NMR ile fragman tabanlı tarama, küçük molekül bağlayıcılarını biyomakromoleküllere (DNA, RNA veya proteinler) hızlı bir şekilde tanımlamak için sağlam bir yöntemdir. Otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve elde etme koşulları ve analiz iş akışlarını açıklayan protokoller sunulmaktadır. Bu teknik, tespit için hem 1H hem de 19F NMR-aktif çekirdeklerin optimum şekilde kullanılmasına izin verir.
Fragman tabanlı tarama (FBS), hem akademide hem de endüstride ilaç keşif sürecinde iyi doğrulanmış ve kabul görmüş bir kavramdır. NMR tabanlı fragman taramasının en büyük avantajı, sadece 7-8 afinite büyüklüğünün üzerindeki bağlayıcıları tespit etmekle kalmayıp, aynı zamanda parçaların saflığını ve kimyasal kalitesini izlemek ve böylece yüksek kaliteli isabetler ve minimum yanlış pozitifler veya yanlış negatifler üretmek için de yeteneğidir. FBS içindeki bir ön koşul, parça kütüphanesinin ilk ve periyodik kalite kontrolünü yapmak, ilgili tamponlardaki parçaların çözünürlüğünü ve kimyasal bütünlüğünü belirlemek ve çeşitli makromolekül hedef sınıflarını (proteinler / RNA / DNA) barındırmak için çeşitli iskeleleri kapsayacak şekilde çoklu kütüphaneler oluşturmaktır. Ayrıca, numune miktarları, biyolojik yapı/fragman-uzay düzeyinde, koşul-uzayda (tampon, katkı maddeleri, iyonlar, pH ve sıcaklık) ve ligand-uzayda (ligand analogları, ligand konsantrasyonu) elde etme ve analiz hızı açısından kapsamlı bir NMR tabanlı tarama protokolü optimizasyonu gereklidir. En azından akademide, bu tarama çabaları şimdiye kadar çok sınırlı bir şekilde manuel olarak gerçekleştirilmiş ve bu da sadece ilaç geliştirme sürecinde değil, aynı zamanda kimyasal prob geliştirme bağlamında da tarama altyapısının sınırlı mevcudiyetine yol açmıştır. Gereksinimlerin ekonomik olarak karşılanabilmesi için gelişmiş iş akışları sunulmaktadır. Sıvı numune toplamanın sıcaklık kontrollü bir şekilde NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabildiği en son teknoloji ürünü gelişmiş donanımdan yararlanırlar. 1H / 19F NMR ligand bazlı spektrumlar daha sonra belirli bir sıcaklıkta toplanır. Yüksek verimli numune değiştirici (HT numune değiştirici), sıcaklık kontrollü bloklarda 500’den fazla numuneyi işleyebilir. Bu, gelişmiş yazılım araçlarıyla birlikte veri toplama ve analizini hızlandırır. Ayrıca, tarama rutinlerinin protein ve RNA örnekleri üzerinde uygulanması, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olmak için açıklanmaktadır.
Fragman bazlı tarama, proteinler, DNA ve RNA dahil olmak üzere makromoleküler hedeflere zayıf bağlanma gösteren oldukça basit ve düşük moleküler ağırlıklı molekülleri (MW <250 Da) tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Birincil ekranlardan gelen ilk isabetler, isabetlerin ticari olarak temin edilebilen daha büyük analoglarının ikincil bir ekranını yürütmek ve daha sonra kimya tabanlı parça büyümesi veya bağlantı stratejilerini kullanmak için temel oluşturur. Başarılı bir fragman tabanlı ilaç keşif (FBDD) platformu için, genel olarak, zayıf isabetleri tespit etmek ve karakterize etmek için sağlam bir biyofiziksel yöntem, bir parça kütüphanesi, bir biyomoleküler hedef ve takip kimyası için bir strateji gereklidir. İlaç keşif kampanyalarında yaygın olarak uygulanan dört biyofiziksel yöntem, termal kayma testleri, yüzey plazmon rezonansı (SPR), kristalografi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisidir (NMR).
NMR spektroskopisi, FBDD’nin farklı aşamalarında çeşitli roller göstermiştir. Optimize edilmiş bir tampon sistemde çözünmüş bir fragman kütüphanesindeki parçaların kimyasal saflığını ve çözünürlüğünü sağlamanın yanı sıra, ligand gözlemlenen NMR deneyleri, düşük afiniteli bir hedefe parça bağlanmasını tespit edebilir ve hedef gözlemlenen NMR deneyleri, parçanın bağlanma epitopunu tanımlayabilir, böylece ayrıntılı yapı-aktivite ilişkisi çalışmalarına olanak tanır. Epitop haritalamasında, NMR tabanlı kimyasal kayma değişiklikleri sadece ortosterik bağlanma bölgelerini değil, aynı zamanda şifreli olabilecek ve sadece biyomoleküler hedefin uyarılmış konformasyonel durumlarında erişilebilen allosterik bölgeleri de tanımlamakla kalmaz. Biyomoleküler hedef zaten endojen bir ligandı bağlarsa, tanımlanan fragman vuruşları, NMR tabanlı rekabet deneyleri yapılarak kolayca allosterik veya ortosterik olarak sınıflandırılabilir. Ligand-hedef etkileşiminin ayrışma sabitinin (KD) belirlenmesi, FBDD sürecinde önemli bir husustur. NMR bazlı kimyasal kayma titrasyonları, ligand veya gözlemlenen hedef, KD’yi belirlemek için kolayca gerçekleştirilebilir. NMR’nin en büyük avantajı, etkileşim çalışmalarının çözelti içinde ve fizyolojik koşullara yakın bir yerde yapılmasıdır. Böylece, hedefi ile ligand / fragman etkileşiminin analizi için tüm konformasyonel durumlar araştırılabilir. Ayrıca, NMR tabanlı yaklaşımlar sadece iyi katlanmış çözünür proteinlerin taranmasıyla sınırlı değildir, aynı zamanda DNA, RNA, membrana bağlı ve içsel olarak düzensiz proteinler1 dahil olmak üzere daha büyük hedef alanı barındırmak için de uygulanmaktadır.
Parça kütüphaneleri FBDD sürecinin vazgeçilmez bir parçasıdır. Genel olarak, fragmanlar, sonunda biyolojik bir hedef için geliştirilen yeni inhibitörün bir parçası (altyapısı) haline gelen ilk öncüller olarak hareket eder. Bazı ilaçların (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) fragman olarak başladığı ve günümüzde kliniklerde başarıyla kullanıldığı bildirilmiştir. Tipik olarak, fragmanlar yüksek sulu çözünürlük ve stabiliteye sahip düşük moleküler ağırlıklı (<250 Da) organik moleküllerdir. Tipik olarak birkaç yüz parça içeren özenle hazırlanmış bir parça kütüphanesi, kimyasal alanın verimli bir şekilde araştırılmasını vaat edebilir. Parça kütüphanelerinin genel bileşimi fazla mesai içinde evrimleşmiştir ve çoğu zaman bilinen ilaçların daha küçük parçalara ayrılmasıyla veya hesaplamalı olarak tasarlanmasıyla türetilmiştir. Bu çeşitli parça kütüphaneleri esas olarak düz aromatik veya heteroatomlar içerir ve 5 6’nın Lipinski Kuralına veya 3 7’nin mevcut ticari eğilim Kuralına uyar, ancak reaktif gruplardan kaçının. Bazı parça kütüphaneleri de yüksek oranda çözünür metabolitlerden, doğal ürünlerden ve veya bunların türevlerinden türetilmiş veya bunlardan oluşmuştur8. Parça kütüphanelerinin çoğunun ortaya koyduğu genel bir zorluk, aşağı akış kimyasının kolaylığıdır.
Frankfurt Goethe Üniversitesi’ndeki Biyomoleküler Manyetik Rezonans Merkezi (BMRZ), biyokimyasal ve biyomedikal araştırmaların tüm alanlarından tüm Avrupalı araştırmacılar için yapısal araştırma altyapıları konsorsiyumu olan iNEXT-Discovery’nin (Transformeral research-Discovery için NMR, EM ve X-ışınları için altyapı) ortağıdır. iNEXT’in 2019 yılında sona eren bir önceki girişimi kapsamında, geniş bir kimyasal alanı kapsayan “minimum parça ve maksimum çeşitlilik” hedefiyle 768 parçadan oluşan bir fragman kütüphanesi hazırlanmıştı. Ayrıca, diğer parça kütüphanelerinden farklı olarak, iNEXT parça kütüphanesi de karmaşık, yüksek afiniteli ligandların aşağı akış sentezini kolaylaştırmak amacıyla “hazır parçalar” kavramına dayanarak tasarlanmıştır ve bundan böyle kurum içi kütüphane olarak bilinir (Diamond, Structural Genomic Consortium ve iNEXT).
FBDD’nin NMR tarafından kurulması insan gücü, bilgi ve enstrümantasyon gerektirir. BMRZ’de, NMR tarafından parça taramasına teknik yardımı desteklemek için optimize edilmiş iş akışları geliştirilmiştir. Bunlar arasında parça kütüphanesi 9’un kalite kontrolü ve çözünürlük değerlendirmesi, seçilen hedefler için tampon optimizasyonu, 1H veya 19F- gözlemlenen 1D-ligand tabanlı tarama, ortosterik ve allosterik bağlanma arasında ayrım yapmak için rekabet deneyleri, epitop haritalaması için 2D tabanlı hedef gözlemlenen NMR deneyleri ve ilk parça isabetlerinin ikincil türev setiyle etkileşimi karakterize etmek için yer almaktadır. BMRZ, daha önce literatür 10,11’de de tartışıldığı gibi, küçük molekül-protein etkileşimlerinin analizi için otomatik rutinler oluşturmuştur ve NMR tabanlı fragman taraması için gerekli tüm otomatik altyapıya sahiptir. Çok çeşitli afinite rejimlerindeki parçaları tanımlamak için doygunluk transfer farkı NMR (STD-NMR), su-ligandı (waterLOGSY) ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill tabanlı (CPMG tabanlı) gevşeme deneylerinin yanı sıra ilaç keşfi için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonu ve yazılımı uygulamıştır. NMR bazlı fragman taraması proteinler için iyi kurulmuş olsa da, bu yaklaşım RNA ve DNA ile etkileşime giren yeni ligandları bulmak için daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. BMRZ, küçük molekül-RNA / DNA etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlayan yeni protokoller için kavram kanıtı oluşturmuştur. Bu katkının ilerleyen bölümlerinde, protein ve RNA örnekleri üzerinde tarama rutinlerinin uygulanmasının, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olduğu bildirilmektedir.
NMR tabanlı fragman/ilaç taramasının çok yönlülüğü. BMRZ, ilaç keşfi için çok çeşitli afinite rejimindeki parçaları tanımlamak için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonunun yanı sıra STD-NMR, waterLOGSY ve gevşeme deneylerini başarıyla uygulamıştır. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. 1 H, 19 F, 13C ve 15N için yakın zamanda satın alınan bir kriyojenik prob, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve 19F algılama sırasında 1 H (1) dekuplaja izin verir. Bu prob, CMC-q, CMC-assist, CMC-se ve FBS (TopSpin’e dahil) dahil olmak üzere Bruker’in gelişmiş yazılım araçlarını kullanma imkanı sunan en yeni nesil NMR konsoluna bağlanır. Parça tabanlı tarama (FBS) aracı, TopSpin’in en son sürümüne dahil edilmiştir ve STD, waterLOGSY, T2 / T1r-gevşeme deneylerinden oluşan yüksek verimli verilerin analiz edilmesine yardımcı olur. Sıvı 1D 1H numune toplama, numune doldurma robotu kullanılarak NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabilir. Tipik olarak, 96 tüpten (3 mm) oluşan bir blok yaklaşık iki saat içinde doldurulur. 96 delikli plaka rafları, bloğun barkodunu okuyan ve NMR tüplerini otomasyon yazılımı (IconNMR) tarafından kontrol edilen deneylere atayan HT numune değiştiriciye doğrudan yerleştirilir. HT numune değiştiricide aynı anda beş adet 96 delikli plaka rafı saklanabilir ve programlanabilir. Her bir rafın sıcaklığı ayrı ayrı kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Ek olarak, her bir numune ölçümden önce istenen sıcaklığa önceden koşullandırılabilir (yoğuşmuş nemin giderilmesi için ön ısıtma ve boru kurutma).
Çok çeşitli uygulamalar için uygunluk. Bu otomatik NMR tabanlı taramanın geniş uygulamalarından biri, bir biyomakromoleküler hedefe (DNA / RNA / Proteinler) bağlanan yeni ligandları tanımlamak ve geliştirmektir. Bu ligandlar, tipik olarak kovalent olmayan şekilde bağlanan ortosterik ve allosterik inhibitörleri içerebilir. Ayrıca, NMR tarafından FBDD tipik olarak umut verici bileşikleri seçmek için ilk adım olarak kullanılır, karşılanması gereken gereksinimler biyomoleküler hedefin yeterli miktarlarda mevcudiyetidir. Bu hedef iki ana göreve ayrılmıştır.
Birinci görev, aşağıdaki nedenlerden dolayı şirket içi bir parça kütüphanesi geliştirmek ve karakterize etmektir: 1000’den fazla parçanın ilk ve periyodik kalite kontrolü, karakterizasyonu ve nicelleştirilmesi; fragmanların her bir hedef için, özellikle protein hedefleri için optimize edilmiş tamponlardaki çözünürlüğünün belirlenmesi; ve çeşitli iskeleleri barındıracak ve diğer makromolekül sınıflarına doğru uzanacak birkaç kütüphanenin kurulması. İkinci görev, NMR tarafından fragman tabanlı ilaç tasarımı (FBDD) için iş akışlarını entegre etmektir: otomatik 1D-ligand gözlemlenen tarama (1H ve 19F gözlenen); ortosterik ve allosterik bağlamayı ayırt etmek için otomatik replasman testleri ((doğal) ligand ile rekabet deneyleri); birden fazla parçaya sahip otomatik ikincil taramalar; otomatik 2D-protein taraması ve EU-OPENSCREEN kütüphanesini veya başka bir kütüphaneyi kullanan ilk vuruş etrafında bir dizi türevin ikincil taraması; ve seçilen hedeflere karşı FDA kütüphanesinin yeniden profillendirilmesi.
Ek olarak, hücre döngüsü kontrolünü ve metabolizmasını birbirine bağlayan düzenleyici mekanizmaları çözmek için çeşitli hücre hatlarının metabotiplemesi (hastalıkla ilgili) yapılabilir. Ayrıca, yapı / alan optimizasyonunun optimizasyonu için in vivo ve in vitro RNA / DNA / protein düzenleme elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu (yapısal araştırmalar için stabilite optimizasyonu (Tampon, pH, sıcaklık ve tuz taraması) ve NMR bazlı fragman taramasının membran proteinlerine ve genellikle diğer tekniklere erişilemeyen içsel olarak bozulmuş proteinlere genişletilmesi vardır.
Sınırlama. 19F ve 1H parça kütüphanelerinin kullanımının artıları ve eksileri vardır, bunlardan birkaçı aşağıda belirtilecektir. 19F’ye karşı 1H ölçümlerinin en büyük yararı, hem gerçek ölçüm süresinin hem de sonraki analizin hızıdır, çünkü karışımlar neredeyse iki kat daha fazla parça içerir ve daha az deney yapılması gerekir. Takip analizi, 19F tarama için de daha kolaydır, çünkü tamponlardan parazit yoktur ve ayrıca optimum şekilde tasarlanmış bir parça karışımı için neredeyse hiç sinyal çakışması olmadan daha geniş bir kimyasal kayma aralığı sunar. Spektrumların kendileri büyük ölçüde basitleştirilmiştir, genellikle flor atomlarının sayısına bağlı olarak parça başına sadece bir veya iki sinyale sahiptir. Bu spektrumların analizi bu nedenle otomatikleştirilebilir ve yine zaman içinde kısaltılabilir. Bu, en azından bu çalışmada kullanılan kütüphane için kimyasal çeşitlilik pahasına gelir. Kütüphanenin sadece ~% 13’ü 19 F içerdiğinden, ancak doğal olarak hepsi 1H taramasında kullanılabilir olduğundan, 19F tarama parçalarının çeşitliliği daha düşük olacaktır. Bu, daha fazla parçaya ve daha büyük kimyasal çeşitliliğe sahip özel olarak tasarlanmış 19F kütüphaneleri kullanılarak atlatılabilir. 19F tarama için bir diğer dezavantaj, parça başına düşük sinyal sayısıdır. Parçalar genellikle birden fazla hidrojen atomundan oluşur. Bu nedenle, 1saat gözlemlenen tarama deneyleri, bağlanmayı tespit etmek için aynı parça için farklı sinyallere güvenebilir. Bu, 1H taraması için isabetleri belirlerken daha yüksek bir güven derecesi sağlarken, 19F taraması parça başına verilen bir veya iki sinyale dayanmalıdır.
Modern otomatik NMR tabanlı fragman tarama enstrümantasyonu, yazılım ve analiz yöntemleri ve bunların protokolleri hakkında ayrıntılı bir açıklama sunulmuştur. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli bir numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. 1H, 19 F, 13 C ve 15N için yakın zamanda monte edilmiş bir kriyojenik prob kafası, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve 19F algılama sırasında 1H dekuplaja izin verir. Ayrıca, en yeni nesil NMR konsolu, edinim ve anında analize yardımcı olmak için gelişmiş analitik yazılım kullanma imkanı sunar. Yukarıda tartışılan teknoloji, iş akışları ve açıklanan protokoller, FBS’yi NMR tarafından takip eden kullanıcılara kayda değer bir başarı sağlamalıdır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Avrupa Komisyonu’nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen 871037 numaralı proje iNEXT-Discovery tarafından desteklenmiştir.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |