Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøgelse af fagocytose af Leishmania ved hjælp af konfokal mikroskopi

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

Mekanismen forbundet med fagocytose i Leishmania-infektion forbliver dårligt forstået. Her beskriver vi metoder til at evaluere de tidlige begivenheder, der opstår under Leishmania-interaktionen med værtscellerne.

Abstract

Fagocytose er en orkestreret proces, der involverer forskellige trin: anerkendelse, binding og internalisering. Professionelle fagocytter optager Leishmania-parasitter ved fagocytose, der består i at genkende ligander på parasitoverflader af flere værtscellereceptorer. Binding af Leishmania til makrofagmembraner sker gennem komplementreceptor type 1 (CR1) og komplementreceptortype 3 (CR3) og mønstergenkendelsesreceptorer. Lipophosphoglycan (LPG) og 63 kDa glycoprotein (gp63) er de vigtigste ligander involveret i makrofag-Leishmania interaktioner. Efter den første anerkendelse af parasitligander af værtscellereceptorer bliver parasitter internaliseret, overlever og formerer sig inden for parasitoforiske vakuoler. Modningsprocessen af Leishmania-inducerede vakuoler involverer erhvervelse af molekyler fra intracellulære vesikler, herunder monomert G-protein Rab 5 og Rab 7, lysosomalt associeret membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt associeret membranprotein 2 (LAMP-2) og mikrotubuli-associeret protein 1A / 1B-lyskæde 3 (LC3).

Her beskriver vi metoder til at evaluere de tidlige begivenheder, der forekommer under Leishmania-interaktion med værtscellerne ved hjælp af konfokal mikroskopi, herunder (i) binding (ii) internalisering og (iii) fagosommodning. Ved at tilføje til mængden af viden omkring disse determinanter for infektionsresultat håber vi at forbedre forståelsen af patogenesen af Leishmania-infektion og støtte den eventuelle søgning efter nye kemoterapeutiske mål.

Introduction

Leishmaniasis er en forsømt tropisk sygdom forårsaget af protozoiske parasitter af slægten Leishmania, hvilket resulterer i et bredt spektrum af kliniske manifestationer hos hvirveldyrværten, herunder kutan leishmaniasis, mucokutan leishmaniasis og visceral leishmaniasis1. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslår, at over en milliard mennesker er i fare, med mere end en million nye tilfælde rapporteret om år2.

Leishmania spp. er obligatoriske intracellulære protozoer, der overlever inde i værtsceller, herunder monocytter, makrofager og dendritiske celler3. Leishmania-makrofaginteraktion er en kompleks proces, der involverer flere værtscellereceptorer og parasitligander enten gennem direkte interaktion eller ved opsonisering, der involverer komplementreceptorer 4,5. Klassiske overfladereceptorer, såsom CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectin, toll-lignende og scavenger receptorer, medierer parasitbinding til makrofager 6,7,8. Disse receptorer genkender molekyler på overfladen af Leishmania, herunder 63 kDa glycoprotein (gp63) og glycolipid lipophosphoglycan (LPG)9. Disse er de mest rigelige molekyler på overfladen af promastigotes og spiller en væsentlig rolle i undergravningen af værtsimmunrespons, hvilket favoriserer etableringen af parasitinfektion i pattedyrceller10. Efter at parasitoverfladeligander binder sig til makrofagreceptorer, akkumuleres F-actin på pattedyrcelleoverflader, omgivende parasitter, når de fagocytoseres. Efterfølgende fører dette til dannelsen af et parasitinduceret rum kaldet parasitophorous vakuol (PV), som præsenterer fagolysosomale træk11. En gang inde i disse fagolysomer gennemgår parasitter flere ændringer, der er afgørende for overlevelse og multiplikation3.

Biogenese af PV'er er en stærkt reguleret membranhandelsproces, der er kritisk for den intracellulære overlevelse af dette patogen12. Dannelsen af dette rum skyldes sekventielle fusionshændelser mellem fagosomer og rum i værtsendocytisk vej. Klassiske cellebiologiske undersøgelser har afsløret, at modningen af PV'er involverer erhvervelse af monomere G-protein Rab 5- og Rab 7-proteiner, som hovedsageligt er forbundet med henholdsvis tidlig og sen endosommodning13. Derudover erhverver disse rum lysosomassocierede membranproteiner 1 og 2 (LAMP 1, LAMP 2), de vigtigste proteinbestanddele i den lysosomale membran og mikrotubulusassocieret protein 1A / 1B-lyskæde 3 (LC3), en autofagosommarkør14. På trods af tilsyneladende ligheder varierer kinetikken af PV-dannelse15,16 og morfologien af disse rum afhængigt af Leishmania-arter. For eksempel inducerer infektion forårsaget af L. mexicana eller L. amazonensis dannelsen af store rum indeholdende et stort antal parasitter17. I modsætning hertil danner andre arter, såsom L. braziliensis og L. infantum, mindre vakuoler, der normalt kun indeholder en eller to parasitter i hver vakuol18.

På trods af denne viden omkring værtscelle-Leishmania-interaktion er de indledende begivenheder udløst af kontakt mellem værtsreceptorer og parasitligander ikke blevet fuldt ud belyst. Disse hændelser vides at være determinanter for resultatet af parasitinfektion og er afhængige af parasitarter, typen af værtscellereceptorer, der rekrutteres til at genkende parasitter og aktiveringen af makrofagsignaleringsveje19,20. Derfor er det vigtigt at identificere de molekyler, der er involveret i biogenesen af Leishmania-inducerede PV'er, og bestemme den eller de roller, som disse molekyler spiller i infektionsetablering og -resultat. Her beskriver vi en metode til overvågning af tidlige begivenheder, der forekommer under fagocytose af Leishmania, herunder binding, internalisering, fagosomdannelse og modning. Dette arbejde kunne hjælpe med at afklare PLC's, Akts, Rab5s, Rab7' og LC3's deltagelse i dannelsen af PC'er induceret af forskellige Leishmania-arter. Det er vigtigt, at denne protokol kan bruges til at undersøge deltagelsen af andre proteiner involveret i PV-modning. Fremtidige undersøgelser vil udvide viden omkring mekanismer involveret i Leishmania-værtscelleinteraktion og bidrage til udformningen af nye kemoterapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Celler blev opnået fra raske donorer efter godkendelse af procedurer fra de nationale videnskabsetiske komitéer (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Cellekulturer

  1. Humane monocytafledte makrofager
    BEMÆRK: For at opnå humane monocytafledte makrofager til in vitro-differentiering i makrofager skal der indsamles blod fra raske donorer og rense perifere blodmononukleære celler (PBMC) som beskrevet af D. English og B. R. Andersen21.
    1. Efter opsamling af perifert blod (50 ml) hældes det i et hepariniseret rør og fortyndes derefter blodet 1: 1 i en fosfatbufferopløsning (PBS) ved stuetemperatur. Placer forsigtigt fortyndet hepariniseret blod oven på det tidligere distribuerede densitetsgradientmedium.
    2. Rørene centrifugeres ved 252 × g i 30 minutter ved 24 °C for at undgå hæmolyse.
      BEMÆRK: Indstil centrifugeafbrydelse for at undgå blanding af gradientlag. Efter centrifugering dannes diskontinuerlige gradientlag fra bunden til toppen: erythrocytter, densitetsgradientmedium, PBMC-ring og plasma.
    3. PBMC-ringen, der er placeret mellem densitetsgradientmediet og plasmalagene, overføres til et nyt rør, og der fyldes med PBS for at udvaske gradientmediet med overskydende densitet.
    4. Cellerne vaskes én gang, og der skal centrifugeres ved 190 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    5. Supernatant- og resuspendpellet kasseres i 1 ml komplet RPMI-medium.
    6. Tæl cellerne og pladen 2 × 106 celler i 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suppleret med 25 mM N-[2-hydroxyethyl] piperazin-N′-[2-ethansulfonsyre] (HEPES), 2 g/L natriumbicarbonat, 2 mM glutamin, 20 g/ml ciprofloxacin og 10% inaktiveret føtalt kvægserum (FBS) (komplet RPMI-medium) i 7 dage ved 37 °C under 5 % CO2 i en 24-brønds plade for at tillade monocytter at differentiere sig til makrofager ved vedhæftning.
  2. THP-1 kulturer
    1. THP-1-cellelinje dyrkes i en koncentration på 2 × 105 celler i 10 ml komplet RPMI-medium i 75 cm2 kulturkolbe.
    2. Oprethold cellekulturer i en inkubator ved 37 °C under 5% CO2 i 7 dage.
    3. Centrifugeceller ved 720 × g i 10 minutter ved 4 °C, og pelleten genanvendes i komplet RPMI-medium.
    4. Tæl celler i et Neubauer-kammer.
    5. Pladeceller på 13 mm glasdækslerlips i en koncentration på 2 × 105 celler pr. brønd i 500 μL komplet RPMI-medium indeholdende 100 nM phorbol myristatacetat (PMA) ved 37 ° C under 5% CO2 for at muliggøre differentiering af THP1-celler i makrofager.
    6. Efter tre dage vaskes to celler med 0,9% NaCl-opløsning for at fjerne medium indeholdende PMA.
    7. Inkuber differentierede THP-1-celler i PMA-frit komplet RPMI-medium ved 37 °C under 5 % CO2 i yderligere 2 dage, før eksperimentering påbegyndes.

2. Parasitkulturer og CellTracker Rød farvning

BEMÆRK: For at visualisere parasitter gennem fluorescensmikroskopi skal du udføre farvning ved hjælp af CellTracker Red fluorescerende farvestof (CMTPX). Alternativt kan andre markører, herunder carboxyfluorescein, anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger eller promastigotes, der konstitutivt udtrykker GFP, RFP eller andre fluorescerende reportergener. Parasitter, der anvendes til at inficere celler, er dem i stationær vækstfase opnået fra en promastigote axenisk kultur på højst 7 passager.

  1. Dyrk Leishmania spp. promastigotes ved 1 x 105 parasitter pr. 1.000 μL medium i en cellekulturkolbe indeholdende 5 ml Schneiders medium suppleret med 50 μg/ml gentamicin og 10% FBS.
  2. Efter inkubation af parasitakseniske kulturer i et biokemisk iltbehov (B.O.D.) ved 24 °C udføres daglig tælling i et Neubauer-kammer. Kontroller for parasitform (tynd, langstrakt) og mobilitet i 5 dage. Parasitter betragtes i stationær vækstfase, når to på hinanden følgende tællinger med 8 timers interval viser lignende mængder.
  3. Når den stationære vækstfase er nået, inkuberes parasitterne i 4 ml 0,9% NaCl-opløsning med 1 μM CMTPX i 15 minutter ved 37 ° C under 5% CO2 , idet man undgår kontakt med lys.
  4. Tilsæt FBS i en 1: 1 andel og inkuber parasit suspension i yderligere 1 min.
  5. Parasitterne vaskes tre gange med PBS efterfulgt af centrifugering ved 1.781 × g i 10 min.
  6. Ressuspend parasitpellet i 1.000 μL RPMI komplet medium.
  7. Tæl parasitter i et Neubauer-kammer.

3. Vurdering af Leishmania binding til makrofager

  1. Frø 2 × 105 THP-1-celler eller humane monocytafledte makrofager i 500 μL komplet RPMI-medium pr. brønd på en 24-brøndplade med 13 mm glasdæksler.
  2. Celler ved 37 °C dyrkes under 5 % CO2 i 24 timer.
  3. Cellerne vaskes to gange med 0,9 % NaCl-opløsning, og der inkuberes i komplet RPMI-medium ved 4 °C i 10 min.
  4. Der tilsættes stationære fasepromastigotes som beskrevet af A. L. Petersen22 i forholdet 10:1 til brøndplader, og centrifuger derefter ved 720 × g i 5 min under 4 °C.
  5. Inkuberes ved 4 °C i 5 min.
  6. Cellerne vaskes to gange med 0,9 % NaCl-opløsning for at fjerne eventuelle ikke-internaliserede promastigotes.
  7. Cellerne anbringes i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
  8. Dækslipsene inkuberes med 15 mM NH4Cl i 15 min ved stuetemperatur.
  9. Tre gange fortyndes med PBS 0,15 % bovint serumalbumin (BSA). Inkuberes med blokerende opløsning (3% BSA i PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Vask tre gange med PBS, og permeabiliseres derefter med 0,15% PBS-Saponin i 15 minutter ved stuetemperatur.
  11. Der tilsættes phalloidin (fortyndet 1:1.200) i 1 time ved stuetemperatur og beskyttes mod lys.
  12. Monter dækslips ved hjælp af monteringsmedier.
  13. Indskaf billeder via et konfokalt fluorescensmikroskop ved hjælp af et 63× / 1.4 mål.

4. Vurdering af Leishmania fagocytose ved makrofager

  1. Frø 2 × 105 THP-1-celler eller humane monocytafledte makrofager i 500 μL komplet RPMI-medium pr. brønd på en 24-brøndplade med 13 mm glasdæksler.
  2. Der dyrkes celler i 24 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
  3. Celler vaskes to gange i 0,9 % NaCl-opløsning, og der inkuberes i komplet RPMI-medium i 24-brønds plade ved 4 °C i 10 min.
  4. Der tilsættes stationær fase Leishmania spp. som beskrevet af A. L. Petersen22 i forholdet 10:1 (parasit:værtscelle), og centrifuger derefter ved 720 × g i 10 min. under 4 °C.
  5. Inkuber celler ved 4 °C i 5 min.
  6. Cellerne vaskes to gange med 0,9 % NaCl-opløsning for at fjerne eventuelle ikke-internaliserede promastigotes.
  7. Cellerne inkuberes i suppleret RPMI-medium ved 37 °C i 1 time.
  8. Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd i 15 min.
  9. Monter dækslips ved hjælp af foretrukne monteringsmedier.
  10. Tæl ikke mindre end 400 celler i tilfældige felter under et fluorescensmikroskop ved hjælp af et 100× / 1,4 mål.

5. Evaluering af Leishmania -induceret vakuolmodning

BEMÆRK: THP-1 celletransfektion skal udføres som beskrevet af M. B. Maess, B. Wittig og S. Lorkowski 23. Her opsummerer vi denne protokol med minimale ændringer. Nukleofection er en specifik transfektionsmetode, der kræver en nukleofector. Som en alternativ metode kan celler transficeret ved hjælp af lipofectamin24 og lentivirustransduktion25.

  1. For at undersøge biogenesen af Leishmania-induceret PV, transfekt THP1 celler med PLC26,27, Akt26,27, Rab 5 28,29,30 eller Rab 7 28,29,31 plasmider.
    BEMÆRK: Denne metode kan bruges til at transfektere THP-1-celler med andre gener end dem, der er anført ovenfor.
  2. Frø THP-1-celler ved 1,5 x 107 i 75 cm² vævskulturkolber indeholdende 10 ml komplet RPMI-medium suppleret med 100 ng / ml PMA og 50 μM 2-mercaptoethanol i 48 timer.
  3. Celler vaskes én gang i 0,9 % NaCl-opløsning.
  4. Løsrive celler ved hjælp af en ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning og centrifuge (250 × g) i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Resuspend THP-1 celler i 1 ml RPMI-medium og udfør tællinger i et Neubauer-kammer.
  6. THP-1-celler centrifugeres igen ved 250 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
  7. Resuspend 2 × 106 celler i 100 μL Nucleofector-opløsning og inkuber med 0,5 μg af plasmidet, der koder for proteinet af interesse, mærket med et fluorescerende protein.
  8. Suspensionen indeholdende THP-1-celler og nukleinsyre overføres til Nukleofector-kuvetten.
  9. Transfekt THP1 celler ved hjælp af Nucleofector Program Y-001.
  10. De transinficerede celler (2x106) genvindes, og frøet i 500 μL RPMI-medium på 24-brønds plader med 13 mm glasdæksler (4 brønde/transfektion).
  11. THP-1-celler inkuberes i komplet RPMI-medium ved 37 °C i 0,5, 2, 4, 6, 12 og 24 timer.
  12. Gentag trin 3.13 og 3.13.

6. Evaluering af rekrutteringen af LC3 til Leishmania spp.

BEMÆRK: Den autofagiske membranmarkør LC3 kan bruges til at undersøge, om fagosomer præsenterer autofagiske træk. LC3-rekruttering til Leishmania-inducerede PV'er kan vurderes under infektion med immunolabelling-celler med anti-LC3-antistoffet, som tidligere beskrevet af C. Matte32 og B. R. S. Dias33.

  1. Frø 2 × 105 THP-1 celler eller humane monocytafledte makrofager i 500 μL komplet RPMI-medium på en 24-brøndplade med 13 mm glasdæksler.
  2. Der dyrkes celler i 24 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
  3. Celler vaskes to gange i 0,9 % NaCl-opløsning, og der inkuberes i komplet RPMI-medium.
  4. Tilsæt stationære fase Leishmania spp. promastigotes som beskrevet af A. L. Petersen22 ved et 10: 1 (parasit: værtsceller) forhold og centrifuge celler ved 720 × g i 5 min under 4 ° C.
  5. Inkuberes ved 37 °C i 30 min eller 4 timer. Vask derefter to gange og fastgør cellerne for at evaluere LC3-rekrutteringen til Leishmania-inducerede PV-membraner i de tidlige stadier af infektion.
    1. Alternativt, for at vurdere LC3-rekruttering til PV-membraner i senere stadier af infektion, vask to gange en anden makrofaggruppe ved 4 timers infektion for at fjerne eventuelle ikke-internaliserede promastigotes. Inkuber inficerede celler i komplet RPMI-medium i yderligere 12 timer og 24 timer for til sidst at vaske to gange og rette.
      BEMÆRK: Faste celler kan opbevares i PBS eller 0,9% NaCl-opløsning ved 4 °C indtil mærkning.
  6. Bloker og permeabiliser samtidig de faste celler i 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalt gedeserum, 6% fedtfri tørmælk og 50% FBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
  7. Cellerne inkuberes med anti-LC3-antistof (1: 200) fortyndet i PBS i 2 timer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Som en negativ kontrol af immunostaining bør en gruppe celler inkuberes med immunoglobulin G (IgG) fra dyret med primær antistofoprindelse i en koncentration svarende til den, der anvendes til det primære antistof.
  8. Cellerne vaskes tre gange med 0,9% NaCl opløsning ved stuetemperatur.
  9. Inkuber cellerne med AlexaFluor 488-konjugeret gede-anti-kanin IgG (1:500) eller de foretrukne fluorescerende farvestofkonjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Cellerne vaskes tre gange med 0,9% NaCl opløsning ved stuetemperatur.
  11. Monter dækslips ved hjælp af foretrukne monteringsmedier.
  12. Få billeder via konfokal fluorescensmikroskop ved hjælp af et 63x / 1.4 mål.

7. Erhvervelse af konfokal mikroskopi og Fiji-kvantificering

BEMÆRK: Erhvervelse af immunfluorescensbilleder skal udføres ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop. For at opnå en bedre opløsning skal du bruge en olie-nedsænkning 63x objektiv linse.

  1. Lad 13 mm glasovertrækket stå ved stuetemperatur og beskyt dem mod lyset mindst 30 minutter før anskaffelsen.
  2. Rengør dækslerne med et absorberende væv.
  3. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie til målet, og tilsæt diaset.
  4. Flyt målet op, indtil olien rører ved diaset.
  5. Observer og juster fokus på mikroskopet og vælg indstillingen 63x mål med olie.
  6. Åbn Leica-programmet, og juster laserne i bølgelængderne 488, 552 og 405.
  7. Vælg billedopløsningen 1.024 x 1.024.
  8. Klik på Live-knappen , indstil Z-stakken, og tryk på Indstillingen Begynd . Gør det derefter igen, og tryk på knappen Afslut . Vi anbefaler 20 μm til skivetykkelse for at få konfokale billeder med gode opløsninger.
  9. Vent på billedoptagelsen, og vælg derefter indstillingen "Maksimal projektion" i Leica-værktøjerne.
  10. Gem eksperimentet.
  11. Eksporter billederne i lif- eller tiff-format til en computer, og åbn FIJI-programmet.
  12. Åbn eksperimentet, og indstil visningsstakken med hyperstakken. Vælg derefter åbne filer individuelt og søm fliser.
  13. Vælg værktøjet med frie hænder på Fiji-værktøjslinjen, og spor cellen omhyggeligt i hånden.
  14. Tryk på knappen Analysér , og mål for at visualisere fluorescensintensiteten.
  15. Gentag denne proces i hver celle pr. gruppe.
  16. Gem målingerne, og eksporter dem til en regnearkeditor.
  17. Føj disse data til et statistisk analyseprogram, og udfør den statistiske analyse.

8. Statistisk analyse

BEMÆRK: Til dataanalyse og grafik skal du bruge et statistisk analyseprogram.

  1. Åbn programmet.
  2. Indsæt de opnåede data og test normalitetsparametrene.
  3. For data med normalfordeling skal du bruge Student t-testen og til ikke-parametriske tests, Mann-Whitney-testen.
  4. Overvej data med en statistisk signifikant forskel, når p-værdien er mindre end 0,05.
  5. Forbered grafik, der repræsenterer dataene, med centrale tendensmål (middelværdi eller median) og variationsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne rapport har til formål at evaluere de tidlige hændelser, der forekommer under fagocytose af L. braziliensis isoleret fra patienter, der præsenterer L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL form af CL. Ved hjælp af konfokal mikroskopi undersøgte vi de vigtigste begivenheder forbundet med parasitters fagocytose: binding, internalisering og fagosommodning. Vi evaluerede først L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL binding og fagocytose af humane monocytafledte makrofager. Dataene viser, at både L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL ligeledes binder sig til makrofager (figur 1). Der blev heller ikke observeret forskelle med hensyn til L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL fagocytose af værtsceller (figur 2). Endelig sammenlignede vi rekrutteringen af LC3 med PV'erne induceret af L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i inficerede celler. Efter 30 min, 4 og 12 timers infektion observerede vi lignende procentdele af LC3-dekorerede PV'er i L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL-inficerede makrofager (figur 3). Disse repræsentative resultater viste, at L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL ligeledes interagerer med makrofager under binding, fagocytose og biogenese af PV'er vedrørende LC3-rekrutteringen.

Mikroskopiske billeder, der repræsenterer THP-1-celler effektivt transficeret med PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP plasmider, er vist i figur 4.

Figure 1
Figur 1. Evaluering af L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL binding til humane makrofager. Humane monocytafledte makrofager blev inficeret med L. braziliensis-LCL- eller L. braziliensis-DL. Efter 10 minutter ved 4 °C blev bindingen vurderet ved konfokal mikroskopi. (A) Konfokale mikroskopibilleder af L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL (mærket med CMTPX, rød), der binder til makrofager (mærket med phalloidin, grøn). Til konfokal mikroskopi blev cellekerner mærket med DAPI (blå). Pile viser Leishmania-makrofagbinding. (B) Procentdel af Leishmania , der binder sig til makrofagerne. I alt 30 celler pr. gruppe blev analyseret. Data repræsenterer hver replikat af et eksperiment udført i femdobbelt (uparret t-test , p > 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Evaluering af L. braziliensis-LCL og L. braziliensis-DL fagocytose af humane makrofager. Humane monocytafledte makrofager blev inkuberet med L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i 10 minutter ved 4 °C efterfulgt af yderligere 1 time ved 37 °C. Celler blev derefter analyseret ved fluorescensmikroskopi ved at tælle i alt 400 celler. (A) Konfokale mikroskopibilleder af humane makrofager inficeret med L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL. Til konfokal mikroskopi blev cellekerner mærket med DAPI (blå). Pile skildrer Leishmania parasitter kerner. (B) Procentdel af Leishmania fagocytose. Cirkler repræsenterer data fra hver replikat af et eksperiment udført i tre eksemplarer (ikke-parret t-test , p > 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Vurdering af LC3-rekruttering til PV'er induceret af L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i makrofager. Humane monocytafledte makrofager blev inficeret og derefter farvet med anti-LC3-antistof i 30 minutter, 4 og 12 timer. (A) Konfokale mikroskopibilleder af L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-inficerede makrofager mærket med anti-LC3 efterfulgt af det sekundære antikanin IgG-antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 (grøn). Til konfokal mikroskopi blev cellekerner mærket med DAPI (blå); (B) Procentdel af L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-inducerede PV'er dekoreret med LC3-II. I alt 30 celler pr. gruppe blev analyseret. Cirklerne svarer til hvert tilfældigt valgt felt analyseret (ikke-parret t-test , p > 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. THP-1-celler, der udtrykker PLC, Rab5 eller Rab7. Efter differentiering i makrofager blev THP-1-celler udsat for nukleofsektion med hvert gen af interesse koblet til GFP-fluorescerende sonder: PLC, Rab5 og Rab7. Efterfølgende blev disse celler fikseret, fik kernen farvet med DAPI (blå) og blev observeret under et konfokalt mikroskop ved hjælp af et 63x / 1,4 mål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Leishmania-makrofaginteraktion er en kompleks proces og involverer flere trin, der kan påvirke sygdomsudvikling5. For bedre at forstå de mekanismer, der er involveret i interaktionen mellem uponiserede Leishmania og værtsceller, har vi beskrevet en protokol, der anvender konfokal fluorescensmikroskopi til at vurdere fagocytose fra tidlige til sene stadier af Leishmania-infektion . Anvendelsen af fluorescensteknikker, der involverer to eller flere fluoroforer til at undersøge cellebiologiske mekanismer, herunder immunomærkning og ekspression af fluorescerende mærkede proteiner, giver os mulighed for at analysere placeringen af flere proteiner samt samtidig evaluere cellemorfologi. Fordelene ved disse metoder gør dem til de bedste værktøjer til at overvåge patogen-værtscelleinteraktion34.

For bedre at forstå den fagocytiske proces, der involverer forskellige partikler, er det afgørende at analysere denne meget dynamiske proces på molekylært niveau35. Konfokal-fluorescensmikroskopi er blevet brugt i årtier til dette formål og har vist sig at være et glimrende værktøj til kvantificering af fagocytose gennem bestemmelse af antallet af internaliserede partikler eller de typer proteiner, der vides at være involveret i tidlige stadier af værtspatogeninteraktion34. Den nuværende undersøgelse foreslog anvendelse af konfokal mikroskopi til at analysere hændelser, der forekommer under fagocytose af L. braziliensis isoleret fra patienter med forskellige kliniske former (LCL og DL). Denne teknik gør det muligt for os at studere celler, der udtrykker specifikke fluorescerende proteiner, herunder PLC, Akt, Rab 5 og Rab 7, og efterfølgende evaluere disse proteiners deltagelse i fagocytose af Leishmania-isolater for at identificere elementer, der er relevante for forskellige infektionsresultater.

Den nuværende undersøgelse anvendte primære makrofager og THP1-celler til at vurdere L. braziliensis fagocytose i tidlige stadier af infektion. Den nuværende beskrevne protokol kan også bruges til at studere fagocytose i Leishmania spp. af andre fagocytter, herunder dendritiske celler, monocytter, makrofagcellelinjer og neutrofiler afledt af humant perifert blod. Under parasitinternaliseringsprocessen forekommer en dynamisk ændring i F-actin ved cellemembranoverfladen11. Vi mærkede derefter proteiner placeret i cellemembranen ved hjælp af en specifik markør for fagocytose36, såsom fluorescerende PLC, som gjorde det muligt for os at observere bindingstrinnet af Leishmania til værtsceller, som vist i figur 4. Farvning af parasitter med fluorescerende markører, såsom CMTPX eller CSFE, er også afgørende for at vurdere parasitbinding til værtsceller ved immunfluorescens. Det er værd at bemærke, at dette assay kræver omhyggelig udførelse: i) vask dæksler forsigtigt ved hjælp af vaskeopløsninger ved stuetemperatur (25 ° C), ellers kan prøver blive beskadiget; ii) forberede reagensfortyndinger præcist; og iii) beskytte prøverne mod lys34.

Et konfokalt mikroskop konfigureret til den optimale laserspændingsbølgelængde er i stand til at opnå et prøvebillede af høj kvalitet. Mærkede celler kan opbevares i ugevis i mørke ved 4 °C eller fryses indtil analysetidspunktet. Anvendelsen af konfokal mikroskopi til evaluering af fagocytose er begrænset af lange eksponeringstider og laserstråler med høj intensitet, som kan beskadige prøver og i nogle tilfælde føre til høje niveauer af baggrundsdetektion på billeder 35,37.

I den nuværende undersøgelse, i stedet for at bruge levende billeddannelse til at følge fagocytose af Leishmania spp., udførte vi en kinetisk undersøgelse ved at fiksere celler på flere tidlige infektionstidspunkter (30 min, 4 timer og 12 timer). Det må overvejes, at levende billeddannelse giver nogle fordele, såsom potentialet til at analysere den rumlige og tidsmæssige dynamik i utallige cellulære processer, herunder fagocytose, og fange detaljer, der ikke kan observeres i statiske billeder34. Imidlertid kræver levende billeddannelse, at celler er sunde gennem hele forsøgsprocessen, herunder kontrol af temperatur, pH og iltforhold i et mikroskopisk kammer. Det er vigtigt at bemærke, at dette ikke kan udføres pålideligt på flere laboratorier rundt om i verden.

Den beskrevne nukleofsektionsprotokol har vist effekt i transfektionen af THP-1-celler, som tidligere rapporteret af M. B. Maess, B. Wittig og S. Lorkowski 23. I denne proces er det afgørende at forsigtigt løsne celler for at undgå celleskader eller tab i cellelevedygtighed. Baseret på vores erfaring anbefaler vi at bruge en ikke-enzymatisk celledissociationsløsning til at løsne celler fra plader inden udførelse af transfektion. Forfatterne af den oprindelige protokol23 angiver, at de vigtigste begrænsninger ved denne procedure er behovet for, at celler er i suspension under nukleofsektionsprocessen, og det faktum, at utilstrækkelig løsrivelse kan forårsage stress. På trods af disse begrænsninger giver protokollen mulighed for pålidelig transfektion og når en 90% vellykket transfektionshastighed uden at miste cellelevedygtighed.

Karakteriseringen af PV'er ved hjælp af et sæt endocytiske markører, herunder PLC, Akt, Rab5 og Rab7, er afgørende for at forbedre vores forståelse af Leishmania fagocytose. Identifikation af nye proteiner, der deltager i PV-biogenese og omfattende karakterisering af disse rum, kan afklare forskelle i makrofagrespons under Leishmania spp. infektion. Bidraget fra vores resultater til viden om Leishmania-infektionsresultatet vil utvivlsomt fremme vores forståelse af patogenesen af Leishmania-infektion og understøtte den eventuelle søgning efter nye kemoterapeutiske mål. Det er værd at bemærke, at denne teknik også kan udvides til andre typer undersøgelser, herunder infektion med bakterier, gær eller perleopslugning af mange typer celler38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling eller analyse, beslutningen om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet. Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brasilien og afdelingen for mikroskopi for hjælp. Dette arbejde blev støttet af INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. har en bevilling til produktivitet i forskning fra CNPq (305235/2019-2). Plasmider blev venligst leveret af Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Forfatterne vil gerne takke Andris K. Walter for engelsk oversættelse og hjælp til kopiering af manuskripter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Tags

Immunologi og infektion udgave 173
Undersøgelse af fagocytose af <em>Leishmania</em> ved hjælp af konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paixão, A. R., Dias, B. R. S.,… More

Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter