Summary
Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Abstract
Fagositoz, farklı adımları içeren düzenlenmiş bir süreçtir: tanıma, bağlama ve içselleştirme. Profesyonel fagositler, çoklu konakçı hücre reseptörleri tarafından parazit yüzeylerindeki ligandların tanınmasından oluşan fagositoz ile Leishmania parazitlerini alırlar. Leishmania'nın makrofaj membranlarına bağlanması, kompleman reseptörü tip 1 (CR1) ve kompleman reseptörü tip 3 (CR3) ve Desen Tanıma Reseptörleri aracılığıyla gerçekleşir. Lipofosfoglikan (LPG) ve 63 kDa glikoprotein (gp63), makrofaj-Leishmania etkileşiminde rol oynayan ana ligandlardır. Parazit ligandlarının konakçı hücre reseptörleri tarafından ilk kez tanınmasını takiben, parazitler içselleştirilir, hayatta kalır ve parazitoforlu vakuoller içinde çoğalır. Leishmania kaynaklı vakuollerin olgunlaşma süreci, monomerik G proteini Rab 5 ve Rab 7, lizozomal ilişkili membran proteini 1 (LAMP-1), lizozomal ilişkili membran proteini 2 (LAMP-2) ve mikrotübül ile ilişkili protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) dahil olmak üzere hücre içi veziküllerden moleküllerin edinilmesini içerir.
Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle etkileşimi sırasında meydana gelen erken olayları konfokal mikroskopi kullanarak değerlendirmek için (i) bağlanma (ii) içselleştirme ve (iii) fagozom olgunlaşması dahil olmak üzere yöntemleri açıklıyoruz. Enfeksiyon sonucunun bu belirleyicilerini çevreleyen bilgi birikimine ekleyerek, Leishmania enfeksiyonunun patogenezinin anlaşılmasını geliştirmeyi ve yeni kemoterapötik hedefler için nihai arayışı desteklemeyi umuyoruz.
Introduction
Leishmaniasis, Leishmania cinsinin protozoan parazitlerinin neden olduğu, omurgalı konakçıda kutanöz leishmaniasis, mukokutanöz leishmaniasis ve viseral leishmaniasis 1 dahil olmak üzere geniş bir klinik bulgu spektrumuna neden olan ihmal edilmiş tropikal bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), bir milyardan fazla insanın risk altında olduğunu ve yılda bir milyondan fazla yeni vaka bildirildiğini tahmin etmektedir2.
Leishmania spp., monositler, makrofajlar ve dendritik hücreler dahil olmak üzere konakçı hücrelerin içinde hayatta kalan zorunlu hücre içi protozoanlardır3. Leishmania-makrofaj etkileşimi, doğrudan etkileşim yoluyla veya kompleman reseptörlerini içeren opsonizasyon yoluyla çoklu konakçı hücre reseptörlerini ve parazit ligandlarını içeren karmaşık bir süreçtir 4,5. CR1, CR3, mannoz-fukoz, fibronektin, toll-like ve çöpçü reseptörleri gibi klasik yüzey reseptörleri, makrofajlara parazit bağlanmasına aracılık eder 6,7,8. Bu reseptörler, 63 kDa glikoprotein (gp63) ve glikolipid lipofosfoglikan (LPG)9 dahil olmak üzere Leishmania yüzeyindeki molekülleri tanır. Bunlar promastigotların yüzeyindeki en bol moleküllerdir ve konakçı bağışıklık tepkisinin yıkılmasında önemli bir rol oynar ve memeli hücrelerinde parazit enfeksiyonunun kurulmasını destekler10. Parazit yüzey ligandları makrofaj reseptörlerine bağlandıktan sonra, F-aktin, memeli hücre yüzeylerinde birikir ve parazitleri fagositonize edildikçe çevreler. Daha sonra, bu, fazolizozomal özellikler11 sunan parazit kaynaklı bir bölmenin oluşumuna yol açar parazitoforlu vakuol (PV). Bu fagolizozomların içine girdikten sonra, parazitler hayatta kalma ve çoğalma için gerekli olan çeşitli değişikliklere uğrar3.
PV'lerin biyogenezi, bu patojenin hücre içi sağkalımı için kritik öneme sahip, yüksek oranda düzenlenmiş bir membran kaçakçılığı sürecidir12. Bu kompartmanın oluşumu, konakçı endositik yolun fagozomları ve kompartmanları arasındaki sıralı füzyon olaylarından kaynaklanır. Klasik hücre biyolojisi çalışmaları, PV'lerin olgunlaşmasının, esas olarak sırasıyla erken ve geç endozom olgunlaşması ile ilişkili olan monomerik G proteini Rab 5 ve Rab 7 proteinlerinin edinilmesini içerdiğini ortaya koymuştur,13. Ek olarak, bu bölmeler, lizozomla ilişkili membran proteinleri 1 ve 2'yi (LAMP 1, LAMP 2), lizozomal membranın ana protein bileşenlerini ve bir otofagozom belirteci14 olan mikrotübülle ilişkili protein 1A / 1B-hafif zincir 3'ü (LC3) elde eder. Belirgin benzerliklere rağmen, PV oluşumunun kinetiği15,16 ve bu bölmelerin morfolojisi Leishmania türlerine bağlı olarak değişir. Örneğin, L. mexicana veya L. amazonensis'in neden olduğu enfeksiyon, çok sayıda parazit içeren büyük bölmelerin oluşumunu tetikler17. Buna karşılık, L. braziliensis ve L. infantum gibi diğer türler, normalde her vakuol18'de sadece bir veya iki parazit içeren daha küçük vakuoller oluşturur.
Konakçı hücre-Leishmania etkileşimini çevreleyen bu bilgiye rağmen, konakçı reseptörleri ve parazit ligandları arasındaki temasın tetiklediği ilk olaylar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu olayların parazit enfeksiyonunun sonucunun belirleyicileri olduğu bilinmektedir ve parazit türlerine, parazitleri tanımak için işe alınan konakçı hücre reseptörlerinin tipine ve makrofaj sinyal yolaklarının aktivasyonuna bağlıdır19,20. Bu nedenle, Leishmania kaynaklı PV'lerin biyogenezinde rol oynayan molekülleri tanımlamak ve bu moleküllerin enfeksiyon oluşumunda ve sonuçlarında oynadığı rolleri belirlemek önemlidir. Burada, Leishmania'nın fagositozu sırasında meydana gelen, bağlanma, içselleştirme, fagozom oluşumu ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken olayları izlemek için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışma, PLC, Akt, Rab5, Rab7 ve LC3'ün farklı Leishmania türleri tarafından indüklenen PV'lerin oluşumuna katılımını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir. Önemli olarak, bu protokol PV olgunlaşmasında rol oynayan diğer proteinlerin katılımını araştırmak için kullanılabilir. Gelecekteki çalışmalar, Leishmania-host hücre etkileşiminde yer alan mekanizmaları çevreleyen bilgileri genişletecek ve yeni kemoterapötik stratejilerin tasarımına katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ulusal Araştırma Etik Kurulları (ID: 94648218.8.0000.0040) tarafından prosedürlerin onaylanmasını takiben sağlıklı donörlerden hücreler elde edilmiştir.
1. Hücre kültürleri
- İnsan monosit türevi makrofajlar
NOT: Makrofajlara in vitro farklılaşma için insan monosit türevi makrofajlar elde etmek için, sağlıklı donörlerden kan toplayın ve D. English ve B. R. Andersen21 tarafından tanımlandığı gibi periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) arındırın.- Periferik kanı (50 mL) topladıktan sonra, heparinize bir tüpe dökün ve daha sonra kanı oda sıcaklığında bir fosfat tampon çözeltisinde (PBS) 1: 1 oranında seyreltin. Seyreltilmiş heparinize kanı daha önce dağıtılmış yoğunluk gradyanı ortamının üzerine nazikçe yerleştirin.
- Hemolizi önlemek için tüpleri 24 °C'de 30 dakika boyunca 252 × g'de santrifüj yapın.
NOT: Degrade katmanlarının karışmasını önlemek için santrifüj kopmasını ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra, süreksiz gradyan katmanları aşağıdan yukarıya doğru oluşur: eritrositler, yoğunluk gradyan ortamı, PBMC halkası ve plazma. - Yoğunluk gradyanı ortamı ile plazma katmanları arasında bulunan PBMC halkasını yeni bir tüpe aktarın ve fazla yoğunluklu gradyan ortamını yıkamak için PBS ile doldurun.
- Hücreleri bir kez yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 190 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve peleti 1 mL'lik tam RPMI ortamında yeniden askıya alın.
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI)'nin 500 mL×'sinde 25 mM N-[2-hidroksietil] piperazin-N′-[2-etan sülfonik asit] (HEPES), 2 g / L sodyum bikarbonat, 2 mM glutamin, 20 g / mL siprofloksasin ve% 10 inaktive Fetal Sığır Serumu (FBS) (tam RPMI ortamı) ile 7 gün boyunca 24 delikli bir plakada% 5 CO 2 altında 7 günboyunca hücreleri ve plakayı sayın24 delikli bir plakada 37 ° C'de% 5 CO 2 altında yapışma yoluyla.
- THP-1 kültürleri
- THP-1 hücre hattını,75 cm2 kültür şişesinde 10 mL tam RPMI ortamında2 × 10 5 hücre konsantrasyonunda büyütün.
- Hücre kültürlerini bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında 7 gün boyunca koruyun.
- 720 × g'daki hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve peleti tam RPMI ortamında yeniden askıya alın.
- Neubauer odasındaki hücreleri sayın.
- 13 mm cam kapaklar üzerindeki plaka hücreleri, THP1 hücrelerinin makrofajlara farklılaşmasına izin vermek için 37 ° C'de% 5 CO 2'nin altında 100 nM forbol miristat asetat (PMA) içeren 500 μL tam RPMI ortamındakuyucuk başına 2 × 105 hücre konsantrasyonunda kayar.
- Üç gün sonra, PMA içeren ortamı çıkarmak için% 0.9 NaCl çözeltisi ile iki hücreyi yıkayın.
- Deneye başlamadan önce 2 gün daha PMA içermeyen tam RPMI ortamında farklılaşmış THP-1 hücrelerini% 5 CO2'nin altında 37 ° C'de inkübe edin.
2. Parazit kültürleri ve CellTracker Kırmızı boyama
NOT: Floresan mikroskobu ile parazitleri görselleştirmek için, CellTracker Kırmızı floresan boya (CMTPX) kullanarak boyama işlemi gerçekleştirin. Alternatif olarak, karboksifloresein de dahil olmak üzere diğer belirteçler, üretici talimatlarına veya GFP, RFP veya diğer floresan muhabir genlerini yapısal olarak ifade eden promastigotlara uygun olarak kullanılabilir. Hücreleri enfekte etmek için kullanılan parazitler, 7 pasajdan fazla olmayan bir promastigot aksenik kültüründen elde edilen büyümenin sabit fazındakilerdir.
- Leishmania spp büyümek. 50 μg / mL gentamisin ve% 10 FBS ile desteklenmiş 5 mL Schneider besiyeri içeren bir hücre kültürü şişesinde 1.000 μL ortam başına 1 x 10 5 parazitte promastigotlar.
- Parazit aksenik kültürlerini 24 ° C'de biyokimyasal oksijen ihtiyacında (BOD) inkübe ettikten sonra, bir Neubauer odasında günlük sayım yapın. 5 gün boyunca parazit formunu (ince, uzun) ve hareketliliği kontrol edin. Parazitler, 8 saatlik aralıklı iki ardışık sayım benzer miktarları gösterdiğinde, büyümenin sabit fazında kabul edilir.
- Büyümenin durağan fazına ulaştıktan sonra, parazitleri ışıklatemastan kaçınarak 37 ° C'de 37 ° C'de 15 dakika boyunca% 0.9 NaCl çözeltisi olan 4 mL% 0.9 NaCl çözeltisinde inkübe edin.
- FBS'yi 1: 1 oranında ekleyin ve parazit süspansiyonunu 1 dakika daha inkübe edin.
- Parazitleri PBS ile üç kez yıkayın, ardından 10 dakika boyunca 1.781 × g'de santrifüjleme yapın.
- Parazit peletini 1.000 μL RPMI tam ortamda yeniden askıya alın.
- Neubauer odasındaki parazitleri sayın.
3. Makrofajlara Leishmania bağlanmasının değerlendirilmesi
- Tohum 2 × 105 THP-1 hücresi veya insan monosit türevi makrofajlar, 13 mm cam kapaklı 24 delikli bir plaka üzerinde kuyu başına 500 μL tam RPMI ortamında.
- 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 altında hücreleri yetiştirin.
- Hücreleri% 0.9 NaCl çözeltisi ile iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de tam RPMI ortamında inkübe edin.
- A. L. Petersen22 tarafından açıklandığı gibi sabit faz promastigotlarını kuyu plakalarına 10: 1 oranında ekleyin ve ardından 4 ° C'nin altında 5 dakika boyunca 720 × g'de santrifüj yapın.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İçselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için hücreleri% 0.9 NaCl çözeltisi ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
- Kapakları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 15 mM NH4Cl ile inkübe edin.
- PBS% 0.15 sığır serum albümini (BSA) ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca blokaj çözeltisi (PBS'de% 3 BSA) ile inkübe edin.
- PBS ile üç kez yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.15 PBS-Saponin ile geçirgenleştirin.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca falloidin (seyreltilmiş 1:1.200) ekleyin ve ışıktan koruyun.
- Montaj ortamını kullanarak kapakları monte edin.
- 63×/1.4 objektif kullanarak konfokal floresan mikroskop aracılığıyla görüntü elde edin.
4. Leishmania fagositozunun makrofajlarla değerlendirilmesi
- Tohum 2 × 105 THP-1 hücresi veya insan monosit türevi makrofajlar, 13 mm cam kapaklı 24 delikli bir plaka üzerinde kuyu başına 500 μL tam RPMI ortamında.
- Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 altında 24 saat boyunca yetiştirin.
- Hücreleri %0,9 NaCl çözeltisinde iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca 4 °C'de 24 delikli plakada tam RPMI ortamında inkübe edin.
- A. L. Petersen22 tarafından tanımlandığı gibi sabit faz Leishmania spp.'yi 10: 1 (parazit: konakçı hücre) oranında ekleyin ve ardından 4 ° C'nin altında 10 dakika boyunca 720 × g'de santrifüj yapın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- İçselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için hücreleri% 0.9 NaCl çözeltisi ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri 1 saat boyunca 37 ° C'de takviyeli RPMI ortamında inkübe edin.
- Hücreleri 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
- Kapakları tercih edilen montaj ortamını kullanarak monte edin.
- 100×/1.4 hedefi kullanarak floresan mikroskobu altında rastgele alanlarda en az 400 hücre sayın.
5. Leishmania kaynaklı vakuol olgunlaşmasının değerlendirilmesi
NOT: THP-1 hücre transfeksiyonu M. B. Maess, B. Wittig ve S. Lorkowski 23 tarafından tanımlandığı gibi yapılmalıdır. Burada bu protokolü minimum değişiklikle özetliyoruz. Nükleofeksiyon, nükleofektör gerektiren spesifik bir transfeksiyon yöntemidir. Alternatif bir yöntem olarak, lipofectamine24 ve lentivirus transdüksiyonu25 kullanılarak hücreler transfekte edilebilir.
- Leishmania kaynaklı PV'nin biyogenezini araştırmak için, PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 veya Rab 7 28,29,31 plazmidleri ile transfekt THP1 hücreleri.
NOT: Bu metodoloji, THP-1 hücrelerini yukarıda listelenenlerden başka genlerle transfekte etmek için kullanılabilir. - 48 saat boyunca 100 ng / mL PMA ve 50 μM 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş 10 mL tam RPMI ortamı içeren75 cm² doku kültürü şişelerinde 1.5 x 10 7'de tohum THP-1 hücreleri.
- Hücreleri% 0.9 NaCl çözeltisinde bir kez yıkayın.
- Enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj (250 × g) kullanarak hücreleri ayırın.
- THP-1 hücrelerini 1 mL RPMI ortamında yeniden askıya alın ve bir Neubauer odasında sayımlar yapın.
- THP-1 hücrelerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 × g'da tekrar santrifüj yapın. Süper natantı atın.
- 100 μL Nükleofektör çözeltisinde 2 × 106 hücreyi yeniden askıya alın ve bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgili protein için kodlanan 0.5 μg plazmid ile inkübe edin.
- THP-1 hücreleri ve nükleik asit içeren süspansiyonu Nükleofektör küvete aktarın.
- Nükleofektör Programı Y-001 kullanarak Transfekt THP1 hücreleri.
- Transfekte edilmiş hücreleri (2x106) ve tohumu 500 μL RPMI ortamında, 13 mm cam kapaklı (4 kuyucuk / transfeksiyon) 24 delikli plakalarda geri kazanın.
- THP-1 hücrelerini 0.5, 2, 4, 6, 12 ve 24 saat boyunca 37 ° C'de tam RPMI ortamında inkübe edin.
- 3.13 ve 3.13 numaralı adımları yineleyin.
6. LC3'ün Leishmania spp. PV'lere alımının değerlendirilmesi
NOT: Otofajik membran belirteci LC3, fagozomların otofajik özellikler gösterip göstermediğini araştırmak için kullanılabilir. Leishmania kaynaklı PV'lere LC3 alımı, daha önce C. Matte32 ve B. R. S.Dias 33 tarafından tanımlandığı gibi, anti-LC3 antikoru ile hücreleri immünoetiketleme yoluyla enfeksiyon sırasında değerlendirilebilir.
- Tohum 2 ×10 5 THP-1 hücresi veya 500 μL'de insan monosit türevi makrofajlar, 13 mm cam kapaklı 24 delikli bir plaka üzerinde RPMI ortamını tamamlar.
- Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 altında 24 saat boyunca yetiştirin.
- Hücreleri% 0.9 NaCl çözeltisinde iki kez yıkayın ve tam RPMI ortamında inkübe edin.
- A. L. Petersen22 tarafından 10: 1 (parazit: konakçı hücreler) oranında tarif edildiği gibi sabit faz Leishmania spp. promastigotları ekleyin ve hücreleri 720 × g'de 4 ° C'nin altında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- 30 dakika veya 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra iki kez yıkayın ve enfeksiyonun erken aşamalarında Leishmania kaynaklı PV membranlarına LC3 alımını değerlendirmek için hücreleri sabitleyin.
- Alternatif olarak, enfeksiyonun sonraki aşamalarında PV membranlarına LC3 alımını değerlendirmek için, içselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için enfeksiyonun 4 saatinde iki kez başka bir makrofaj grubunu yıkayın. Enfekte olmuş hücreleri tam RPMI ortamında ek bir 12 saat ve 24 saat boyunca inkübe edin, sonunda iki kez yıkayın ve sabitleyin.
NOT: Sabit hücreler, etiketlemeye kadar 4 °C'de PBS veya %0,9 NaCl çözeltisinde tutulabilir.
- Alternatif olarak, enfeksiyonun sonraki aşamalarında PV membranlarına LC3 alımını değerlendirmek için, içselleştirilmemiş promastigotları çıkarmak için enfeksiyonun 4 saatinde iki kez başka bir makrofaj grubunu yıkayın. Enfekte olmuş hücreleri tam RPMI ortamında ek bir 12 saat ve 24 saat boyunca inkübe edin, sonunda iki kez yıkayın ve sabitleyin.
- Aynı anda sabit hücreleri% 0.1 Triton X-100,% 1 BSA,% 20 normal keçi serumu,% 6 yağsız kuru süt ve% 50 FBS'de oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bloke edin ve geçirgenleştirin.
- Hücreleri, oda sıcaklığında 2 saat boyunca PBS'de seyreltilmiş anti-LC3 antikoru (1: 200) ile inkübe edin.
NOT: İmmün boyamanın negatif kontrolü olarak, bir grup hücre, primer antikor kökenli hayvandan, primer antikor için kullanılana eşdeğer bir konsantrasyonda immünoglobulin G (IgG) ile inkübe edilmelidir. - Hücreleri oda sıcaklığında% 0.9 NaCl çözeltisi ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri AlexaFluor 488 konjuge keçi anti-tavşan IgG (1:500) veya tercih edilen floresan boya konjuge sekonjuge sekonder antikorları ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında% 0.9 NaCl çözeltisi ile üç kez yıkayın.
- Kapakları tercih edilen montaj ortamını kullanarak monte edin.
- 63x/1.4 objektif kullanarak konfokal floresan mikroskop ile görüntü elde edin.
7. Konfokal mikroskopi edinimi ve Fiji nicelleştirmesi
NOT: İmmünofloresan görüntülerin elde edilmesi, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak yapılmalıdır. Daha iyi bir çözünürlüğe ulaşmak için yağa daldırma 63x objektif lens kullanın.
- 13 mm'lik cam kapakları oda sıcaklığında bırakın ve alımdan en az 30 dakika önce ışıktan koruyun.
- Kapak kapaklarını emici bir doku ile temizleyin.
- Hedefe bir damla daldırma yağı ekleyin ve slaytı ekleyin.
- Yağ kızağa değene kadar hedefi yukarı doğru hareket ettirin.
- Mikroskoptaki odağı gözlemleyin ve ayarlayın ve yağ ile 63x hedefi seçeneğini seçin.
- Leica programını açın ve lazerleri 488, 552 ve 405 dalga boylarında ayarlayın.
- Görüntü çözünürlüğünü 1.024 x 1.024 olarak seçin.
- Canlı düğmesine tıklayın, Z yığınını ayarlayın ve Başlat seçeneğine basın. Ardından, tekrar yapın ve Bitiş düğmesine basın. İyi çözünürlüklerde konfokal görüntüler elde etmek için dilim kalınlığı için 20 μm öneririz.
- Görüntü alımını bekleyin ve ardından Leica araçlarında "Maksimum Projeksiyon" seçeneğini seçin.
- Denemeyi kaydedin.
- lif veya tiff formatındaki görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve FIJI programını açın.
- Denemeyi açın ve görünüm yığınını hiper yığınla ayarlayın. Ardından dosyaları tek tek aç'ı seçin ve döşemeleri dikin.
- Fiji araç çubuğundaki serbest eller aracını seçin ve hücreyi elle dikkatlice izleyin.
- Analiz Et düğmesine basın ve floresan yoğunluğunu görselleştirmek için ölçün.
- Bu işlemi grup başına her hücreye yineleyin.
- Ölçümleri kaydedin ve bir e-tablo düzenleyicisine dışa aktarın.
- Bu verileri bir istatistiksel analiz programına ekleyin ve istatistiksel analizi yapın.
8. İstatistiksel analiz
NOT: Veri analizi ve grafikleri için istatistiksel bir analiz programı kullanın.
- Programı açın.
- Elde edilen verileri ekleyin ve normallik parametrelerini test edin.
- Normal dağılıma sahip veriler için Student t-testini ve parametrik olmayan testler için Mann-Whitney testini kullanın.
- P-değeri 0,05'ten küçük olduğunda istatistiksel olarak anlamlı bir farka sahip verileri göz önünde bulundurun.
- Merkezi eğilim ölçümleri (ortalama veya medyan) ve varyasyon ölçümleri ile verileri temsil eden grafikler hazırlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu rapor, CL'nin L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL formunu sunan hastalardan izole edilen L. braziliensis'in fagositozu sırasında meydana gelen erken olayları değerlendirmeyi amaçlamaktadır. konfokal mikroskopi kullanarak, parazitlerin fagositozu ile ilişkili ana olayları araştırdık: bağlanma, içselleştirme ve fagozom olgunlaşması. İlk olarak L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL bağlanmasını ve fagositozu insan monosit kaynaklı makrofajlar tarafından değerlendirdik. Veriler hem L. braziliensis-LCL hem de L. braziliensis-DL'nin makrofajlara benzer şekilde bağlandığını göstermektedir (Şekil 1). Ayrıca konakçı hücreler tarafından L. braziliensis-LCL ve L. braziliensis-DL fagositozu açısından da fark gözlenmedi (Şekil 2). Son olarak, LC3'ün işe alımını, enfekte olmuş hücrelerde L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL tarafından indüklenen PV'lerle karşılaştırdık. 30 dakika, 4 ve 12 saatlik enfeksiyondan sonra, L. braziliensis-LCL ve L. braziliensis-DL-enfekte makrofajlarda LC3 ile süslenmiş PV'lerin benzer yüzdelerini gözlemledik (Şekil 3). Bu temsili sonuçlar, L. braziliensis-LCL ve L. braziliensis-DL'nin, LC3 işe alımı ile ilgili olarak, PV'lerin bağlanması, fagositozu ve biyogenezi sırasında makrofajlarla benzer şekilde etkileşime girdiğini göstermiştir.
PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP plazmidleri ile etkin bir şekilde transfekte edilen THP-1 hücrelerini temsil eden mikroskobik görüntüler Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 1. İnsan makrofajlarına L. braziliensis-LCL ve L. braziliensis-DL bağlanmasının değerlendirilmesi. İnsan monosit kaynaklı makrofajlar L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL ile enfekte oldu. 4 °C'de 10 dakika sonra, bağlanma konfokal mikroskopi ile değerlendirildi. (A) L. BRAZILIENSIS-LCL veya L. braziliensis-DL'nin (CMTPX, kırmızı ile etiketlenmiş) makrofajlara bağlanan (faloidin, yeşil ile etiketlenmiş) konfokal mikroskopi görüntüleri. Konfokal mikroskopi için, hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile etiketlendi. Oklar Leishmania-makrofaj bağlanmasını tasvir eder. (B) Leishmania'nın makrofajlara bağlanma yüzdesi. Grup başına toplam 30 hücre analiz edildi. Veriler, beşli olarak gerçekleştirilen bir deneyin her bir tekrarını temsil eder (eşlenmemiş t testi, p > 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. L. braziliensis-LCL ve L. braziliensis-DL fagositozunun insan makrofajları tarafından değerlendirilmesi . İnsan monosit türevi makrofajlar, L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edildi ve ardından 37 ° C'de 1 saat daha ilave edildi . Hücreler daha sonra floresan mikroskobu ile toplam 400 hücre sayılarak analiz edildi. (A) L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL tarafından enfekte olmuş insan makrofajlarının konfokal mikroskopi görüntüleri. Konfokal mikroskopi için, hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile etiketlendi. Oklar Leishmania parazit çekirdeklerini tasvir eder. (B) Leishmania fagositozunun yüzdesi. Daireler, üçlü olarak gerçekleştirilen bir deneyin her bir kopyasından elde edilen verileri temsil eder (eşlenmemiş t testi, p > 0,05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Makrofajlarda L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL tarafından indüklenen PV'lere LC3 alımının değerlendirilmesi. İnsan monosit kaynaklı makrofajlar enfekte edildi ve daha sonra 30 dakika, 4 ve 12 saat boyunca anti-LC3 antikoru ile boyandı. (A) L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL ile enfekte makrofajların anti-LC3 ile etiketlenmiş konfokal mikroskopi görüntüleri ve ardından Alexa Fluor 488'e (yeşil) konjuge edilmiş ikincil anti-tavşan IgG antikoru. Konfokal mikroskopi için, hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile etiketlendi; (B) LC3-II ile süslenmiş L. braziliensis-LCL veya L. braziliensis-DL kaynaklı PV'lerin yüzdesi. Grup başına toplam 30 hücre analiz edildi. Daireler, analiz edilen rastgele seçilen her alana karşılık gelir (eşlenmemiş t testi, p > 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. PLC, Rab5 veya Rab7'yi eksprese eden THP-1 hücreleri. Makrofajlara farklılaştıktan sonra, THP-1 hücreleri, GFP floresan problarına bağlı olarak her bir ilgi geni ile nükleofeksiyona tabi tutuldu: PLC, Rab5 ve Rab7. Daha sonra, bu hücreler sabitlendi, çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı ve 63x / 1.4 hedefi kullanılarak konfokal mikroskop altında gözlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leishmania-makrofaj etkileşimi karmaşık bir süreçtir ve hastalık gelişimini etkileyebilecek birkaç adım içerir5. Opsonize edilmemiş Leishmania ve konakçı hücrelerin etkileşiminde yer alan mekanizmaları daha iyi anlamak için, Leishmania enfeksiyonunun erken ve geç evrelerinden fagositozu değerlendirmek için konfokal floresan mikroskobu kullanan bir protokol tanımladık. İmmünoetiketleme ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu da dahil olmak üzere hücre biyolojisi mekanizmalarını araştırmak için iki veya daha fazla florofor içeren floresan tekniklerinin kullanılması, birkaç proteinin yerini analiz etmemize ve aynı zamanda hücre morfolojisini değerlendirmemize olanak tanır. Bu yöntemlerin sunduğu avantajlar, onları patojen-konakçı hücre etkileşimini izlemek için en iyi araçlar haline getirir34.
Farklı parçacıkları içeren fagositik süreci daha iyi anlamak için, bu son derece dinamik süreci moleküler düzeyde35 analiz etmek çok önemlidir. Konfokal-floresan mikroskopisi bu amaçla on yıllardır kullanılmaktadır ve içselleştirilmiş parçacıkların sayısının veya konakçı-patojen etkileşiminin erken aşamalarında yer aldığı bilinen protein türlerinin belirlenmesi yoluyla fagositozu ölçmek için mükemmel bir araç olduğu gösterilmiştir34. Bu çalışmada, farklı klinik formları (LCL ve DL) olan hastalardan izole edilen L. braziliensis'in fagositozu sırasında meydana gelen olayları analiz etmek için konfokal mikroskopinin kullanılması önerilmiştir. Bu teknik, PLC, Akt, Rab 5 ve Rab 7 dahil olmak üzere spesifik floresan proteinlerini eksprese eden hücreleri incelememizi ve daha sonra farklı enfeksiyon sonuçlarıyla ilgili unsurları tanımlamak için bu proteinlerin Leishmania izolatlarının fagositozuna katılımını değerlendirmemizi sağlar.
Bu çalışmada, enfeksiyonun erken evrelerinde L. braziliensis fagositozunu değerlendirmek için primer makrofajlar ve THP1 hücreleri kullanılmıştır. Şu anda tarif edilen protokol, Leishmania spp.'deki fagositozu incelemek için de kullanılabilir. dendritik hücreler, monositler, makrofaj hücre hatları ve insan periferik kanından türetilen nötrofiller dahil olmak üzere diğer fagositler tarafından. Parazit içselleştirme işlemi sırasında, hücre zarı yüzeyinde F-aktin'de dinamik bir değişiklik meydana gelir11. Daha sonra, Şekil 4'te gösterildiği gibi, Leishmania'nın konakçı hücrelere bağlanma aşamasını gözlemlememize izin veren floresan PLC gibi spesifik bir fagositoz36 belirteci kullanarak hücre zarında bulunan proteinleri etiketledik. CMTPX veya CSFE gibi floresan belirteçlerle parazitlerin boyanması, immünofloresan yoluyla konakçı hücrelere parazit bağlanmasını değerlendirmek için de çok önemlidir. Bu tahlilin dikkatli bir şekilde uygulanmasını gerektirdiğine dikkat etmek önemlidir: i) oda sıcaklığında (25 ° C) yıkama çözeltileri kullanarak kapakları nazikçe yıkayın, aksi takdirde numuneler zarar görebilir; ii) reaktif seyreltmelerini tam olarak hazırlamak; ve iii) numuneleri ışıktan korumak34.
Optimum lazer heyecanı dalga boyuna yapılandırılmış bir konfokal mikroskop, yüksek kaliteli bir örnek görüntüsü elde edebilir. Etiketli hücreler karanlıkta 4 ° C'de haftalarca saklanabilir veya analiz zamanına kadar dondurulabilir. Fagositozu değerlendirmek için konfokal mikroskopinin kullanımı, uzun süreli maruz kalma süreleri ve numunelere zarar verebilecek yüksek yoğunluklu lazer ışınları ile sınırlıdır ve bazı durumlarda görüntülerde yüksek düzeyde arka plan tespitine yol açabilir35,37.
Bu çalışmada, Leishmania spp.'nin fagositozunu takip etmek için canlı görüntüleme kullanmak yerine, enfeksiyonun birkaç erken zamanında (30 dakika, 4 saat ve 12 saat) hücreleri sabitleyerek kinetik bir çalışma gerçekleştirdik. Canlı görüntülemenin, fagositoz da dahil olmak üzere sayısız hücresel sürecin mekansal ve zamansal dinamiklerini analiz etme potansiyeli ve statik görüntülerde gözlemlenemeyen ayrıntıları yakalama potansiyeli gibi bazı avantajlar sunduğu düşünülmelidir34. Bununla birlikte, canlı görüntüleme, mikroskobik bir odadaki sıcaklık, pH ve oksijen koşullarını kontrol etmek de dahil olmak üzere tüm deney süreci boyunca hücrelerin sağlıklı olmasını gerektirir. Bunun dünyadaki çeşitli laboratuvarlarda güvenilir bir şekilde gerçekleştirilemeyeceğini belirtmek önemlidir.
Tarif edilen nükleofeksiyon protokolü, daha önce M. B. Maess, B. Wittig ve S. Lorkowski 23 tarafından bildirildiği gibi, THP-1 hücrelerinin transfeksiyonunda etkinlik göstermiştir. Bu süreçte, hücre hasarını veya hücre canlılığındaki kaybı önlemek için hücreleri nazikçe ayırmak çok önemlidir. Deneyimlerimize dayanarak, transfeksiyon yapmadan önce hücreleri plakalardan ayırmak için enzimatik olmayan bir hücre ayrışma çözeltisi kullanmanızı öneririz. Orijinal protokol23'ün yazarları, bu prosedürün temel sınırlamalarının, nükleofeksiyon işlemi sırasında hücrelerin süspansiyonda olması ihtiyacı ve yetersiz ayrılmanın strese neden olabileceği gerçeği olduğunu belirtmektedir. Bu sınırlamalara rağmen, protokol güvenilir transfeksiyona izin verir ve hücre canlılığını kaybetmeden% 90 başarılı bir transfeksiyon oranına ulaşır.
PLC, Akt, Rab5 ve Rab7 dahil olmak üzere bir dizi endositik belirteç kullanılarak PV'lerin karakterizasyonu, Leishmania fagositozu hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için esastır. PV biyogenezine katılan yeni proteinlerin tanımlanması ve bu bölmelerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi, Leishmania spp. enfeksiyonu sırasında makrofaj yanıtındaki farklılıkları açıklığa kavuşturabilir. Sonuçlarımızın Leishmania enfeksiyonu sonucunu çevreleyen bilgi birikimine katkısı şüphesiz Leishmania enfeksiyonunun patogenezi hakkındaki anlayışımızı ilerletecek ve yeni kemoterapötik hedefler için nihai arayışı destekleyecektir. Bu tekniğin, bakteriler, mayalar veya birçok hücre türü tarafından boncuk yutulması da dahil olmak üzere diğer çalışma türlerine de genişletilebileceğini belirtmek gerekir38,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama veya analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Gonçalo Moniz Enstitüsü, Fiocruz Bahia, Brezilya ve mikroskopi bölümüne yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma INOVA-FIOCRUZ numarası 79700287000 tarafından desteklenmiştir, P.S.T.V. CNPq'dan (305235/2019-2) araştırmalarda verimlilik için bir hibeye sahiptir. Plazmidler Mauricio Terebiznik, Toronto Üniversitesi, CA tarafından nazikçe sağlandı. Yazarlar, İngilizce revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
