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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.

Abstract

La phagocytose est un processus orchestré qui implique des étapes distinctes : la reconnaissance, la liaison et l’internalisation. Les phagocytes professionnels absorbent les parasites Leishmania par phagocytose, consistant à reconnaître les ligands sur les surfaces des parasites par de multiples récepteurs de cellules hôtes. La liaison de Leishmania aux membranes des macrophages se produit par le récepteur du complément de type 1 (CR1) et le récepteur du complément de type 3 (CR3) et les récepteurs de reconnaissance de formes. Le lipophosphoglycane (LPG) et la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) sont les principaux ligands impliqués dans les interactions macrophage-leishmania . Après la reconnaissance initiale des ligands du parasite par les récepteurs de la cellule hôte, les parasites deviennent intériorisés, survivent et se multiplient dans les vacuoles parasitophres. Le processus de maturation des vacuoles induites par Leishmania implique l’acquisition de molécules à partir de vésicules intracellulaires, y compris la protéine G monomère Rab 5 et Rab 7, la protéine membranaire associée lysosomale 1 (LAMP-1), la protéine membranaire associée lysosomale 2 (LAMP-2) et la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (CL3).

Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes en utilisant la microscopie confocale, y compris (i) la liaison (ii) l’internalisation et (iii) la maturation du phagosome. En ajoutant à l’ensemble des connaissances entourant ces déterminants de l’issue de l’infection, nous espérons améliorer la compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutenir la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques.

Introduction

La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale1. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année2.

Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes, y compris les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques3. L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs récepteurs de cellules hôtes et ligands parasitaires soit par interaction directe, soit par opsonisation impliquant les récepteurs du complément 4,5. Les récepteurs de surface classiques, tels que CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, récepteurs de type Toll et charognards, interviennent dans la fixation du parasite aux macrophages 6,7,8. Ces récepteurs reconnaissent les molécules à la surface de Leishmania, notamment la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) et le lipophosphoglycane glycolipidique (GPL)9. Ce sont les molécules les plus abondantes à la surface des promastigotes et jouent un rôle essentiel dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’établissement d’une infection parasitaire dans les cellules demammifères10. Une fois que les ligands de surface du parasite se lient aux récepteurs des macrophages, la F-actine s’accumule sur les surfaces cellulaires des mammifères, entourant les parasites au fur et à mesure qu’ils sont phagocytés. Par la suite, cela conduit à la formation d’un compartiment induit par le parasite appelé vacuole parasiphore (PV), qui présente des caractéristiques phagolysosomales11. Une fois à l’intérieur de ces phagolysosomes, les parasites subissent plusieurs altérations essentielles à la survie et à lamultiplication3.

La biogenèse des PV est un processus de trafic membranaire hautement réglementé essentiel à la survie intracellulaire de cet agent pathogène12. La formation de ce compartiment résulte d’événements de fusion séquentielle entre les phagosomes et les compartiments de la voie endocytaire de l’hôte. Des études classiques de biologie cellulaire ont révélé que la maturation des PV implique l’acquisition de protéines G monomères Rab 5 et Rab 7, qui sont principalement associées à une maturation précoce et tardive des endosomes, respectivement13. De plus, ces compartiments acquièrent les protéines membranaires associées aux lysosomes 1 et 2 (LAMP 1, LAMP 2), les principaux constituants protéiques de la membrane lysosomale et la protéine 1A/1B-light chain 3 (CL3) associée aux microtubules, un marqueur autophagosome14. Malgré des similitudes apparentes, la cinétique de formation de PV15,16 et la morphologie de ces compartiments varient selon les espèces de Leishmania. Par exemple, une infection causée par L. mexicana ou L. amazonensis induit la formation de grands compartiments contenant un grand nombre de parasites17. En revanche, d’autres espèces, comme L. braziliensis et L. infantum, forment des vacuoles plus petites qui ne contiennent normalement qu’un ou deux parasites dans chaque vacuole18.

Malgré cette connaissance de l’interaction entre la cellule hôte et la leishmanie, les événements initiaux déclenchés par le contact entre les récepteurs de l’hôte et les ligands du parasite n’ont pas été entièrement élucidés. Ces événements sont connus pour être des déterminants de l’issue de l’infection parasitaire et dépendent des espèces parasitaires, du type de récepteurs de la cellule hôte recrutés pour reconnaître les parasites et de l’activation des voies de signalisation des macrophages19,20. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les molécules impliquées dans la biogenèse des PV induites par Leishmania et de déterminer le(s) rôle(s) joué(s) par ces molécules dans l’établissement et l’issue de l’infection. Ici, nous décrivons une méthode de surveillance des événements précoces survenant au cours de la phagocytose de Leishmania, y compris la liaison, l’internalisation, la formation et la maturation des phagosomes. Ce travail pourrait aider à clarifier la participation de PLC, Akt, Rab5, Rab7 et LC3 dans la formation de PV induite par différentes espèces de Leishmania. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour étudier la participation d’autres protéines impliquées dans la maturation PV. Les études futures élargiront les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l’interaction Leishmania-cellule hôte et contribueront à la conception de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.

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Protocol

Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs sains après l’approbation des procédures par les comités nationaux d’éthique de la recherche (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Cultures cellulaires

  1. Macrophages dérivés de monocytes humains
    NOTE: Pour obtenir des macrophages dérivés de monocytes humains pour la différenciation in vitro en macrophages, prélever du sang de donneurs sains et purifier les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme décrit par D. English et B. R. Andersen21.
    1. Après avoir recueilli le sang périphérique (50 mL), versez-le dans un tube hépariné, puis diluez le sang 1:1 dans une solution tampon phosphate (PBS) à température ambiante. Placer délicatement le sang hépariné dilué sur le milieu de gradient de densité préalablement réparti.
    2. Centrifuger les tubes à 252 × g pendant 30 min à 24 °C pour éviter l’hémolyse.
      REMARQUE: Réglez la rupture de la centrifugeuse pour éviter le mélange des couches de gradient. Après centrifugation, des couches de gradient discontinues sont formées de bas en haut : érythrocytes, milieu de gradient de densité, cycle PBMC et plasma.
    3. Transférer l’anneau PBMC, situé entre le milieu de gradient de densité et les couches de plasma, dans un nouveau tube et remplir de PBS pour éliminer l’excès de milieu de gradient de densité.
    4. Laver les cellules une fois et centrifuger à 190 × g pendant 10 min à 4 °C.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu RPMI complet.
    6. Compter les cellules et plaquer 2 × 106 cellules dans 500 mL du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté en 25 mM d’acide N-[2-hydroxyéthyl]pipérazine-N′-[2-éthane sulfonique] (HEPES), 2 g/L de bicarbonate de sodium, 2 mM de glutamine, 20 g/mL de ciprofloxacine et 10 % de sérum fœtal bovin inactivé (FBS) (milieu RPMI complet) pendant 7 jours à 37 °C sous 5 % de CO2 dans une plaque de 24 puits pour permettre aux monocytes de se différencier en macrophages par adhérence.
  2. Cultures THP-1
    1. Cultiver la lignée cellulaire THP-1 à une concentration de 2 × 105 cellules dans 10 mL de milieu RPMI complet dans une fiole de culture de 75 cm2 .
    2. Maintenir les cultures cellulaires dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 7 jours.
    3. Centrifuger les cellules à 720 × g pendant 10 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI complet.
    4. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer.
    5. Cellules en plaques sur lamelles de verre de 13 mm à une concentration de 2 × 105 cellules par puits dans 500 μL de milieu RPMI complet contenant 100 nM d’acétate de myristate de phorbol (PMA) à 37 °C sous 5% de CO2 pour permettre la différenciation des cellules THP1 en macrophages.
    6. Après trois jours, laver deux fois les cellules avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer le milieu contenant de la PMA.
    7. Incuber des cellules THP-1 différenciées dans un milieu RPMI complet sans PMA à 37 °C sous 5% de CO 2 pendant2 jours supplémentaires avant de commencer l’expérimentation.

2. Cultures de parasites et coloration rouge CellTracker

REMARQUE: Pour visualiser les parasites par microscopie à fluorescence, effectuez une coloration à l’aide du colorant fluorescent rouge CellTracker (CMTPX). Alternativement, d’autres marqueurs, y compris la carboxyfluorescéine, peuvent être utilisés conformément aux instructions du fabricant ou des promastigotes exprimant de manière constitutive GFP, RFP ou d’autres gènes rapporteurs fluorescents. Les parasites utilisés pour infecter les cellules sont ceux en phase stationnaire de croissance obtenus à partir d’une culture axénique promastigote ne dépassant pas 7 passages.

  1. Cultiver Leishmania spp. promastigotes à 1 x 10 5 parasites par 1 000 μL de milieu dans une fiole de culture cellulaire contenant5 mL de milieu de Schneider supplémentés en gentamicine à 50 μg/mL et 10 % de FBS.
  2. Après avoir incubé des cultures axéniques de parasites dans une demande biochimique en oxygène (B.O.D.) à 24 °C, effectuer un comptage quotidien dans une chambre de Neubauer. Vérifiez la forme du parasite (mince, allongé) et la mobilité pendant 5 jours. Les parasites sont considérés comme en phase stationnaire de croissance lorsque deux comptages consécutifs avec 8 heures d’intervalle affichent des quantités similaires.
  3. Lorsque vous atteignez la phase stationnaire de croissance, incuber les parasites dans 4 mL de solution de NaCl à 0,9% avec 1 μM CMTPX pendant 15 min à 37 °C sous 5% de CO2 en évitant le contact avec la lumière.
  4. Ajouter FBS à une proportion de 1:1 et incuber la suspension du parasite pendant 1 minute supplémentaire.
  5. Laver les parasites trois fois avec du PBS, puis les centrifuger à 1 781 × g pendant 10 min.
  6. Suspendre la pastille parasitaire dans 1 000 μL de milieu complet RPMI.
  7. Comptez les parasites dans une chambre de Neubauer.

3. Évaluation de la liaison de Leishmania aux macrophages

  1. Graine 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
  2. Cultiver des cellules à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 24 h.
  3. Laver les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet à 4 °C pendant 10 min.
  4. Ajouter des promastigotes en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen22 dans un rapport de 10:1 avec les plaques de puits, puis centrifuger à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.
  5. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
  6. Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.
  7. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à température ambiante.
  8. Incuber les lames de couverture avec 15 mMNH4Cl pendant 15 min à température ambiante.
  9. Laver trois fois avec du PBS 0,15 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber avec une solution bloquante (3% BSA dans PBS) pendant 1 h à température ambiante.
  10. Laver trois fois avec du PBS, puis perméabiliser avec du PBS-Saponin à 0,15 % pendant 15 min à température ambiante.
  11. Ajouter la phalloïdine (diluée 1:1 200) pendant 1 h à température ambiante et protéger de la lumière.
  12. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide d’un support de montage.
  13. Acquérir des images au moyen d’un microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63×/1,4.

4. Évaluation de la phagocytose de Leishmania par les macrophages

  1. Graine 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
  2. Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO2.
  3. Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9 % et incuber dans un milieu RPMI complet dans une plaque de 24 puits à 4 °C pendant 10 min.
  4. Ajouter la phase stationnaire Leishmania spp. comme décrit par A. L. Petersen22 à un rapport 10:1 (parasite:cellule hôte), puis centrifuger à 720 × g pendant 10 min sous 4 °C.
  5. Incuber les cellules à 4 °C pendant 5 min.
  6. Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.
  7. Incuber les cellules dans un milieu RPMI supplémenté à 37 °C pendant 1 h.
  8. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min.
  9. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.
  10. Compter pas moins de 400 cellules dans des champs aléatoires sous un microscope à fluorescence en utilisant un objectif de 100×/1,4.

5. Évaluation de la maturation vacuole induite par Leishmania

NOTE: La transfection cellulaire THP-1 doit être effectuée comme décrit par M. B. Maess, B. Wittig et S. Lorkowski 23. Nous résumons ici ce protocole, avec un minimum de modifications. La nucléofection est une méthode de transfection spécifique qui nécessite un nucléofector. Comme méthode alternative, les cellules peuvent être transfectées en utilisant la lipofectamine24 et la transduction du lentivirus25.

  1. Pour étudier la biogenèse de la PV induite par Leishmania, transfecter des cellules THP1 avec PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 ou Rab 728,29,31 plasmides.
    REMARQUE: Cette méthodologie peut être utilisée pour transfecter les cellules THP-1 avec d’autres gènes que ceux énumérés ci-dessus.
  2. Cellules THP-1 de semence à 1,5 x 107 dans 75 cm² de flacons de culture tissulaire contenant 10 mL de milieu RPMI complet supplémenté avec 100 ng/mL de PMA et 50 μM de 2-mercaptoéthanol pendant 48 h.
  3. Laver les cellules une fois dans une solution de NaCl à 0,9%.
  4. Détacher les cellules à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique et centrifuger (250 × g) pendant 5 min à température ambiante.
  5. Resuspendre les cellules THP-1 dans 1 mL de milieu RPMI et effectuer des comptages dans une chambre Neubauer.
  6. Centrifuger à nouveau les cellules THP-1 à 250 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez le surnageant.
  7. Resuspendre 2 × 106 cellules dans 100 μL de solution de Nucleofector et incuber avec 0,5 μg du plasmide codant pour la protéine d’intérêt, marqué avec une protéine fluorescente.
  8. Transférer la suspension contenant des cellules THP-1 et de l’acide nucléique dans la cuvette Nucleofector.
  9. Transfect de cellules THP1 à l’aide du programme Nucleofector Y-001.
  10. Récupérer les cellules transfectées (2x106) et les ensemencer dans un milieu RPMI de 500 μL sur des plaques de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm (4 puits/transfection).
  11. Incuber les cellules THP-1 dans un milieu RPMI complet à 37 °C pendant 0,5, 2, 4, 6, 12 et 24 h.
  12. Répétez les étapes 3.13 et 3.13.

6. Évaluation du recrutement de LC3 à Leishmania spp. PVs

REMARQUE : Le marqueur membranaire autophagique LC3 peut être utilisé pour déterminer si les phagosomes présentent des caractéristiques autophagiques. Le recrutement de CL3 dans les PV induites par Leishmania peut être évalué pendant l’infection par immunomarquage des cellules avec l’anticorps anti-LC3, comme décrit précédemment par C. Matte32 et B. R. S. Dias33.

  1. Semer 2 × 10cellules 5 THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans un milieu RPMI complet de 500 μL sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
  2. Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO2.
  3. Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet.
  4. Ajouter des promastigotes Leishmania spp. en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen22 dans un rapport de 10:1 (parasite: cellules hôtes) et centrifuger les cellules à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.
  5. Incuber à 37 °C pendant 30 min ou 4 h. Ensuite, lavez deux fois et fixez les cellules pour évaluer le recrutement de CL3 dans les membranes photovoltaïques induites par Leishmania aux premiers stades de l’infection.
    1. Alternativement, pour évaluer le recrutement de CL3 sur les membranes PV aux stades ultérieurs de l’infection, laver deux fois un autre groupe de macrophages à 4 h d’infection pour éliminer tous les promastigotes non internalisés. Incuber les cellules infectées dans un milieu RPMI complet pendant 12 h et 24 h supplémentaires, pour finalement laver deux fois et fixer.
      REMARQUE: Les cellules fixes peuvent être conservées dans une solution de PBS ou de NaCl à 0,9% à 4 °C jusqu’à l’étiquetage.
  6. Bloquer et perméabiliser simultanément les cellules fixées dans 0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 20% de sérum de chèvre normal, 6% de lait en poudre écrémé et 50% de FBS pendant 20 minutes à température ambiante.
  7. Incuber les cellules avec l’anticorps anti-LC3 (1: 200) dilué dans du PBS pendant 2 h à température ambiante.
    NOTE: En tant que contrôle négatif de l’immunomarquage, un groupe de cellules doit être incubé avec l’immunoglobuline G (IgG) de l’animal d’origine anticorps primaire à une concentration équivalente à celle utilisée pour l’anticorps primaire.
  8. Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.
  9. Incuber les cellules avec des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées AlexaFluor 488 (1:500) ou les anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent préféré pendant 1 h à température ambiante.
  10. Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.
  11. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.
  12. Acquérir des images au microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63x/1,4.

7. Acquisition de la microscopie confocale et quantification des Fidji

REMARQUE: L’acquisition d’images d’immunofluorescence doit être effectuée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Pour obtenir une meilleure résolution, utilisez un objectif 63x à immersion dans l’huile.

  1. Laissez les lamelles de verre de 13 mm à température ambiante et protégez-les de la lumière au moins 30 minutes avant l’acquisition.
  2. Nettoyez les lamelles de couverture avec un mouchoir absorbant.
  3. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif et ajoutez la lame.
  4. Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche la glissière.
  5. Observez et ajustez la mise au point sur le microscope et choisissez l’objectif 63x avec huile.
  6. Ouvrez le programme Leica et ajustez les lasers dans les longueurs d’onde 488, 552 et 405.
  7. Sélectionnez la résolution de l’image 1 024 x 1 024.
  8. Cliquez sur le bouton Live , définissez la pile Z et appuyez sur l’option Commencer . Ensuite, recommencez et appuyez sur le bouton Fin . Nous recommandons 20 μm pour l’épaisseur de la tranche afin d’obtenir des images confocales avec de bonnes résolutions.
  9. Attendez l’acquisition de l’image, puis sélectionnez l’option « Projection maximale » dans les outils Leica.
  10. Enregistrez l’expérience.
  11. Exportez les images au format lif ou tiff vers un ordinateur et ouvrez le programme FIJI.
  12. Ouvrez l’expérience et définissez la pile de vues avec la pile hyper. Sélectionnez ensuite ouvrir les fichiers individuellement et assembler les tuiles.
  13. Sélectionnez l’outil mains libres dans la barre d’outils Fidji et tracez soigneusement la cellule à la main.
  14. Appuyez sur le bouton Analyser et mesurez pour visualiser l’intensité de fluorescence.
  15. Répétez ce processus à chaque cellule par groupe.
  16. Enregistrez les mesures et exportez-les vers un éditeur de tableur.
  17. Ajoutez ces données à un programme d’analyse statistique et effectuez l’analyse statistique.

8. Analyse statistique

REMARQUE : Pour l’analyse des données et les graphiques, utilisez un programme d’analyse statistique.

  1. Ouvrez le programme.
  2. Insérez les données obtenues et testez les paramètres de normalité.
  3. Pour les données avec une distribution normale, utilisez le test t de Student et pour les tests non paramétriques, le test de Mann-Whitney.
  4. Considérez les données présentant une différence statistiquement significative lorsque la valeur de p est inférieure à 0,05.
  5. Préparez des graphiques représentant les données, avec des mesures de tendance centrale (moyenne ou médiane) et des mesures de variation.

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Representative Results

Ce rapport vise à évaluer les événements précoces survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant la forme L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL de CL. En utilisant la microscopie confocale, nous avons étudié les principaux événements associés à la phagocytose des parasites: liaison, internalisation et maturation du phagosome. Nous avons d’abord évalué la liaison et la phagocytose de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL par des macrophages dérivés de monocytes humains. Les données montrent que L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL se lient de la même manière aux macrophages (Figure 1). De plus, aucune différence n’a été observée concernant la phagocytose de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL par les cellules hôtes (Figure 2). Enfin, nous avons comparé le recrutement de CL3 aux PV induits par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL dans les cellules infectées. Après 30 min, 4 et 12 h d’infection, nous avons observé des pourcentages similaires de PV décorés de LC3 dans les macrophages infectés par L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL (Figure 3). Ces résultats représentatifs ont montré que L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL interagissent de manière similaire avec les macrophages lors de la liaison, de la phagocytose et de la biogenèse des PV, concernant le recrutement de la CL3.

Des images microscopiques représentant des cellules THP-1 transfectées efficacement avec des plasmides PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP sont montrées à la figure 4.

Figure 1
Graphique 1. Évaluation de la liaison de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL aux macrophages humains. Des macrophages humains dérivés de monocytes ont été infectés par L. braziliensis-LCL- ou L. braziliensis-DL. Après 10 min à 4 °C, la liaison a été évaluée par microscopie confocale. (A) Images de microscopie confocale de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL (marquées avec CMTPX, rouge) se liant aux macrophages (marquées à la phalloïdine, vert). Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu). Les flèches représentent la liaison Leishmania-macrophage. (B) Pourcentage de Leishmania se liant aux macrophages. Au total, 30 cellules par groupe ont été analysées. Les données représentent chaque répétition d’une expérience réalisée en quintuplicate (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Évaluation de la phagocytose de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL par des macrophages humains. Des macrophages dérivés de monocytes humains ont été incubés avec L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL pendant 10 min à 4 °C, suivis de 1 h supplémentaires à 37 °C. Les cellules ont ensuite été analysées par microscopie à fluorescence en comptant un total de 400 cellules. (A) Images de microscopie confocale de macrophages humains infectés par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL. Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu). Les flèches représentent les noyaux des parasites Leishmania. (B) Pourcentage de phagocytose de Leishmania. Les cercles représentent les données de chaque répétition d’une expérience réalisée en triple exemplaire (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Évaluation du recrutement de CL3 dans les PV induit par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL dans les macrophages. Des macrophages humains dérivés de monocytes ont été infectés puis colorés avec des anticorps anti-LC3 pendant 30 min, 4 et 12 h. (A) Images de microscopie confocale de macrophages infectés par L. braziliensi s-LCL ou L. braziliensis-DL marqués avec anti-LC3 suivies de l’anticorps secondaire anti-lapin IgG conjugué à Alexa Fluor 488 (vert). Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu); (B) Pourcentage de PV induits par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL décorés de CL3-II. Au total, 30 cellules par groupe ont été analysées. Les cercles correspondent à chaque champ sélectionné au hasard analysé (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Cellules THP-1 exprimant PLC, Rab5 ou Rab7. Après différenciation en macrophages, les cellules THP-1 ont été soumises à la nucléofection avec chaque gène d’intérêt couplé à des sondes fluorescentes GFP : PLC, Rab5 et Rab7. Par la suite, ces cellules ont été fixées, ont eu le noyau coloré avec DAPI (bleu) et ont été observées sous un microscope confocal en utilisant un objectif 63x / 1.4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs étapes qui peuvent influencer le développement de la maladie5. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction de Leishmania non opsonisée et des cellules hôtes, nous avons décrit un protocole qui utilise la microscopie confocale à fluorescence pour évaluer la phagocytose des stades précoces à avancés de l’infection à Leishmania. L’utilisation de techniques de fluorescence impliquant deux fluorophores ou plus pour étudier les mécanismes de biologie cellulaire, y compris l’immunomarquage et l’expression de protéines marquées par fluorescence, nous permet d’analyser l’emplacement de plusieurs protéines, ainsi que d’évaluer simultanément la morphologie cellulaire. Les avantages offerts par ces méthodes en font les meilleurs outils pour surveiller l’interaction pathogène-cellule hôte34.

Pour mieux comprendre le processus phagocytaire impliquant différentes particules, il est crucial d’analyser ce processus hautement dynamique au niveau moléculaire35. La microscopie à fluorescence confocale est utilisée depuis des décennies à cette fin et s’est révélée être un excellent outil pour quantifier la phagocytose par la détermination du nombre de particules internalisées ou des types de protéines connues pour être impliquées dans les premiers stades de l’interaction hôte-pathogène34. La présente étude a proposé l’utilisation de la microscopie confocale pour analyser les événements survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant différentes formes cliniques (LCL et DL). Cette technique nous permet d’étudier des cellules exprimant des protéines fluorescentes spécifiques, notamment PLC, Akt, Rab 5 et Rab 7, puis d’évaluer la participation de ces protéines dans la phagocytose des isolats de Leishmania afin d’identifier des éléments pertinents pour différents résultats d’infection.

La présente étude a utilisé des macrophages primaires et des cellules THP1 pour évaluer la phagocytose de L. braziliensis aux premiers stades de l’infection. Le protocole actuellement décrit peut également être utilisé pour étudier la phagocytose chez Leishmania spp. par d’autres phagocytes, y compris les cellules dendritiques, les monocytes, les lignées cellulaires de macrophages et les neutrophiles dérivés du sang périphérique humain. Au cours du processus d’internalisation du parasite, un changement dynamique de la F-actine se produit à la surface de la membrane cellulaire11. Nous avons ensuite marqué des protéines situées dans la membrane cellulaire à l’aide d’un marqueur spécifique de phagocytose36, tel que le PLC fluorescent, ce qui nous a permis d’observer le stade de liaison de Leishmania aux cellules hôtes, comme le montre la figure 4. La coloration des parasites avec des marqueurs fluorescents, tels que CMTPX ou CSFE, est également cruciale pour évaluer la liaison du parasite aux cellules hôtes par immunofluorescence. Il convient de noter que ce test nécessite une exécution minutieuse: i) laver doucement les lamelles de couverture en utilisant des solutions de lavage à température ambiante (25 ° C), sinon les échantillons peuvent être endommagés; ii) préparer les dilutions de réactifs avec précision; et iii) protéger les échantillons de la lumière34.

Un microscope confocal configuré à la longueur d’onde d’excitation laser optimale est capable d’obtenir une image d’échantillon de haute qualité. Les cellules marquées peuvent être conservées pendant des semaines dans l’obscurité à 4 °C ou congelées jusqu’au moment de l’analyse. L’utilisation de la microscopie confocale pour évaluer la phagocytose est limitée par des périodes d’exposition prolongées et des faisceaux laser de haute intensité, qui peuvent endommager les échantillons et, dans certains cas, conduire à des niveaux élevés de détection de fond dans les images35,37.

Dans la présente étude, au lieu d’utiliser l’imagerie en direct pour suivre la phagocytose de Leishmania spp., nous avons effectué une étude cinétique en fixant les cellules à plusieurs moments précoces de l’infection (30 min, 4 h et 12 h). Il faut considérer que l’imagerie en direct offre certains avantages, tels que la possibilité d’analyser la dynamique spatiale et temporelle d’une myriade de processus cellulaires, y compris la phagocytose, et de capturer des détails qui ne sont pas observables dans les images statiques34. Cependant, l’imagerie en direct exige que les cellules soient en bonne santé tout au long du processus d’expérimentation, y compris le contrôle de la température, du pH et des conditions d’oxygène dans une chambre microscopique. Il est important de noter que cela ne peut pas être effectué de manière fiable dans plusieurs laboratoires à travers le monde.

Le protocole de nucléofection décrit a démontré son efficacité dans la transfection des cellules THP-1, comme rapporté précédemment par M. B. Maess, B. Wittig et S. Lorkowski 23. Dans ce processus, il est crucial de détacher doucement les cellules pour éviter les dommages cellulaires ou la perte de viabilité cellulaire. Sur la base de notre expérience, nous recommandons d’utiliser une solution de dissociation cellulaire non enzymatique pour détacher les cellules des plaques avant d’effectuer la transfection. Les auteurs du protocole original23 affirment que les principales limites de cette procédure sont la nécessité pour les cellules d’être en suspension pendant le processus de nucléofection et le fait qu’un détachement inadéquat peut causer du stress. Malgré ces limitations, le protocole permet une transfection fiable, atteignant un taux de transfection réussie de 90% sans perte de viabilité cellulaire.

La caractérisation des PV à l’aide d’un ensemble de marqueurs endocytaires, y compris PLC, Akt, Rab5 et Rab7, est essentielle pour améliorer notre compréhension de la phagocytose de Leishmania. L’identification de nouvelles protéines qui participent à la biogenèse PV et la caractérisation complète de ces compartiments peuvent clarifier les différences dans la réponse des macrophages au cours de l’infection par Leishmania spp. La contribution de nos résultats à l’ensemble des connaissances entourant les résultats de l’infection à Leishmania fera sans aucun doute progresser notre compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutiendra la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques. Il est à noter que cette technique peut également être étendue à d’autres types d’études, y compris l’infection par des bactéries, des levures ou l’engloutissement de billes par de nombreux types de cellules38,39.

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Disclosures

Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte ou l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brésil et le département de microscopie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par INOVA-FIOCRUZ numéro 79700287000, P.S.T.V. détient une subvention pour la productivité dans la recherche du CNPq (305235/2019-2). Les plasmides ont été aimablement fournis par Mauricio Terebiznik, Université de Toronto, CA. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

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Immunologie et infection numéro 173
Étude de la phagocytose de <em>Leishmania</em> à l’aide de la microscopie confocale
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Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

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