Summary
La protéine d’anticorps recombinante exprimée dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les anticorps monoclonaux produits à l’aide de la technologie traditionnelle de l’hybridome peut reconnaître et se lier à la protéine porcine aminopeptidase N (APN).
Abstract
L’aminopeptidase porcine N (APN), une métallopeptidase membranaire abondamment présente dans la muqueuse intestinale grêle, peut déclencher une réponse immunitaire muqueuse sans aucune interférence telle qu’une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels. Cela fait de l’APN un candidat attrayant dans le développement de vaccins qui ciblent sélectivement l’épithélium muqueux. Des études antérieures ont montré que l’APN est une protéine réceptrice à la fois pour Escherichia coli entérotoxinogène (E. coli) F4 et pour le virus de la gastro-entérite transmissible. Ainsi, l’APN est prometteur dans le développement de conjugués anticorps-médicament ou de nouveaux vaccins basés sur des anticorps spécifiques de l’APN. Dans cette étude, nous avons comparé la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN (mAbs) en utilisant la technologie traditionnelle de l’hybridome et la méthode d’expression des anticorps recombinants. Nous avons également établi une lignée cellulaire d’ovaire de hamster chinois (CHO) à transfectation stable en utilisant pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN et une souche d’expression d’E. coli BL21(DE3) hébergeant le vecteur pET28a (+)-rAbs-APN. Les résultats montrent que les anticorps exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les AcM produits à l’aide d’hybridomes pourraient reconnaître et se lier à la protéine APN. Cela fournit la base pour une élucidation plus poussée de la fonction du récepteur APN pour le développement de thérapies ciblant différents épitopes spécifiques de l’APN.
Introduction
L’aminopeptidase N (APN), une enzyme de travail au noir appartenant à la famille des métalloprotéinases M1, agit comme marqueur tumoral, récepteur et molécule de signalisation via des voies dépendant des enzymes et indépendantes des enzymes 1,2. En plus de cliver les résidus d’acides aminés N-terminaux de divers peptides bioactifs pour la régulation de leur activité biologique, l’APN joue un rôle important dans la pathogenèse de diverses maladies inflammatoires. L’APN participe au traitement et à la présentation des antigènes par des peptides parés qui se lient étroitement aux molécules majeures du complexe d’histocompatibilité de classe II 2,3. L’APN exerce également des effets anti-inflammatoires en se liant aux récepteurs couplés aux protéines G participant à la transduction de signaux multiples, modulant la sécrétion de cytokines et contribuant à la phagocytose médiée par le récepteur gamma Fc dans la réponse immunitaire 4,5,6,7.
En tant qu’exopeptidase membranaire largement distribuée, l’APN est abondante dans la muqueuse intestinale grêle porcine et est étroitement associée à l’endocytose médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN reconnaît et lie la protéine de pointe du virus de la gastro-entérite transmissible pour l’entrée cellulaire, et interagit directement avec la sous-unité FaeG des fimbriae entérotoxinogènes Escherichia coli F4 pour affecter l’adhérence bactérienne avec les cellules hôtes 9,10,11. Ainsi, l’APN est une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des maladies infectieuses virales et bactériennes.
Depuis le développement de la technologie des hybridomes et d’autres stratégies pour la production d’anticorps monoclonaux (mAbs) en 1975, les AcM ont été largement utilisés en immunothérapie, en administration de médicaments et en diagnostic12,13,14. Actuellement, les AcM sont utilisés avec succès pour traiter des maladies telles que le cancer, les maladies inflammatoires de l’intestin et la sclérose en plaques12,15. En raison de leur forte affinité et spécificité, les AcM peuvent être des cibles idéales dans le développement de conjugués anticorps-médicament (ADC) ou de nouveaux vaccins16,17. La protéine APN est essentielle pour délivrer sélectivement des antigènes à des cellules spécifiques et peut provoquer une réponse immunitaire muqueuse spécifique et forte contre les agents pathogènes sans aucune interférence, y compris une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels 5,8,18. Par conséquent, les produits thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN sont prometteurs contre les infections bactériennes et virales. Dans cette étude, nous décrivons la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN à l’aide de la technologie de l’hybridome et l’expression d’anticorps recombinants anti-APN (rAbs) à l’aide de vecteurs procaryotes et eucaryotes. Le résultat indique que la protéine APN a été reconnue à la fois par les AcR exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les mAbs dérivés d’hybridomes.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Préparation de l’antigène de la protéine APN porcine
NOTE: La souche pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) et les cellules APN exprimées de manière stable pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 ont été construites dans une étude précédente11.
- Récupérer les bactéries d’un stock de glycérol congelé et les traîner sur des plaques de Luria-Bertani (LB) contenant 50 μg/mL de kanamycine (Km+) pour isoler une seule colonie.
- Prélever une seule colonie dans la plaque fraîchement striée, cultiver dans 4 mL de milieu LB (10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure, pH 7,2) complété par Km+ (50 μg/mL), et laisser pousser toute la nuit (12-16 h) en agitant (178 rpm) à 37 °C.
- Diluer les bactéries préparées à 1:100 dans du bouillon frais Km+ LB et incuber à 37 °C en agitant pendant 2-3 h jusqu’à ce que le OD600 atteigne 0,4-0,6.
- Ajouter l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) au milieu jusqu’à une concentration finale de 0,4 mM, et incuber les cultures pendant 10 h supplémentaires à 16 °C.
- Par conséquent, centrifuger et récolter les bactéries par induction IPTG (10 000 × g, 4 °C 15 min).
- Resuspendre la pastille cellulaire à l’aide de 5 mL de tampon LEW (Lyse/Equilibration/Wash) (50 mM de phosphate de sodium anhydre monobasique (NaH2PO4) et 300 mM de NaCl, pH 8,0) contenant 1 mg/mL de lysozyme. Remuer la suspension bactérienne pendant 30 min sur glace et soniquer complètement (impulsion de 15 s et 20 s éteinte, 15 min) à l’aide d’un homogénéisateur à ultrasons.
- Centrifuger le lysat de cellules brutes à 4 °C et 10 000 × g pendant 30 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans une colonne pré-équilibrée et incuber 1-2 min avant le drainage par gravité. Répétez cette étape trois fois.
- Lavez la colonne à l’aide de 20 ml de tampon LEW et égouttez par gravité. Éluer la protéine APN marquée à l’histidine à l’aide de 9 mL de tampon d’élution (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl et 250 mM imidazole, pH 8,0) et recueillir dans un tube de dialyse.
- Dialyser la solution protéique pendant une nuit à 4 °C dans un tampon carbonate de sodium-bicarbonate de sodium (PBS, NaCl 135 mM, chlorure de potassium 4,7 mM, NaH 2 PO4 et phosphate de sodium dibasique dodécahydraté de 10 mM, pH7,2).
- Analyser à l’aide d’un gel SDS-PAGE à 12,0 % et d’un transfert Western pour évaluer la pureté de la protéine APN.
- Charger 5 μg de protéines dans chaque puits du gel et laisser fonctionner à 110 V pendant 1,5 h. Ensuite, transférer la protéine sur une membrane PVDF pendant 50 minutes à 15 V. Déterminer la concentration de la protéine purifiée à l’aide d’un dosage BCA.
2. Immunisation des animaux
- Injecter par voie sous-cutanée (s.c) des souris femelles BALB/c, âgées de 6 à 8 semaines, avec 50 μg de protéine APN ou PBS (témoin négatif) mélangé à des adjuvants une fois toutes les 2 semaines. Utilisez l’adjuvant de Freund complet qui contient les mycobactéries tuées par la chaleur pour l’immunisation initiale et l’adjuvant de Freund incomplet pour les vaccins de rappel. Mélanger des volumes égaux de protéine APN (ou PBS) et d’adjuvant de Freund ou d’adjuvant de Freund incomplet, respectivement.
- Détecter les titres d’anticorps contre l’APN dans le sérum de ces souris par dosage immuno-enzymatique indirect (ELISA) à l’aide d’une plaque de microtitrage recouverte de 5 μg/mL de protéine APN diluée dans 0,05 M PBS (pH 9,6). .
3. La technologie de l’hybridome pour produire des anticorps monoclonaux contre l’APN
- Par voie intrapéritonéale (i.p.) injecter 100 μg de protéine APN dans les souris sélectionnées pour un regain d’antigène final.
- Trois jours plus tard, euthanasier les souris en utilisant du pentobarbital sodique (50 mg / kg, v / v, intrapéritonéal) et une luxation cervicale.
- Recueillir la rate et laver avec DMEM deux fois pour éliminer le sang et les cellules graisseuses. Filtrer la suspension de cellules de la rate à l’aide d’une grille de cuivre de 200 mailles pour éliminer les débris tissulaires et récolter les cellules de la rate par centrifugation (1500 × g, 10 min) pour enlever la membrane de la rate.
- Cellules de myélome SP2/0 de souris graine dans une fiole de 25 cm 2 contenant 5 mL de DMEM additionnée de sérum fœtal bovin (FBS) à 6 % et d’une culture à 37 °C, atmosphère de 6 % de CO2 pour maintenir la viabilité cellulaire. Après 5-6 jours de culture, les cellules atteignent 80% à 90% de confluence après la réanimation et sont en phase de croissance. Au microscope, les cellules sont rondes, brillantes et claires.
- Un jour avant l’hybridation, collecter les macrophages des cavités péritonéales des souris selon une méthode précédemment publiée12,19.
- Ensemencer des macrophages péritonéaux à une densité de 0,1 à 0,2 × 105/mL dans des plaques de 96 puits, chaque puits contenant 100 μL de milieu HAT (DMEM complété par 10 % de FBS et 1x supplément de HAT), et incuber à 37 °C, 6 % de CO2 atmosphère humidifiée pendant la nuit.
- Pour l’hybridation, aspirer doucement les cellules SP2/0 à l’aide d’une pipette de 8 à 10 bouteilles et les suspendre dans 10 ml de milieu DMEM sans sérum. Laver les cellules avec du DMEM frais, centrifuger (1500 × g, 10 min) deux fois, puis remettre en suspension dans 10 ml de DMEM.
- Mélanger les cellules quantifiées de la rate avec des cellules SP2/0 dans un rapport de 10:1 et transférer dans des tubes de 50 mL. Centrifuger (1500 × g, 10 min) et jeter le surnageant. Recueillir les granulés cellulaires au fond des tubes et tapoter avec la paume pour desserrer les granulés avant l’hybridation.
- Ajouter 1 mL de polyéthylèneglycol 1500 (PEG 1500), préchauffé à 37 °C, goutte à goutte à l’aide d’un compte-gouttes sur la pastille de cellule desserrée pendant 45 s tout en tournant doucement le fond du tube.
- Ajouter lentement 1 mL de DMEM préchauffé à 37 °C au mélange ci-dessus sur la période de 90 s, suivi d’un autre 30 mL de DMEM frais. Placer le tube de fusion dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
- Après l’incubation dans le bain chaud, récolter les cellules et les remettre en suspension dans un milieu HAT. Puis culture dans une plaque de 96 puits inoculée avec des macrophages péritonéaux.
- Cinq jours plus tard, ajoutez 100 μL de milieu HAT frais à chaque puits et incuber la plaque pendant 5 jours supplémentaires, après quoi remplacez le milieu par un milieu HT (DMEM complété par 10% FBS et 1x HT Supplement).
- Utiliser une plaque de microtitrage recouverte de 5 μg/mL de protéine APN diluée dans 0,05 M de PBS (pH 9,6) pour analyser les anticorps monoclonaux dans le surnageant de l’hybridome à l’aide du test ELISA.
- Lorsque le milieu dans les puits de la plaque de 96 puits devient jaune (en raison de la croissance cellulaire et de la libération de métabolites, le pH dans le milieu diminue à 6,8 et le rouge phénol passe du fuchsia au jaune) ou que des grappes cellulaires sont observées, acquérir 100 μL de surnageant des puits sélectionnés et ajouter aux puits de la plaque ELISA revêtue. Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs OD450.
- Utiliser les anticorps polyclonaux contre l’APN et le sérum de souris non infecté comme témoin positif et négatif, respectivement, et utiliser le PBS comme témoin blanc. Dans cette étude, le rapport OD450 de l’échantillon par rapport au témoin négatif (P/N) ≥ 2,1 a été reconnu comme norme de sélection positive.
- Après trois cycles consécutifs de sélection positive, sélectionner l’hybridome présentant une réponse sérologique accrue contre la protéine APN pour un test de dilution limité.
- Préparer les macrophages péritonéaux et les ensemencer dans des plaques à 96 puits, comme décrit précédemment.
- Suspendre les cellules d’hybridome dans un milieu HT à une moyenne de 0,5 à 2 cellules par puits et les cultiver dans un incubateur à 37 °C, 6% de CO2 . Répétez cette étape trois ou quatre fois jusqu’à ce que le taux de positivité indiqué par le dosage immunologique ELISA atteigne 100 %.
- Sous la pression de la congélation et de la décongélation continues, sélectionner les cellules d’hybridome positives capables de sécréter de manière stable des anticorps anti-APN et de proliférer normalement.
- Administrer une seule injection intraveineuse de 0,3 mL de pristane à chaque souris (8-10 semaines). 10 jours après avoir reçu Pristine, injecter à chaque souris 2-5 x 10 5 cellules d’hybridome dans0,5 mL de PBS (pH 7,2).
- Prélever soigneusement le liquide péritonéal de la cavité péritonéale de ces souris 8 à 10 jours après l’injection.
- Récolter les surnageants par centrifugation à 5 000 × g pendant 15 min, et purifier les anticorps dans les surnageants en utilisant 33% de précipitation saturée de sulfate d’ammonium [(NH 4)2SO4] et d’agarose de protéine A.
4. Caractérisation des AcM contre la protéine APN
- Déterminer le sous-type d’immunoglobuline des AcM prélevés à l’aide d’un système de clonotypage SBA-HRP20. Utilisez SDS-PAGE et Western blot pour évaluer la pureté et la spécificité des AcM.
- Analyser la spécificité de l’épitope mAb par rapport à la protéine APN à l’aide d’ELISA21. La valeur d’additivité (AV) est le rapport entre les AcM OD (a+b) et (OD mAbs-a+ODmAbs-b), qui est utilisé pour évaluer si les AcM reconnaissent le même site antigénique; ODmAbs-a et OD mAbs-b représentent les valeurs OD450 de différents anticorps monoclonaux contre APN seul, et ODmAbs (a+b) représentent les valeurs OD450 d’un mélange 1:1 de deuxAcM contre APN.
- Évaluez chaque échantillon au moins quatre répétitions et répétez l’expérience entière au moins trois fois.
5. Expression d’AcR contre APN
- Extraire l’ARN total des cellules d’hybridome et de la rate susmentionnées de souris immunisées contre les APN (p. ex. TRIzol)22. Synthétiser l’ADN complémentaire (ADNc) à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc selon les instructions du fabricant.
- Amplifier les régions variables des AcM à l’aide de la PCR imbriquée et déterminer les séquences de chaînes lourdes (VH) et de chaînes légères (VL) à l’aide du séquençage. Analysez les gènes codant VH et VL à l’aide de l’outil d’analyse du génome de souris IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combinez les gènes VH et VL avec des séquences de tête et sous-clonez-les séquentiellement dans les vecteurs pET28a (+) et pIRES2-ZsGreen1, respectivement, en utilisant une technologie de clonage transparente pour permettre l’insertion de fragments d’ADN sans cicatrice. Les amorces spécifiques sont énumérées dans le tableau 1.
- Cultiver les bactéries transformées en pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 en présence de 0,4 mM IPTG dans des agitateurs orbitaux à 37 °C pendant 10 h. Ensuite, induire, purifier et évaluer l’expression de la protéine rAbs en utilisant la purification de routine des protéines.
- Ensemencer 100 μL 0,5 x 105 cellules CHO par puits dans une plaque de 96 puits et incuber à 37 °C dans une atmosphère de 6 % de CO2 pendant 18 à 24 h. Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, diluer le plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN avec Opti-MEM à une concentration finale de 0,1 μg/μL, et incuber 5 min à température ambiante avant de l’utiliser pour la transfection.
- Mélanger délicatement 50 μL de plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN dilué avec 1 μL de Lipofectamine 2000 et 49 μL d’Opti-MEM, et incuber le mélange pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. Ajouter 100 μL de mélange dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant des cellules CHO et incuber à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 6 % pendant 4 à 6 h.
- 4-6 h après la transfection, remplacer le milieu par un milieu DMEM-F12 complété par 10% FBS, et incuber la plaque pendant 48 h supplémentaires. Ensuite, ajoutez 400 μg/mL de G418 à chaque puits pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable.
- Après 10 jours de sélection en utilisant un milieu DMEM-F12 complété par 10% FBS et 400 μg/mL G418, trier les cellules (3,0 × 107 cellules/mL) par tri cellulaire activé par fluorescence. Environ 10 à 15 % de la population cellulaire était positive.
- Diluer en série les cellules positives récoltées, semer en moyenne 0,5 à 2 cellules par puits dans une plaque de 96 puits et les cultiver dans un incubateur à 37 °C, 6% de CO2 . Maintenir les cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectées de manière stable en utilisant la sélection avec G418 (200 μg/mL).
- La concentration de FBS dans le milieu de culture cellulaire décrit ci-dessus diminue progressivement de 10% à 0% pendant la phase de croissance logarithmique sur une période de 3 semaines. Ensuite, adaptez les cellules CHO adhérentes à la croissance en suspension dans un milieu sans sérum.
- Culture des cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO ensemencées en phase de croissance logarithmique en milieu anormal de sérum à une densité de 0,8-1,0 × 105 cellules/mL dans des flacons agités à une vitesse d’agitation de 80-110 rpm et à 37°C, 6% CO2.
- Prélever la suspension cellulaire toutes les 12 heures pour déterminer les changements dans la viabilité et la vitalité des cellules à l’aide d’une trousse de comptage des cellules (p. ex., CCK-8) conformément aux instructions du fabricant.
- L’expression des anticorps atteint des niveaux maximaux lorsque la viabilité cellulaire diminue à 80% et que la densité cellulaire atteint 1,0-2,0 × 106 cellules / mL. Récolter les surnageants cellulaires par centrifugation, filtrer à l’aide d’un filtre à membrane en polytétrafluoroéthylène de 0,22 μm et purifier à l’aide d’agarose à protéine A.
- Confirmer la production d’anticorps spécifiques à l’APN à l’aide de tests d’immunofluorescence indirecte (IFA).
- Déterminer les titres d’anticorps et les affinités de liaison à l’aide du test ELISA, comme décrit précédemment. 23 Calculer la constante de dissociation à l’équilibre (valeur KD ) des anticorps à l’aide d’une équation logistique à quatre paramètres à l’aide d’un logiciel.
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Representative Results
Dans cette étude, la protéine APN soluble purifiée (2,12 mg/mL) a été utilisée pour l’immunisation des souris. Les souris immunisées avec la protéine APN quatre fois à des intervalles de 14 jours présentaient un titre d’anticorps plus élevé contre l’APN dans leurs sérums. Bien que 14 hybridomes aient été obtenus à l’aide des expériences de fusion, seulement 9 hybridomes ont survécu aux trois cycles continus de gel-dégel, ce qui a donné 9 clones stables qui ont sécrété des anticorps contre l’APN. Toutes ces cellules sont rondes, lumineuses et claires (Figure 1). Les AcM purifiés possédant des chaînes lourdes et légères (50 kDa et 25 kDa, respectivement) ont été confirmés par SDS-PAGE et trouvés dans l’ascite purifiée (Figure 2). Les titres de ces anticorps monoclonaux anti-APN dans les surnageants et les ascite de culture sont indiqués dans le tableau 2.
Le résultat de l’isotypage des AcM de souris a révélé que les AcM dérivés des clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 et 6C56 possédaient des sous-classes d’IgG2b, tandis que l’APN-2A20 était un anticorps de type κappa- (κ) IgG2a et que les anticorps monoclonaux APN-3FD9, -3F10 et -10F3 appartenaient au type IgM et traitaient les chaînes légères κ (tableau 3). Comme le montre le tableau 4, la plupart de ces anticorps monoclonaux présentaient des valeurs AV supérieures à 50%, indiquant qu’ils ciblaient différents épitopes dans l’APN, tandis que l’anticorps APN-5C51 reconnaissait des épitopes antigéniques similaires à ceux reconnus par APN-3C48, -5B31 et -6C56 mAbs.
L’APN-5B36 a montré un titre d’anticorps considérablement plus élevé que celui des autres mAbs. Par conséquent, le gène APN-5B36 VH-VL a été amplifié et ligaturé en un vecteur pET28a (+) ou pIRES2-ZsGreen1 pour construire les plasmides d’expression recombinants pET28a (+)-rAbs-APN et pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN, respectivement (Figure 3). Les anticorps exprimés par les cellules pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) et pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO ont été purifiés et analysés à l’aide des tests ELISA et IFA. Cependant, comme le montre la figure 4, seul l’anticorps exprimé dans le surnageant des cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO a reconnu la protéine APN, tout comme les mAbs dérivés d’hybridomes. Cet anticorps recombinant était constitué de chaînes lourdes IgG2b et de chaînes légères lambda, et présentait un titre de 2,56 × 105 déterminé par ELISA. La liaison des AcM APN-5B36 aux protéines APN a atteint un équilibre plus tôt que les AcR (Figure 5), montrant une valeur KD de (4,232±0,475) × 10-9 et (2,201±0,367) × 10-8 mol/L, respectivement.
| Amorce | Séquence (5'-3') | ||
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGGGGGG | ||
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT | ||
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA | ||
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC | ||
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGGGA | ||
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGATACCCGTATTACCC | ||
Tableau 1. Les amorces spécifiques utilisées dans cette étude.
| Cellules | Titres de surnageants (U/mL) | Titres d’ascite (U/mL) |
| 2A20 | 0,64×104 | 3.20×105 |
| 5B31 | 1,28×104 | 1,60×105 |
| 5B36 | 0,64×104 | 1,28×106 |
| 3C48 | 0,16×104 | 0,80×105 |
| 5C51 | 0,16×104 | 0,80×104 |
| 6C56 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3FD9 | 0,80×103 | 0,80×104 |
| 3F10 | 0,16×104 | 0,16×105 |
| 10F3 | 0,80×103 | 0,32×105 |
Tableau 2. Les titres ELISA de APN mAbs.
| Ig | IgA | Igm | IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | Kappa | Lambda | Résumé | |
| 2A20 | 1.735 | 0.023 | 0.011 | 0.006 | 0.903 | 0.044 | 0.015 | 0.137 | 0.073 | IgG2a, Kappa |
| 5B31 | 1.199 | 0.006 | 0.003 | 0.005 | 0.005 | 1.731 | 0.004 | 0.004 | 0.413 | IgG2b, Lambda |
| 5B36 | 1.652 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.008 | 2.41 | 0.002 | 0.003 | 0.707 | IgG2b, Lambda |
| 3C48 | 0.951 | 0.063 | 0.068 | 0.104 | 0.062 | 1.785 | 0.059 | 0.065 | 0.51 | IgG2b, Lambda |
| 5C51 | 1.064 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 1.87 | 0.004 | 0.004 | 0.415 | IgG2b, Lambda |
| 6C56 | 0.78 | 0.062 | 0.06 | 0.063 | 0.063 | 1.516 | 0.062 | 0.061 | 0.387 | IgG2b, Lambda |
| 3FD9 | 1.474 | 0.007 | 1.678 | 0.003 | 0.016 | 0.081 | 0.002 | 0.519 | 0.059 | IgM, Kappa |
| 3F10 | 1.21 | 0.002 | 1.454 | 0.009 | 0.008 | 0.054 | 0.003 | 0.414 | 0.096 | IgM, Kappa |
| 10F3 | 1.179 | 0.058 | 1.562 | 0.152 | 0.131 | 0.179 | 0.044 | 0.359 | 0.049 | IgM, Kappa |
Tableau 3. Isotypes d’APN mAbs dérivés d’hybridomes.
| AcM | AV (100 %) | ||||||||
| 2A20 | 5B31 | 5B36 | 3C48 | 5C51 | 6C56 | 3FD9 | 3F10 | 10F3 | |
| 2A20 | - | 0.601 | 0.905 | 0.889 | 0.804 | 0.884 | 1.009 | 1.047 | 0.914 |
| 5B31 | 0.601 | - | 0.871 | 0.754 | 0.464 | 0.694 | 0.613 | 0.88 | 0.989 |
| 5B36 | 0.905 | 0.871 | - | 0.794 | 0.684 | 0.934 | 0.91 | 1.07 | 0.959 |
| 3C48 | 0.889 | 0.754 | 0.794 | - | 0.461 | 0.709 | 0.428 | 1 | 0.787 |
| 5C51 | 0.804 | 0.464 | 0.684 | 0.461 | - | 0.301 | 0.601 | 0.594 | 0.852 |
| 6C56 | 0.884 | 0.694 | 0.934 | 0.709 | 0.301 | - | 1.216 | 0.583 | 0.389 |
| 3FD9 | 1.009 | 0.613 | 0.91 | 0.428 | 0.601 | 1.216 | - | 1.737 | 0.744 |
| 3F10 | 1.047 | 0.88 | 1.07 | 1 | 0.594 | 0.583 | 1.737 | - | 0.682 |
| 10F3 | 0.914 | 0.989 | 0.959 | 0.787 | 0.852 | 0.389 | 0.744 | 0.682 | - |
Tableau 4. Discrimination de la spécificité antigène-épitope des mAbs spécifiques de l’APN. Des valeurs AV supérieures à 0,5 indiquent que ces deux AcM reconnaissent des sites antigéniques différents; Des valeurs AV inférieures à 0,5 indiquent que ces deux AcM reconnaissent un site antigénique similaire.
Graphique 1. Image d’hybridomes. Sous analyse microscopique, les hybridomes sont ronds, brillants et clairs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Niveaux d’expression d’anticorps recombinants et ascite analysés à l’aide de SDS-PAGE. A) Lane M, marqueur protéique; voie 1, lysat purifié pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); voie 2, surnageant pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); voie 3, ascite fluide purifié par 33% (NH 4)2SO4 précipitations. (B) Lane M, marqueur protéique; voie 1, ascite liquide purifié à l’aide de protéine A agarose. Dans ce test, 3 à 5 μg de protéines totales ont été chargés dans chaque voie du gel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Plasmides d’expression recombinants pET28a (+)-rAbs-APN et pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Lane M, Trans 2K plus marqueur ADN; voie 1, vecteur pET28a (+) (5369 pb); voies 2 et 5, gène VH-VL combiné à la séquence de tête APN-5B36; voie 3, plasmide pET28a (+)-rAbs-APN exprimé en BL21 (DE3) E. coli; voie 4, vecteur pIRES2-ZsGreen1 (5283 pb); lane 6, plasmide pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN exprimé en DH5α E. coli. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Expression de la protéine anticorps recombinante et de l’ascite analysée par immunofluorescence indirecte. Les cellules pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 (fluorescence verte) exprimant de manière stable l’APN ont été traitées avec (A) PBS, utilisé comme traitement témoin; (B) protéine purifiée exprimée par pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3); (C) anticorps polyclonal APN (1:500); D) liquide d’ascite purifié (1:500); E) surnageant purifié obtenu à partir de cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO (1:500). DAPI a été utilisé comme contre-colorant nucléaire en microscopie confocale. Les cellules incubées avec l’anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre conjugué DyLight 549 (1:200) et traitées avec une ascite purifiée et un surnageant purifié à partir de cellules pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO ont montré un signal de fluorescence rouge robuste indiquant que l’anticorps polyclonal APN l’a fait. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Détermination des affinités de liaison relative aux anticorps à l’aide de l’ELISA22. L’absorption d’échantillons contenant des anticorps monoclonaux APN-5B36 ou rAbs, en l’absence et en présence de protéine APN, a été mesurée à la longueur d’onde de 450 nm. La courbe de liaison a été tracée à l’aide d’un ajustement de courbe logistique à quatre paramètres; L’axe des x montre la concentration logarithmique des anticorps et l’axe des y montre l’absorbance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’induction de l’immunité muqueuse est l’une des approches les plus efficaces pour contrer les agents pathogènes et pour prévenir et traiter diverses maladies. L’APN, une protéine membranaire fortement exprimée dans la muqueuse intestinale, est impliquée dans l’induction de la réponse immunitaire adaptative et dans l’endocytose virale et bactérienne médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN est utilisé comme particules antigéniques dans de nombreux formats de chargement d’antigènes et d’administration du vaccin. L’administration orale d’anticorps ciblant les APN peut également provoquer des réponses immunitaires efficaces 18,24,25. Cependant, les anticorps monoclonaux ciblant différents épitopes spécifiques de l’APN nécessitent des recherches plus approfondies.
Les méthodes décrites ici ont été utilisées pour produire des anticorps monoclonaux contre l’APN en utilisant à la fois des hybridomes traditionnels et des technologies recombinantes. Cette approche peut être utilisée dans la production d’autres mAbs. Tout d’abord, nous avons suivi un protocole mentionné précédemment pour obtenir neuf AcM dérivés de différents clones d’hybridomes. Bien que les titres de ces AcM dans les surnageants cellulaires et l’ascite étaient différents, tous les AcM contenaient la chaîne lourde de 50 kDa et la chaîne légère de 25 kDa et présentaient une liaison spécifique avec la protéine APN porcine. Les résultats de l’isotypage et de l’identification des épitopes d’antigènes ont montré que la plupart des AcM ciblaient différents épitopes et appartenaient à différents types d’anticorps. Ces résultats indiquent que la technologie traditionnelle des hybridomes reste un choix efficace dans la production de mAbs.
Les approches utilisées pour la production d’anticorps recombinants peuvent augmenter l’efficacité de la production d’anticorps monoclonaux et minimiser les coûts associés à la main-d’œuvre et au temps. Par conséquent, ces approches ont gagné en popularité, en particulier dans le développement d’anticorps pour des applications diagnostiques et thérapeutiques16,17,26. Les AcR présentent plusieurs avantages par rapport aux mAbs dérivés de l’hybridome. Premièrement, les AcR peuvent être produits in vitro en clonant des gènes d’anticorps en vecteurs d’expression, éliminant ainsi l’utilisation animale dans la production d’anticorps. De plus, l’utilisation de systèmes d’expression eucaryotes ou procaryotes pour produire des AcR entraîne de faibles variations d’un lot à l’autre et augmente la fiabilité et la stabilité du produit final. En revanche, les AcM produits à l’aide d’hybridomes ne reconnaissent souvent pas ou ne se lient pas aux épitopes d’antigènes ciblés, et sont affectés par la dérive de la lignée cellulaire de l’hybridome, la contamination, la perte de gènes et les mutations. Actuellement, les AcM dérivés d’hybridomes sont principalement utilisés dans les réactifs immunitaires diagnostiques ou thérapeutiques, soulignant la nécessité de produire des anticorps stables et fiables dans une période de production limitée. Pour les applications diagnostiques et thérapeutiques, la technologie des anticorps recombinants est un meilleur choix que l’approche traditionnelle basée sur l’hybridome. En effet, la technologie des anticorps recombinants nous permet de modifier la séquence des AcR pour changer les isotypes d’immunoglobulines, augmentant ainsi la spécificité de liaison de l’anticorps14,16,17.
Dans cette étude, nous avons utilisé la technologie d’ingénierie des anticorps pour obtenir des anticorps recombinants ciblant l’APN. Nous avons constaté que les rates des souris immunisées et les cellules d’hybridome étaient également efficaces pour amplifier les séquences à chaîne lourde et légère de l’AcM. L’anticorps exprimé par pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 (DE3) n’a pas reconnu efficacement l’APN dans les tests ELISA ou d’immunofluorescence indirecte. Cependant, les AcR exprimés par la suspension cellulaire pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO et les AcM dérivés de l’hybridome ont reconnu et lié efficacement la protéine APN. Les méthodes décrites dans cette étude peuvent être utilisées pour développer un ADC à base d’anticorps APN et d’autres produits thérapeutiques ciblant différents épitopes spécifiques de l’APN. Cette étude aidera également à clarifier davantage le rôle de l’APN dans la prévention et le traitement de diverses maladies. Cependant, les stratégies visant à améliorer l’affinité et le rendement des AcR nécessitent des recherches plus approfondies.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Tous les auteurs ont approuvé et donné leur consentement explicite pour la publication du manuscrit.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation nationale chinoise des sciences (n ° 32072820, 31702242), des subventions de la bourse du gouvernement du Jiangsu pour les études à l’étranger (JS20190246) et des talents de haut niveau de la Fondation de recherche scientifique de l’Université de Yangzhou, un projet fondé par le programme académique prioritaire du développement de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | 8.0 | Scientific data analysis and graphing |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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