmare som vanligtvis binder icke-kovalent. Vidare används FBDD av NMR vanligtvis som ett första steg för att välja lovande föreningar, kraven som ska uppfyllas är tillgängligheten av det biomolekylära målet i tillräckliga mängder. Detta mål är uppdelat i två huvuduppgifter.
Uppgift ett är att utveckla och karakterisera ett internt fragmentbibliotek av följande skäl: initial och periodisk kvalitetskontroll, karakterisering och kvantifiering av mer än 1000 fragment; Bestämning av lösligheten hos fragmenten i buffertar optimerade för varje mål, särskilt för proteinmål. och inrättandet av flera bibliotek för att rymma olika byggnadsställningar och sträcka sig mot andra makromolekylklasser. Uppgift två är att integrera arbetsflöden för fragmentbaserad läkemedelsdesign (FBDD) genom NMR med: automatiserad 1D-ligandobserverad screening (1H och 19F observerade); automatiserade ersättningsanalyser (tävlingsexperiment med (naturlig) ligand) för att differentiera ortosterisk och allosterisk bindning; automatiserade sekundära screeningar med flera fragment; Automatiserad 2D-proteinscreening och sekundär screening av en uppsättning derivat kring en första träff med hjälp av EU-OPENSCREEN-biblioteket eller något annat bibliotek. och omprofilering av screening av FDA-biblioteket mot de valda målen.
Dessutom kan metabotypning av olika cellinjer (sjukdomsrelevant) utföras för att avslöja de reglerande mekanismerna som länkar cellcykelkontroll och metabolism. Det finns också funktionell karakterisering av RNA / DNA / proteinregleringselement in vivo och in vitro för optimering av konstruktion / domänoptimering (stabilitetsoptimering för strukturella undersökningar (buffert-, pH-, temperatur- och saltscreening) och en utvidgning av NMR-baserad fragmentscreening till membranproteiner och inneboende oordnade proteiner, som i allmänhet är otillgängliga för andra tekniker.
Begränsningar. Användning av 19F- och 1H-fragmentbibliotek har sina fördelar och nackdelar, varav få kommer att nämnas i det följande. Den största fördelen med 19F kontra 1H-mätningar är hastigheten på både den faktiska mättiden och den efterföljande analysen, eftersom blandningarna innehåller nästan dubbelt så många fragment och färre experiment måste utföras. Uppföljningsanalysen är också enklare för 19F-screening, eftersom det inte finns någon störning från buffertar och dessutom erbjuder ett bredare kemiskt skiftområde med nästan ingen signalöverlappning för en optimalt utformad fragmentblandning. Spektra själva är mycket förenklade, vanligtvis har de bara en eller två signaler per fragment, beroende på antalet fluoratomer. Analysen av dessa spektra kan därför automatiseras, vilket återigen minskar tiden. Detta sker på bekostnad av kemisk mångfald, åtminstone för biblioteket som används i denna studie. Eftersom endast ~ 13% av biblioteket innehåller 19F, men naturligtvis alla är användbara vid 1H-screening, kommer mångfalden av 19F-screeningfragmenten att vara lägre. Detta kan kringgås med hjälp av specialdesignade 19F-bibliotek med fler fragment och större kemisk mångfald. En annan nackdel för 19F-screening är det låga antalet signaler per fragment. Fragment består i allmänhet av mer än en väteatom. Därför kan 1H observerade screeningexperiment förlita sig på olika signaler för samma fragment för detektering av bindning. Detta ger en högre grad av förtroende vid identifiering av träffar för 1H-screening, medan 19F-screening måste förlita sig på en eller två signaler som ges per fragment.
En detaljerad redogörelse för den moderna automatiserade NMR-baserade fragmentscreeninginstrumentationen, programvara och analysmetoder och protokoll därav har presenterats. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och en provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. Ett nyligen installerat kryogent sondhuvud för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den känslighet som krävs för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1H frikoppling under 19F-detektering. Dessutom erbjuder den senaste generationen av NMR-konsolen möjligheten att använda avancerad analytisk programvara för att underlätta förvärv och on-the-fly-analys. Den ovan diskuterade tekniken, arbetsflödena och de beskrivna protokollen bör främja anmärkningsvärd framgång för användare som bedriver FBS av NMR.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete har fått stöd av iNEXT-Discovery, projekt nummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horizon 2020-program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
| Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
| Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
| SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
| SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |
References
- Yanamala, N., et al.
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).
- Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus. Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).
- Perera, T. P. S., et al. Discovery & pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).
- Zhang, C., et al. Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).
- Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).
- Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery. Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).
- Chávez-Hernández, A. L., Sánchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization. Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).
- Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).
- Gao, J., et al. Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex. PLoS One. 9, 88098 (2014).
- Peng, C., et al. Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).
- Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
- Hwang, T. L., Shaka, A. J. Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients. Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).
- Gossert, A. D., Jahnke, W. NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).
- Sklenar, V., Bax, A. A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth. Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).
- Binas, O., et al. 19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens. ChemBioChem. , (2020).
