Summary
Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.
Abstract
Phagocytosis는 뚜렷한 단계를 포함하는 오케스트레이션 된 과정입니다 : 인식, 결합 및 내면화. 전문 식세포는 식균작용에 의해 Leishmania 기생충을 흡수하며, 여러 숙주 세포 수용체에 의해 기생충 표면의 리간드를 인식하는 것으로 구성됩니다. 대식세포막에 대한 리슈마니아 의 결합은 보체 수용체 유형 1 (CR1) 및 보체 수용체 유형 3 (CR3) 및 패턴 인식 수용체를 통해 발생한다. 리포포스포글리칸(LPG)과 63kDa 당단백질(gp63)은 대식세포-리슈마니아 상호작용에 관여하는 주요 리간드이다. 숙주 세포 수용체에 의한 기생충 리간드의 초기 인식에 따라, 기생충은 기생충 액포 내에서 내재화되고, 생존하고, 증식합니다. 리슈마니아-유도된 액포의 성숙 과정은 단량체성 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7, 리소좀 관련 막 단백질 1 (LAMP-1), 리소좀 관련 막 단백질 2 (LAMP-2), 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3 (LC3)을 포함하는 세포 내 소포로부터 분자의 획득을 포함한다.
여기에서, 우리는 공초점 현미경을 사용하여 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명하는데, 여기에는 (i) 결합 (ii) 내재화 및 (iii) 식세포 성숙이 포함된다. 감염 결과의 이러한 결정 요인을 둘러싼 지식의 본문에 추가함으로써, 우리는 리슈 마니아 감염의 병인에 대한 이해를 향상시키고 새로운 화학 요법 표적에 대한 최종 검색을 지원하기를 희망합니다.
Introduction
Leishmaniasis는 Leishmania 속의 원생 동물 기생충에 의해 야기 된 방치 된 열대 질환으로, 피부 리슈 마니아증, 점막 피부 리슈 마니아증 및 내장 리슈 마니아증1을 포함하여 척추 동물 숙주에서 광범위한 임상 증상을 나타냅니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10 억 명이 넘는 사람들이 위험에 처해 있으며 연간 백만 건 이상의 새로운 사례가보고되고있다고 추정합니다 2.
Leishmania spp.는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한 숙주 세포 내에서 생존하는 의무적 인 세포 내 원생 동물입니다3. 리슈마니아-대식세포 상호작용은 직접적인 상호작용을 통해 또는 보체 수용체 4,5를 수반하는 옵소닌화에 의해 다수의 숙주 세포 수용체 및 기생충 리간드를 포함하는 복잡한 과정이다. 고전적 표면 수용체, 예컨대 CR1, CR3, 만노스-푸코스, 피브로넥틴, 톨-유사 및 스캐 빈저 수용체는 대식세포 6,7,8에 대한 기생충 부착을 매개한다. 이 수용체는 63 kDa 당단백질 (gp63) 및 당지질 리포스포글리칸 (LPG)9을 포함하여 리슈마니아의 표면에있는 분자를 인식합니다. 이들은 프로마스티고테스의 표면에서 가장 풍부한 분자이며, 숙주 면역 반응의 전복에 필수적인 역할을 하며, 포유동물 세포(10)에서 기생충 감염의 확립을 선호한다. 기생충 표면 리간드가 대식세포 수용체에 결합한 후, F-액틴은 포유류 세포 표면에 축적되어 기생충을 둘러싸고 식균작용을 한다. 이어서, 이것은 기생충-유도된 구획의 형성으로 이어지고, 이는 식리소좀 특징(11)을 제시한다. 일단 이러한 식세포 내부에 들어가면, 기생충은 생존과 증식에 필수적인 몇 가지 변화를 겪습니다3.
PVs의 생물발생은 이 병원체(12)의 세포내 생존에 매우 중요한 고도로 조절된 막 밀매 과정이다. 이 구획의 형성은 숙주 내시성 경로의 식세포와 구획 사이의 순차적 융합 사건으로부터 초래된다. 고전적 세포 생물학 연구에 따르면 PV의 성숙은 단량체 G 단백질 Rab 5 및 Rab 7 단백질의 획득을 포함하며, 이는 주로 초기 및 후기 엔도솜 성숙과 관련이 있습니다13. 또한, 이들 구획은 리소좀 관련 막 단백질 1 및 2 (LAMP 1, LAMP 2), 리소좀 막 및 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3 (LC3), 오토파고좀 마커14의 주요 단백질 구성성분을 획득한다. 명백한 유사성에도 불구하고, PV 형성15,16의 동역학과 이들 구획의 형태학은 리슈마니아 종에 따라 다양하다. 예를 들어, L. mexicana 또는 L. amazonensis에 의한 감염은 많은 수의 기생충(17)을 함유하는 큰 구획의 형성을 유도한다. 대조적으로, L. braziliensis 및 L. infantum과 같은 다른 종은 일반적으로 각 액포(18)에 하나 또는 두 개의 기생충 만 포함하는 더 작은 액포를 형성합니다.
숙주 세포-리슈마니아 상호작용을 둘러싼 이러한 지식에도 불구하고, 숙주 수용체와 기생충 리간드 사이의 접촉에 의해 촉발된 초기 사건은 완전히 해명되지 않았다. 이러한 사건은 기생충 감염의 결과의 결정 요인으로 알려져 있으며 기생충 종, 기생충을 인식하기 위해 모집 된 숙주 세포 수용체의 유형 및 대식세포 신호 전달 경로의 활성화19,20에 의존합니다. 따라서 리슈마니아로 유도된 PV의 생물발생에 관여하는 분자를 확인하고 감염 확립 및 결과에서 이들 분자가 수행하는 역할을 결정하는 것이 필수적이다. 여기에서, 우리는 결합, 내재화, 식기 형성 및 성숙을 포함하여 Leishmania의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 PLC, Akt, Rab5, Rab7 및 LC3가 다른 리슈마니아 종에 의해 유도 된 PV의 형성에 참여하는 것을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 PV 성숙에 관여하는 다른 단백질의 참여를 조사하는데 사용될 수 있다. 미래의 연구는 Leishmania-host cell 상호 작용에 관련된 메커니즘을 둘러싼 지식을 확장하고 새로운 화학 요법 전략의 설계에 기여할 것입니다.
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Protocol
세포는 국가 연구 윤리위원회 (ID : 94648218.8.0000.0040)의 절차 승인에 따라 건강한 기증자로부터 얻어졌다.
1. 세포 배양
- 인간 단핵구 유래 대식세포
참고: 시험관 내에서 대식세포로의 분화를 위한 인간 단핵구 유래 대식세포를 수득하려면, 건강한 기증자로부터 혈액을 수집하고 D. English 및 B. R. Andersen21에 의해 기술된 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 정제한다.- 말초혈액(50 mL)을 채취한 후, 이를 헤파린화된 튜브에 붓고 실온에서 인산완충용액(PBS)에 혈액을 1:1로 희석하였다. 희석된 헤파린화된 혈액을 이전에 분포된 밀도 구배 매질의 상부에 부드럽게 놓는다.
- 용혈을 피하기 위해 튜브를 24°C에서 30분 동안 252 × g 에서 원심분리한다.
참고: 그라디언트 층이 혼합되지 않도록 원심분리기 브레이크오프를 설정하십시오. 원심분리 후, 불연속 구배층이 바닥에서 상부로 형성된다: 적혈구, 밀도 구배 배지, PBMC 고리 및 혈장. - 밀도 구배 매질과 플라즈마 층 사이에 위치한 PBMC 고리를 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 채워 과밀도 구배 배지를 씻어낸다.
- 세포를 1회 세척하고 4°C에서 10분 동안 190 × g에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 펠렛을 완전한 RPMI 배지 1 mL에 재현탁시킨다.
- 25 mM N-×[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산](HEPES), 2 g/L 중탄산나트륨, 2 mM 글루타민, 20 g/mL 시프로플록사신 및 10% 불활성화된 태아 소 혈청(FBS)(완전 RPMI 배지)이 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 500 mL의 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI)의 500 mL에 세포와 플레이트 2 및 플레이트2를 계수하여 단핵구가 대식세포로 분화될 수 있도록 한다. 접착에 의하여.
- THP-1 문화
- THP-1 세포주를75 cm2 배양 플라스크에서 완전한 RPMI 배지 10 mL에2 × 10 5 세포의 농도로 성장시킨다.
- 세포 배양물을 5%CO2 하에 37°C의 인큐베이터에서 7일 동안 유지한다.
- 세포를 4°C에서 10분 동안 720 × g에서 원심분리하고, 펠렛을 완전한 RPMI 배지에 재현탁시켰다.
- 노이바우어 챔버에서 세포를 세십시오.
- 플레이트 세포를 13 mm 유리 커버슬립 상에서5 % CO×2 하에 37°C에서 100 nM 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 함유하는 완전한 RPMI 배지 500 μL에서 웰당2 내지 10 5 세포의 농도로 THP1 세포를 대식세포로 분화시킬 수 있게 한다.
- 사흘 후, 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 PMA를 함유하는 배지를 제거하였다.
- 분화된 THP-1 세포를 실험 시작 전에 추가로 2일 동안 5%CO2 하에 37°C에서 PMA가 없는 완전 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
2. 기생충 배양 및 셀트래커 레드 염색
참고: 형광 현미경을 통해 기생충을 시각화하려면 CellTracker Red 형광 염료(CMTPX)를 사용하여 염색을 수행하십시오. 대안적으로, 카르복시플루오레세인을 포함하는 다른 마커는 GFP, RFP, 또는 다른 형광 리포터 유전자를 구성적으로 발현하는 제조자 지시 또는 프로마스티고트에 따라 사용될 수 있다. 세포를 감염시키는 데 사용되는 기생충은 7 계대 이하의 프로마스티고트 축삭 배양물로부터 얻은 성장의 정지 단계에 있는 것들이다.
- 리슈마니아 spp를 성장시키세요. 50 μg/mL 겐타미신과 10% FBS로 보충된 슈나이더 배지 5 mL를 함유하는 세포 배양 플라스크에서 배지 1,000 μL 당 1 x 10 5 기생충에 있는 프로마티고트.
- 기생충 축삭 배양물을 24°C에서 생화학적 산소 요구량(B.O.D.)에서 배양한 후, 노이바우어 챔버에서 매일 계수를 수행한다. 5 일 동안 기생충 형태 (얇고 길다)와 이동성을 확인하십시오. 기생충은 8 시간의 간격으로 두 개의 연속 카운트가 비슷한 양을 표시 할 때 성장의 고정 단계에서 고려됩니다.
- 성장의 정지기에 도달하면, 기생충을 빛과의 접촉을 피한 5%CO2 하에 37°C에서 15분 동안 1 μM CMTPX와 함께 0.9% NaCl 용액 4 mL에 인큐베이션한다.
- FBS를 1:1 비율로 추가하고 기생충 현탁액을 추가로 1 분 동안 배양하십시오.
- 기생충을 PBS로 세 번 세척하고, 1,781 × g에서 10분 동안 원심분리하였다.
- 기생충 펠릿을 1,000 μL의 RPMI 완전 배지에 재현탁시킨다.
- 노이바우어 챔버에서 기생충을 계산하십시오.
3. 대식세포에 대한 리슈마니아 결합의 평가
- 시드 2 × 105 THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 웰 당 500 μL의 완전한 RPMI 배지 중이다.
- 세포를 37°C에서5% CO2 하에 24 시간 동안 배양한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고 10분 동안 4°C에서 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
- A. L. Petersen22 에 의해 기술된 바와 같은 고정상상 프로마스티고트를 웰 플레이트에 10:1 비율로 첨가한 다음, 4°C 하에 5분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
- 4°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로유방을 제거한다.
- 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정시킨다.
- 커버슬립을 실온에서 15분 동안 15 mMNH4Cl로 인큐베이션한다.
- PBS 0.15% 소 혈청 알부민(BSA)으로 세 번 세척한다. 블로킹 용액 (PBS 중 3% BSA)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- PBS로 세 번 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 0.15% PBS-사포닌으로 투과시킨다.
- 실온에서 1 시간 동안 phalloidin (희석 된 1:1,200)을 추가하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
- 63×/1.4 목표를 사용하여 공초점 형광 현미경을 통해 이미지를 획득합니다.
4. 대식세포에 의한 리슈마니아 식작용의 평가
- 시드 2 × 105 THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 웰 당 500 μL의 완전한 RPMI 배지 중이다.
- 세포를 5% CO2 하에 37°C에서24시간 동안 배양한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고, 10분 동안 4°C에서 24-웰 플레이트의 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
- A. L. Petersen22에 의해 기술된 바와 같이 고정상인 Leishmania spp.를 10:1 (기생충:숙주 세포) 비율로 첨가하고, 이어서 4°C 하에 10분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
- 세포를 4°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하여 내재화되지 않은 프로유방을 제거한다.
- 세포를 보충된 RPMI 배지에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오.
- 선호하는 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
- 100×/1.4 목표를 사용하여 형광 현미경으로 무작위 필드에서 400개 이상의 세포를 계수합니다.
5. 리슈마니아 -유도된 액포 성숙의 평가
참고: THP-1 세포 형질감염은 M. B. Maess, B. Wittig 및 S. Lorkowski 23에 의해 기술된 바와 같이 수행되어야 한다. 여기서는 최소한의 수정으로이 프로토콜을 요약합니다. 핵형성은 핵형성자를 필요로 하는 특정 형질감염 방법이다. 대안적인 방법으로서, 세포는 리포펙타민24 및 렌티바이러스 형질도입25를 사용하여 형질감염될 수 있다.
- 리슈마니아-유도된 PV의 생물발생을 조사하기 위해, THP1 세포를 PLC 26,27, Akt26,27, Rab 5 28,29,30 또는 Rab 728,29,31 플라스미드로 형질감염시켰다.
참고: 이 방법론은 THP-1 세포를 상기 열거된 유전자 이외의 다른 유전자로 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. - THP-1 세포를 1.5 x 107 에서 48시간 동안 100 ng/mL PMA 및 50 μM 2-메르캅토에탄올로 보충된 10 mL 완전 RPMI 배지를 함유하는 75 cm² 조직 배양 플라스크에 48시간 동안 시드한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 한 번 세척한다.
- 비효소적 세포 해리 용액 및 실온에서 5분 동안 원심분리기(250 × g)를 사용하여 세포를 분리한다.
- THP-1 세포를 RPMI 배지 1 mL에 재현탁하고 노이바우어 챔버에서 카운트를 수행한다.
- THP-1 세포를 실온에서 10분 동안 다시 250 × g에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 2 × 106 세포를 100 μL의 Nucleofector 용액에 재현탁시키고, 형광 단백질로 태그된 관심있는 단백질을 암호화하는 플라스미드 0.5 μg과 함께 인큐베이션한다.
- THP-1 세포 및 핵산을 함유하는 현탁액을 뉴클레오펙터 큐벳으로 옮긴다.
- 뉴클레오펙터 프로그램 Y-001을 사용하여 THP1 세포를 형질감염시킨다.
- 형질감염된 세포(2x106)를 회수하고 13mm 유리 커버슬립(4웰/형질감염)이 있는 24웰 플레이트의 500μL RPMI 배지에 시드하십시오.
- THP-1 세포를 완전한 RPMI 배지에서 37°C에서 0.5, 2, 4, 6, 12 및 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 3.13단계와 3.13단계를 반복합니다.
6. LC3를 리슈마니아 spp. PV에 채용한 평가
참고: 자가포식 막 마커 LC3는 식세포가 자가포식 특징을 나타내는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 라이슈마니아-유도된 PVs에 대한 LC3 모집은 C. Matte32 및 B. R. S.Dias 33에 의해 이전에 기술된 바와 같이, 항-LC3 항체를 사용한 면역표지 세포에 의한 감염 동안 평가될 수 있다.
- 시드 2 × 105 THP-1 세포 또는 인간 단핵구 유래 대식세포를 13 mm 유리 커버슬립이 있는 24-웰 플레이트 상의 500 μL 완전 RPMI 배지에 함유하였다.
- 세포를 5% CO2 하에 37°C에서24시간 동안 배양한다.
- 세포를 0.9% NaCl 용액으로 두 번 세척하고 완전한 RPMI 배지에서 인큐베이션한다.
- A. L. Petersen22에 의해 기술된 바와 같은 고정상 Leishmania spp. promastigotes를 10:1 (기생충:숙주 세포) 비율로 첨가하고, 세포를 4°C 하에 5분 동안 720 × g에서 원심분리한다.
- 37°C에서 30분 또는 4시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 두 번 세척하고 세포를 고정시켜 감염의 초기 단계에서 리슈마니아 유도 PV 막에 대한 LC3 모집을 평가합니다.
- 대안으로, 감염의 후기 단계에서 PV 막으로의 LC3 모집을 평가하기 위해, 감염의 4 h에서 다른 대식세포 그룹을 두 번 세척하여 임의의 내재화된 프로마스티고트를 제거한다. 감염된 세포를 완전한 RPMI 배지에서 추가로 12시간 및 24시간 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 두 번 세척하고 고정시킨다.
참고: 고정된 세포는 표지될 때까지 4°C에서 PBS 또는 0.9% NaCl 용액에 보관될 수 있다.
- 대안으로, 감염의 후기 단계에서 PV 막으로의 LC3 모집을 평가하기 위해, 감염의 4 h에서 다른 대식세포 그룹을 두 번 세척하여 임의의 내재화된 프로마스티고트를 제거한다. 감염된 세포를 완전한 RPMI 배지에서 추가로 12시간 및 24시간 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 두 번 세척하고 고정시킨다.
- 실온에서 20분 동안 0.1% 트리톤 X-100, 1% BSA, 20% 정상 염소 혈청, 6% 무지방 분유 및 50% FBS에서 고정된 세포를 동시에 차단하고 투과시킨다.
- 세포를 실온에서 2시간 동안 PBS에 희석된 항-LC3 항체 (1:200)로 인큐베이션한다.
참고: 면역염색의 음성 대조군으로서, 세포 그룹은 일차 항체 기원의 동물로부터 면역글로불린 G(IgG)와 함께 일차 항체에 사용된 것과 동등한 농도로 인큐베이션되어야 한다. - 세포를 실온에서 0.9% NaCl 용액으로 세 번 세척한다.
- 세포를 AlexaFluor 488-접합된 염소 항-토끼 IgG (1:500) 또는 바람직한 형광-염료 접합된 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 실온에서 0.9% NaCl 용액으로 세 번 세척한다.
- 선호하는 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
- 63x/1.4 목표를 사용하여 공초점 형광 현미경을 통해 이미지를 획득합니다.
7. 공초점 현미경 수집 및 피지 정량화
참고: 면역 형광 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 더 나은 해상도에 도달하려면 오일 침지 63x 대물 렌즈를 사용하십시오.
- 13mm 유리 커버슬립을 실온에서 그대로 두고 최소 30분 전에 빛으로부터 보호하십시오.
- 커버 슬립을 흡수성 조직으로 청소하십시오.
- 목표에 침지 오일 한 방울을 추가하고 슬라이드를 추가합니다.
- 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 목표를 위로 움직입니다.
- 현미경의 초점을 관찰하고 조정하고 오일로 63x 목표 옵션을 선택하십시오.
- 라이카 프로그램을 열고 488, 552 및 405 파장에서 레이저를 조정하십시오.
- 이미지 해상도 1,024 x 1,024를 선택합니다.
- 라이브 버튼을 클릭하고 Z 스택을 설정 한 다음 시작 옵션을 누릅니다. 그런 다음 다시 수행하고 끝 버튼을 누릅니다. 좋은 해상도의 공초점 이미지를 얻으려면 슬라이스 두께의 경우 20μm를 사용하는 것이 좋습니다.
- 이미지 획득을 기다린 다음 라이카 도구에서 "최대 투영" 옵션을 선택합니다.
- 실험을 저장합니다.
- lif 또는 tiff 형식 이미지를 컴퓨터로 내보내고 FIJI 프로그램을 엽니다.
- 실험을 열고 하이퍼 스택으로 뷰 스택을 설정합니다. 그런 다음 개별적으로 열린 파일을 선택하고 타일을 스티치하십시오.
- Fiji 도구 모음에서 무료 손 도구를 선택하고 손으로 셀을 신중하게 추적하십시오.
- 분석 버튼을 누르고 측정하여 형광 강도를 시각화합니다.
- 그룹당 각 셀에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 측정값을 저장하고 스프레드시트 편집기로 내보냅니다.
- 이 데이터를 통계 분석 프로그램에 추가하고 통계 분석을 수행하십시오.
8. 통계 분석
참고: 데이터 분석 및 그래픽의 경우 통계 분석 프로그램을 사용하십시오.
- 프로그램을 엽니다.
- 얻은 데이터를 삽입하고 정규성 매개 변수를 테스트합니다.
- 정규 분포가 있는 데이터의 경우 Student t-test를 사용하고 비모수 테스트인 Mann-Whitney 테스트를 사용합니다.
- p-값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 데이터를 고려하십시오.
- 중앙 경향 측정값(평균 또는 중앙값)과 변동 측정값을 사용하여 데이터를 나타내는 그래픽을 준비합니다.
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Representative Results
이 보고서는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 형태의 CL을 제시하는 환자로부터 분리 된 L. braziliensis의 식세포 작용 중에 발생하는 초기 사건을 평가하는 것을 목표로합니다. 공초점 현미경을 사용하여 기생충의 식작용과 관련된 주요 사건 인 결합, 내재화 및 식균 성숙을 조사했습니다. 먼저 인간 단핵구 유래 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL 결합 및 식작용을 평가하였다. 데이터는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 둘 다 대식세포에 유사하게 결합한다는 것을 보여준다(그림 1). 또한, 숙주 세포에 의한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 식작용에 관해서는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 2). 마지막으로, LC3의 모집을 감염된 세포에서 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 유도된 PVs와 비교하였다. 감염의 30분, 4 및 12시간 후에, 우리는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL-감염 대식세포에서 LC3 장식된 PVs의 유사한 백분율을 관찰하였다(도 3). 이들 대표적인 결과는 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL이 LC3 모집과 관련하여 PVs의 결합, 식작용 및 생물발생 동안 대식세포와 유사하게 상호작용한다는 것을 보여주었다.
PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP 플라스미드로 효율적으로 형질감염된 THP-1 세포를 나타내는 현미경 이미지는 도 4에 나타내었다.
그림 1. 인간 대식세포에 대한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 결합의 평가. 인간 단핵구-유래 대식세포는 L. braziliensis-LCL- 또는 L. braziliensis-DL에 감염되었다. 4°C에서 10분 후, 결합을 공초점 현미경으로 평가하였다. (A) 대식세포에 결합하는 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL (CMTPX, 빨간색으로 표지됨)의 공초점 현미경 이미지(phalloidin, green으로 표지됨). 공초점 현미경을 위해, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다. 화살표는 리슈마니아-대식세포 결합을 묘사한다. (B) 대식세포에 결합하는 리슈마니아의 비율. 그룹당 총 30개의 세포를 분석하였다. 데이터는 quintuplicate에서 수행된 하나의 실험의 각 복제를 나타낸다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 인간 대식세포에 의한 L. braziliensis-LCL 및 L. braziliensis-DL 식작용의 평가. 인간 단핵구 유래 대식세포를 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL과 함께 4°C에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 37°C에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 형광현미경으로 분석하여 총 400개의 세포를 계수하였다. (A) L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 감염된 인간 대식세포의 공초점 현미경 이미지. 공초점 현미경을 위해, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다. 화살표는 Leishmania 기생충 핵을 묘사합니다. (B) 리슈마니아 식균작용의 백분율. 원은 삼중으로 수행된 하나의 실험의 각 복제로부터의 데이터를 나타낸다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대식세포에서 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL에 의해 유도된 PV에 대한 LC3 모집의 평가. 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염시킨 다음, 30분, 4 및 12시간 동안 항-LC3 항체로 염색하였다. (A) 항-LC3로 표지된 L. braziliensi s-LCL 또는 L. braziliensis-DL-감염된 대식세포의 공초점 현미경 이미지를 이어서 알렉사 플루오르 488(녹색)에 접합된 이차 항토끼 IgG 항체를 수득하였다. 공초점 현미경의 경우, 세포 핵을 DAPI (파란색)로 표지하였다; (B) LC3-II로 장식된 L. braziliensis-LCL 또는 L. braziliensis-DL-induced PV의 백분율. 그룹당 총 30개의 세포를 분석하였다. 원은 분석된 각각의 랜덤하게 선택된 필드에 대응한다(짝을 이루지 않은 t 검정, p > 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. PLC, Rab5 또는 Rab7을 발현하는 THP-1 세포. 대식세포로 분화한 후, THP-1 세포는 GFP 형광 프로브에 결합된 각각의 관심 유전자와 함께 핵형성을 실시하였다: PLC, Rab5 및 Rab7. 이어서, 이들 세포를 고정시키고, DAPI (파란색)로 핵을 염색하고, 63x/1.4 목표를 사용하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
리슈마니아-대식세포 상호작용은 복잡한 과정이며 질병 발생에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 단계를 포함한다5. 비수술화된 리슈마니아와 숙주 세포의 상호작용에 관여하는 메카니즘을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 공초점 형광 현미경을 사용하여 리슈마니아 감염의 초기 단계부터 후기 단계까지 식작용을 평가하는 프로토콜을 기술하였다. 면역 표지 및 형광 표지 단백질의 발현을 포함한 세포 생물학 메커니즘을 조사하기 위해 둘 이상의 형광단을 포함하는 형광 기술을 사용하면 여러 단백질의 위치를 분석하고 세포 형태를 동시에 평가할 수 있습니다. 이들 방법에 의해 제공되는 이점들은 이들을 병원체-숙주 세포 상호작용(34)을 모니터링하기 위한 최상의 도구이다.
서로 다른 입자를 포함하는 식세포 과정을 더 잘 이해하려면 분자 수준35에서이 매우 역동적 인 과정을 분석하는 것이 중요합니다. Confocal-fluorescence microscopy는 이를 위해 수십 년 동안 사용되어 왔으며 내재화 된 입자의 수 또는 숙주 - 병원체 상호 작용의 초기 단계에 관여하는 것으로 알려진 단백질의 유형을 결정함으로써 식작용을 정량화하는 훌륭한 도구 인 것으로 나타났습니다34. 본 연구는 상이한 임상 형태 (LCL 및 DL)를 갖는 환자로부터 분리된 L. braziliensis 의 식작용 동안 발생하는 사건을 분석하기 위해 공초점 현미경의 사용을 제안하였다. 이 기술을 통해 PLC, Akt, Rab 5 및 Rab 7을 포함한 특정 형광 단백질을 발현하는 세포를 연구 한 다음 Leishmania 단리물의 식작용에 이러한 단백질의 참여를 평가하여 다양한 감염 결과와 관련된 요소를 식별 할 수 있습니다.
본 연구는 감염의 초기 단계에서 L. braziliensis 식작용을 평가하기 위해 1 차 대식세포와 THP1 세포를 사용했습니다. 현재 기술된 프로토콜은 또한 수지상 세포, 단핵구, 대식세포 세포주 및 인간 말초 혈액으로부터 유래된 호중구를 포함하는 다른 식세포에 의한 리슈마니아 spp.의 식작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 기생충 내재화 과정 동안, F-액틴의 동적 변화는 세포막 표면(11)에서 발생한다. 그런 다음 형광 PLC와 같은 식작용36의 특정 마커를 사용하여 세포막에 위치한 단백질을 표지하여 도 4에 표시된 것처럼 숙주 세포에 대한 리슈마니아의 결합 단계를 관찰 할 수있었습니다. 기생충을 CMTPX 또는 CSFE와 같은 형광 마커로 염색하는 것은 면역 형광에 의해 숙주 세포에 대한 기생충 결합을 평가하는 데에도 중요합니다. 이 분석은 신중한 실행이 필요하다는 점은 주목할 가치가 있습니다 : i) 실온 (25 °C)에서 세척 용액을 사용하여 부드럽게 커버 슬립을 씻고, 그렇지 않으면 샘플이 손상 될 수 있습니다. ii) 시약 희석액을 정밀하게 제조하고; iii) 빛(34)으로부터 샘플을 보호한다.
최적의 레이저 흥분 파장으로 구성된 공초점 현미경은 고품질의 샘플 이미지를 얻을 수 있습니다. 표지된 세포는 4°C에서 어둠 속에서 몇 주 동안 저장되거나 분석될 때까지 동결될 수 있다. 식작용을 평가하기 위해 공초점 현미경을 사용하는 것은 장시간 노출 시간과 고강도 레이저 빔에 의해 제한되며, 이는 샘플을 손상시킬 수 있으며, 경우에 따라 이미지35,37에서 높은 수준의 배경 검출을 유도합니다.
본 연구에서, Leishmania spp.의 식작용을 추적하기 위해 라이브 이미징을 사용하는 대신, 우리는 감염의 몇 가지 초기 시간 (30 분, 4 시간 및 12 시간)에 세포를 고정시킴으로써 운동 학적 연구를 수행했습니다. 라이브 이미징은 식작용을 포함한 무수한 세포 과정의 공간적 및 시간적 역학을 분석할 수 있는 잠재력과 정적 이미지(34)에서 관찰할 수 없는 세부사항을 캡처하는 가능성과 같은 몇 가지 이점을 제공한다는 점을 고려해야 한다. 그러나 라이브 이미징은 현미경 챔버에서 온도, pH 및 산소 조건을 제어하는 것을 포함하여 전체 실험 과정에서 세포가 건강해야합니다. 이것은 전 세계의 여러 실험실에서 안정적으로 수행 될 수 없다는 점에 유의해야합니다.
기술된 핵형성 프로토콜은 M. B. Maess, B. Wittig 및 S. Lorkowski 23에 의해 이전에 보고된 바와 같이 THP-1 세포의 형질감염에서 효능을 입증하였다. 이 과정에서 세포 손상이나 세포 생존력 손실을 피하기 위해 세포를 부드럽게 분리하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 형질감염을 수행하기 전에 플레이트에서 세포를 분리하기 위해 비 효소 세포 해리 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 원래의 프로토콜23 의 저자들은 이 절차의 주요 한계는 핵형성 과정 동안 세포가 현탁액에 있어야 할 필요성과 부적절한 분리가 스트레스를 유발할 수 있다는 사실이라고 말한다. 이러한 한계에도 불구하고, 프로토콜은 신뢰할 수 있는 형질감염을 허용하며, 세포 생존력을 잃지 않으면서 90%의 성공적인 형질감염률에 도달한다.
PLC, Akt, Rab5 및 Rab7을 포함한 일련의 내시세포 마커를 사용한 PV의 특성화는 리슈마니아 식균작용에 대한 우리의 이해를 향상시키는 데 필수적입니다. PV 생물발생에 참여하는 새로운 단백질을 확인하고 이러한 구획을 종합적으로 특성화하면 Leishmania spp. 감염 동안 대식세포 반응의 차이를 명확히 할 수 있습니다. Leishmania 감염 결과를 둘러싼 지식의 본문에 대한 우리의 결과의 기여는 의심 할 여지없이 Leishmania 감염의 병인에 대한 우리의 이해를 향상시키고 새로운 화학 요법 표적에 대한 최종 검색을 지원할 것입니다. 이 기술은 박테리아, 효모 또는 많은 유형의 세포38,39에 의한 비드 삼킴에 의한 감염을 포함하여 다른 유형의 연구로도 확장 될 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
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Disclosures
기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 또는 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다. 저자들은 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brazil 및 현미경 검사 부서에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 INOVA-FIOCRUZ 번호 79700287000에 의해 지원되었으며, P.S.T.V.는 CNPq (305235/2019-2)의 연구 생산성 보조금을 보유하고 있습니다. 플라스미드는 캘리포니아 토론토 대학교 Mauricio Terebiznik에서 친절하게 제공했습니다. 저자는 Andris K. Walter에게 영어 개정 및 원고 카피 편집 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
