Summary
リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。
Abstract
貪食作用は、認識、結合、および内在化という別個のステップを含む、調整されたプロセスです。プロの貪食細胞は、複数の宿主細胞受容体によって寄生虫表面上のリガンドを認識することからなる、貪食作用によって リーシュマニア 寄生虫を取り込む。 リーシュマニア のマクロファージ膜への結合は、補体受容体1型(CR1)および補体受容体3型(CR3)およびパターン認識受容体を介して起こる。リポホスホグリカン(LPG)および63kDa糖タンパク質(gp63)は、マクロファージ-リーシュマニア 相互作用に関与する主なリガンドである。宿主細胞受容体による寄生虫リガンドの最初の認識に続いて、寄生虫は内在化し、生存し、寄生性液胞内で増殖する。 リーシュマニア誘発液胞の成熟過程は、単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)、リソソーム関連膜タンパク質2(LAMP-2)、および微小管関連タンパク質1A/1B-軽鎖3(LC3)を含む細胞内小胞からの分子の獲得を含む。
ここでは、(i)結合(ii)インターナリゼーション、および(iii)ファゴソーム成熟を含む、共焦点顕微鏡法を用いて宿主細胞との リーシュマニア 相互作用中に生じる初期事象を評価する方法について説明する。感染転帰のこれらの決定要因を取り巻く知識体系に追加することにより、 我々はリーシュマニア 感染の病因の理解を改善し、新規化学療法標的の最終的な探索を支援することを望んでいる。
Introduction
リーシュマニア症は、 リーシュマニア属の原生動物寄生虫によって引き起こされる顧みられない熱帯病であり、脊椎動物宿主において、皮膚リーシュマニア症、皮膚粘膜リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症を含む広範囲の臨床症状をもたらす1。世界保健機関(WHO)は、10億人以上の人々が危険にさらされており、年間100万人以上の新規症例が報告されていると推定しています2。
リーシュマニア属菌は、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む宿主細胞内で生存する義務性細胞内原生動物である3。リーシュマニア-マクロファージ相互作用は、直接相互作用を介して、または補体受容体を含むオプソニゼーションによって、複数の宿主細胞受容体および寄生虫リガンドを含む複雑なプロセスである4,5。CR1、CR3、マンノースフコース、フィブロネクチン、トール様およびスカベンジャー受容体などの古典的な表面受容体は、マクロファージへの寄生虫付着を媒介する6、7、8。これらの受容体は、63kDa糖タンパク質(gp63)および糖脂質リポホスホグリカン(LPG)9を含むリーシュマニアの表面上の分子を認識する。これらは、プロマスチゴテスの表面上で最も豊富な分子であり、宿主免疫応答の転覆に不可欠な役割を果たし、哺乳動物細胞における寄生虫感染の確立を促進する10。寄生虫表面リガンドがマクロファージ受容体に結合すると、F-アクチンは哺乳類の細胞表面に蓄積し、寄生虫が貪食されるにつれて寄生虫を取り囲む。続いて、これは寄生刺激性液胞(PV)と呼ばれる寄生虫誘発区画の形成をもたらし、これはファゴリソソームの特徴11を提示する。これらのファゴリソソームの内部に入ると、寄生虫は生存と増殖に不可欠ないくつかの変化を経験する3。
PVの生合成は、この病原体の細胞内生存に不可欠な高度に調節された膜輸送プロセスである12。このコンパートメントの形成は、宿主エンドサイトーシス経路のファゴソームとコンパートメントとの間の逐次的な融合事象から生じる。古典的な細胞生物学研究は、PVの成熟が単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7タンパク質の獲得を含むことを明らかにしており、これらはそれぞれ初期および後期エンドソーム成熟にそれぞれ関連している13。さらに、これらの区画は、リソソーム膜の主要タンパク質構成成分であるリソソーム関連膜タンパク質1および2(LAMP 1、LAMP 2)およびオートファゴソームマーカー14である微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3(LC3)を獲得する。明らかな類似性にもかかわらず、PV形成15,16の動態およびこれらの区画の形態は、リーシュマニア種によって異なる。例えば、L. mexicanaまたはL. amazonensisによって引き起こされる感染は、多数の寄生虫を含む大きな区画の形成を誘導する17。対照的に、L. braziliensisやL. infantumなどの他の種は、通常、各液胞に1つまたは2つの寄生虫のみを含むより小さな液胞を形成する18。
宿主細胞とリーシュマニア の相互作用に関するこの知識にもかかわらず、宿主受容体と寄生虫リガンドとの間の接触によって引き起こされる初期事象は完全には解明されていない。これらの事象は、寄生虫感染の結果の決定因子であることが知られており、寄生虫種、寄生虫を認識するために動員される宿主細胞受容体のタイプ、およびマクロファージシグナル伝達経路の活性化に依存する19、20。したがって、 リーシュマニア誘発PVの生合成に関与する分子を同定し、感染の確立および転帰においてこれらの分子が果たす役割を決定することが不可欠である。ここでは、結合、内在化、ファゴソーム形成および成熟を含む、 リーシュマニアの貪食作用の間に起こる初期事象をモニターする方法について説明する。この研究は、異なる リーシュマニア 種によって誘導されるPVの形成におけるPLC、Akt、Rab5、Rab7およびLC3の関与を明らかにするのに役立つ可能性がある。重要なことに、このプロトコルは、PV成熟に関与する他のタンパク質の関与を調査するために使用することができる。今後の研究は、 リーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムに関する知識を広げ、新しい化学療法戦略の設計に貢献するでしょう。
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Protocol
細胞は、国家研究倫理委員会(ID:94648218.8.0000.0040)による手順の承認に従って、健康なドナーから入手した。
1. 細胞培養
- ヒト単球由来マクロファージ
注:マクロファージへの in vitro 分化のためのヒト単球由来マクロファージを得るには、健康なドナーから血液を採取し、D. EnglishおよびB. R. Andersen21によって記述されているように末梢血単核球(PBMC)を精製する。- 末梢血(50mL)を採取した後、ヘパリン処理チューブに注ぎ、室温でリン酸緩衝液(PBS)で血液を1:1希釈する。希釈したヘパリン化血液を、以前に分布した密度勾配媒体の上に静かに置きます。
- 溶血を避けるために、チューブを252 × g で24°Cで30分間遠心分離します。
注: 遠心分離機ブレークオフを設定して、グラデーション層の混合を回避します。遠心分離後、赤血球、密度勾配培地、PBMCリングおよび血漿:下から上に不連続な勾配層が形成される。 - 密度勾配媒体とプラズマ層の間に位置するPBMCリングを新しいチューブに移し、PBSで満たして過剰な密度勾配媒体を洗い流します。
- 細胞を1回洗浄し、190×gで4°Cで10分間遠心分離する。
- 上清を捨て、ペレットを1mLの完全RPMI培地に再懸濁する。
- 25 mM N-[2×-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N′-[2-エタンスルホン酸](HEPES)、2 g/L炭酸水素ナトリウム、2 mM グルタミン、20 g/mLシプロフロキサシンおよび10%不活化ウシ胎児血清(FBS)(完全RPMI培地)を24ウェルプレート中で5%CO2未満で37°Cで7日間、37°Cで5%CO2未満で7日間、細胞とプレート2を計数し、24ウェルプレートで5%CO2未満で7日間、単球をマクロファージに分化させる接着によって。
- THP-1カルチャー
- 75cm2培養フラスコ中の10mLの完全RPMI培地中で2×105細胞の濃度でTHP-1細胞株を増殖させる。
- 細胞培養物を37°Cのインキュベーター内で5%CO2 下で7日間維持する。
- 細胞を720×gで4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを完全RPMI培地に再懸濁した。
- ノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
- 13 mmガラスカバーグラス上のプレート細胞を、5 %CO2下で37°Cで100 nMホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)を含む500 μLの完全RPMI培地中で、1ウェルあたり2 × 105細胞の濃度で、THP1細胞のマクロファージへの分化を可能にする。
- 3日後、細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、PMAを含む培地を除去した。
- 分化したTHP-1細胞をPMA非含有完全RPMI培地中で、5%CO2 下で37°Cでさらに2日間インキュベートしてから実験を開始する。
2. 寄生虫培養とセルトラッカーレッド染色
注:蛍光顕微鏡で寄生虫を可視化するには、CellTracker 赤色蛍光色素(CMTPX)を使用して染色を実行します。あるいは、カルボキシフルオレセインを含む他のマーカーは、製造業者の指示に従って、またはGFP、RFP、または他の蛍光レポーター遺伝子を恒常的に発現するプロマスチゴットを使用することができる。細胞に感染するために使用される寄生虫は、7継代以下のプロマスティゴート軸索培養物から得られる増殖の固定期にあるものである。
- リーシュマニア属を育てる。 50 μg/mLのゲンタマイシンおよび10%FBSを添加した5 mLのシュナイダー培地を含む細胞培養フラスコ中の培地1,000 μLあたり1 x 105の寄生虫でプロマスチゴテス。
- 寄生虫軸索培養物を24°Cの生化学的酸素要求量(B.O.D.)中でインキュベートした後、ノイバウアーチャンバー内で毎日計数を行う。寄生虫の形態(薄く、細長い)と可動性を5日間確認してください。寄生虫は、8時間の間隔で2つの連続したカウントが同様の量を表示する場合、成長の静止期にあると考えられる。
- 成長の固定期に達したら、4 mLの0.9%NaCl溶液に1 μM CMTPXを加え、光との接触を避けて5%CO2 下で37°Cで15分間インキュベートします。
- FBSを1:1の割合で加え、寄生虫懸濁液をさらに1分間インキュベートする。
- 寄生虫をPBSで3回洗浄し、続いて1,781 × gで10分間遠心分離する。
- 寄生虫ペレットを1,000 μLのRPMI完全培地に懸濁します。
- ノイバウアー室の寄生虫を数えます。
3. マクロファージに対する リーシュマニア 結合の評価
- 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを、13mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上の1ウェルあたり500μLの完全RPMI培地に塗布した。
- 細胞を37°Cで5%CO2下で24 時間培養する。
- 細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、完全なRPMI培地中で4°Cで10分間インキュベートする。
- A. L. Petersen22 によって記述されている固定相プロマスチゴットをウェルプレートに 10:1 の比率で加え、次いで 720 × g で 4 °C 下で 5 分間遠心分離します。
- 4°Cで5分間インキュベートする。
- 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、インターナライズされていないプロマスチゴットを除去します。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒド中で室温で15分間固定する。
- カバースリップを15 mM NH4Clと共に室温で15分間インキュベートします。
- PBS 0.15%ウシ血清アルブミン(BSA)で3回洗う。ブロッキング溶液(PBS中の3%BSA)と共に室温で1時間インキュベートする。
- PBSで3回洗った後、0.15%PBS-サポニンで室温で15分間透過処理します。
- ファロイジン(希釈1:1,200)を室温で1時間加え、光から保護する。
- カバースリップは、取り付けメディアを使用して取り付けます。
- 63×/1.4の対物レンズを用いて共焦点蛍光顕微鏡で画像を取得します。
4. マクロファージによる リーシュマニア 貪食作用の評価
- 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを、13mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上の1ウェルあたり500μLの完全RPMI培地に塗布した。
- 細胞を5%CO2下で37°Cで24時間培養する。
- 細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、24ウェルプレート中の完全RPMI培地中で4°Cで10分間インキュベートする。
- A. L. Petersen22によって記述された固定相リーシュマニア属菌を10:1(寄生虫:宿主細胞)比で加え、次いで720×gで4°C下で10分間遠心分離する。
- 細胞を4°Cで5分間インキュベートする。
- 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、インターナライズされていないプロマスチゴットを除去します。
- 補充されたRPMI培地中で細胞を37°Cで1時間インキュベートする。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定する。
- カバースリップは、お好みの取り付け用メディアを使用して取り付けます。
- 100×/1.4 対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下でランダム フィールドで 400 個以上の細胞をカウントします。
5. リーシュマニア 誘発液胞成熟の評価
注:THP-1細胞トランスフェクションは、M. B. Maess、B. WittigおよびS. Lorkowski 23によって記述されているように実施されるべきである。ここでは、このプロトコルを最小限の変更で要約します。ヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクターを必要とする特定のトランスフェクション法です。代替方法として、細胞は、リポフェクタミン24 およびレンチウイルス形質導入25を用いてトランスフェクトされ得る。
- リーシュマニア誘導PVの生合成を調べるために、THP1細胞をPLC 26、27、Akt26、27、Rab 5 28、29、30またはRab 728、29、31プラスミドでトランスフェクトします。
注:この方法論は、THP-1細胞を上記以外の遺伝子でトランスフェクトするために使用することができる。 - 100 ng/mL PMA および 50 μM 2-メルカプトエタノールを 48 時間添加した 10 mL 完全 RPMI 培地を含む75 cm² 組織培養フラスコに 1.5 x 107 個の THP-1 細胞をシードします。
- 細胞を0.9%NaCl溶液で1回洗浄する。
- 非酵素細胞解離溶液を用いて細胞を剥離し、室温で5分間遠心分離機(250×g)する。
- THP-1細胞を1mLのRPMI培地に再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内でカウントを行う。
- THP-1細胞を再び250×gで室温で10分間遠心分離する。上清を捨てる。
- 2 ×106 個の細胞を 100 μL の Nucleofector 溶液に再懸濁し、蛍光タンパク質でタグ付けされた目的のタンパク質をコードするプラスミドを 0.5 μg と共にインキュベートします。
- THP-1細胞および核酸を含む懸濁液をヌクレオフェクターキュベットに移す。
- ヌクレオフェクタープログラムY-001を用いてTHP1細胞をトランスフェクトする。
- トランスフェクションした細胞(2x106)を回収し、13 mmガラスカバースリップ(4ウェル/トランスフェクション)を備えた24ウェルプレート上の500 μL RPMI培地にシードします。
- THP-1細胞を完全RPMI培地中で37°Cで0.5、2、4、6、12および24時間インキュベートする。
- 手順 3.13 と 3.13 を繰り返します。
6. リーシュマニア 属PVへのLC3の募集の評価
注:オートファジー膜マーカーLC3は、ファゴソームがオートファジー機能を示すかどうかを調べるために使用することができる。 リーシュマニア誘発PVsへのLC3動員は、C. Matte 32およびB. R. S. Dias33 によって以前に記載されたように、抗LC3抗体による免疫標識細胞によって感染中に評価することができる。
- 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを500 μL完全RPMI培地中、13 mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上に塗布します。
- 細胞を5%CO2下で37°Cで24時間培養する。
- 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、完全なRPMI培地中でインキュベートする。
- A. L. Petersen22によって記載されているように固定期Leishmania spp. promastitesを10:1(寄生虫:宿主細胞)比で加え、細胞を720×gで4°C下で5分間遠心分離する。
- 37°Cで30分または4時間インキュベートする。その後、2回洗浄して細胞を固定し、感染の初期段階で リーシュマニア誘発PV膜へのLC3動員を評価した。
- あるいは、感染の後期段階でPV膜へのLC3動員を評価するために、感染の4時間で別のマクロファージ群を2回洗浄して、非内在化プロマスチゴットを除去する。感染細胞を完全RPMI培地中でさらに12時間および24時間インキュベートし、最後に2回洗浄して固定する。
注:固定細胞は、標識するまで4°CのPBSまたは0.9%NaCl溶液中に保持することができます。
- あるいは、感染の後期段階でPV膜へのLC3動員を評価するために、感染の4時間で別のマクロファージ群を2回洗浄して、非内在化プロマスチゴットを除去する。感染細胞を完全RPMI培地中でさらに12時間および24時間インキュベートし、最後に2回洗浄して固定する。
- 0.1% Triton X-100、1% BSA、20% 正常ヤギ血清、6% 脱脂粉乳、および 50% FBS で固定細胞を同時にブロックし、室温で 20 分間透過させます。
- PBSで希釈した抗LC3抗体(1:200)で細胞を室温で2時間インキュベートする。
注:免疫染色のネガティブコントロールとして、一次抗体起源の動物由来の免疫グロブリンG(IgG)と一次抗体に使用した濃度と同等の濃度で細胞群をインキュベートする必要があります。 - 室温で0.9%NaCl溶液で細胞を3回洗浄する。
- AlexaFluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG(1:500)または好ましい蛍光色素結合二次抗体と細胞を室温で1時間インキュベートする。
- 室温で0.9%NaCl溶液で細胞を3回洗浄する。
- カバースリップは、お好みの取り付け用メディアを使用して取り付けます。
- 63x/1.4対物レンズを使用して共焦点蛍光顕微鏡で画像を取得します。
7. 共焦点顕微鏡の取得とフィジーの定量化
注:免疫蛍光画像の取得は、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して実行する必要があります。より良い解像度を得るには、油浸63x対物レンズを使用してください。
- 13 mm のガラス製カバースリップは室温で放置し、取得の少なくとも 30 分前に光から保護します。
- カバースリップを吸収性ティッシュで拭きます。
- 目的物に浸漬油を一滴加え、スライドを追加します。
- オイルがスライドに触れるまで、対物レンズを上に動かします。
- 顕微鏡で焦点を観察して調整し、オイルで63x対物レンズオプションを選択します。
- Leica プログラムを開き、488、552、および 405 波長のレーザーを調整します。
- 画像解像度 1,024 x 1,024 を選択します。
- [ ライブ ]ボタンをクリックし、Zスタックを設定して、[ 開始] オプションを押します。次に、もう一度やり直して 、終了 ボタンを押します。良好な解像度の共焦点画像を得るために、スライスの厚さに20μmを推奨します。
- 画像の取得を待ってから、Leicaツールの「最大投影」オプションを選択します。
- 実験を保存します。
- LIFまたはTIFF形式の画像をコンピュータにエクスポートし、FIJIプログラムを開きます。
- 実験を開き、ハイパースタックでビュースタックを設定します。次に、開いているファイルを個別に選択し、タイルをステッチします。
- フィジーのツールバーのフリーハンドツールを選択し、手でセルを慎重にトレースします。
- 分析ボタンを押して測定し、蛍光強度を視覚化します。
- グループごとに各セルに対してこのプロセスを繰り返します。
- 測定値を保存し、スプレッドシートエディタにエクスポートします。
- このデータを統計分析プログラムに追加し、統計分析を行います。
8. 統計解析
メモ: データ分析およびグラフィックスの場合は、統計分析プログラムを使用してください。
- プログラムを開きます。
- 得られたデータを挿入し、正規性パラメータをテストします。
- 正規分布のデータにはスチュー デントのt検定を使用し、ノンパラメトリック検定にはマン・ホイットニー検定を使用します。
- p値が0.05未満の場合に統計的に有意な差を持つデータを考えてみましょう。
- 中心傾向メジャー (平均または中央値) と変動メジャーを使用して、データを表すグラフィックスを準備します。
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Representative Results
この報告書は、L. braziliensis-LCLまたはL. braziliensis-DL形態のCLを提示する患者から単離されたL. braziliensisの貪食作用の間に起こる初期の事象を評価することを目的としており、共焦点顕微鏡を用いて、寄生虫の貪食に関連する主な事象(結合、内在化、および貪食成熟)を調査した。 我々はまず、ヒト単球由来マクロファージによるL.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラジリエンシス-DL結合および貪食作用を評価した。このデータは、L. braziliensis-LCLおよびL. braziliensis-DLの両方が同様にマクロファージに結合することを示している(図1)。また、宿主細胞によるL.ブラジリエンシス-LCLおよびL.ブラジリエンシス-DL貪食に関しても差は認められなかった(図2)。最後に、感染細胞におけるL.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラジリエンシス-DLによって誘導されるPVとLC3のリクルートを比較した。感染の30分後、4時間および12時間後、我々は、L.ブラジリエンシス-LCLおよびL.ブラジリエンシス-DL感染マクロファージにおいて、LC3装飾PVの同様の割合を観察した(図3)。これらの代表的な結果は、L. braziliensis-LCLおよびL. braziliensis-DLが、LC3のリクルートメントに関して、PVの結合、貪食作用、および生合成中にマクロファージと同様に相互作用することを示した。
PLC-GFP、Rab5-GFP、Rab7-GFPプラスミドを効率的にトランスフェクトしたTHP-1細胞を表す顕微鏡像を 図4に示す。
図1.ヒトマクロファージへのL.ブラジリエンシス-LCLおよびL.ブラジリエンシス-DL結合の評価。ヒト単球由来マクロファージは、L.ブラジリエンシス-LCL-またはL.ブラジリエンシス-DLに感染した。4°Cで10分後、結合を共焦点顕微鏡により評価した。(A)マクロファージに結合するL. braziliensis-LCLまたはL. braziliensis-DL(CMTPXで標識、赤色)の共焦点顕微鏡画像(ファロイジンで標識、緑色)。共焦点顕微鏡観察のために、細胞核はDAPI(青色)で標識された。矢印はリーシュマニア-マクロファージ結合を描いている。(B)マクロファージに結合するリーシュマニアの割合。1群あたり合計30個の細胞を解析した。データは、五重奏で実施された1つの実験の各反復を表す(不対t検定、p>0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.ヒトマクロファージによるL.ブラジリエンシス-LCLおよびL.ブラジリエンシス-DL貪食作用の評価。ヒト単球由来マクロファージを、L.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラジリエンシス-DLと共に4°Cで10分間インキュベートし、続いて37°Cでさらに1時間インキュベートした。 次いで、細胞を、合計400個の細胞を計数することによって蛍光顕微鏡によって分析した。(A)L.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラジリエンシス-DLに感染したヒトマクロファージの共焦点顕微鏡像。共焦点顕微鏡観察のために、細胞核はDAPI(青色)で標識された。矢印はリーシュマニア寄生虫核を描いています。(B)リーシュマニア貪食の割合。円は、3連で実施された1つの実験の各反復からのデータを表す(不対t検定、p>0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.マクロファージにおけるL. braziliensi s-LCLまたはL. braziliensis-DLによって誘導されたPVへのLC3リクルートメントの評価。ヒト単球由来マクロファージを感染させ、次いで抗LC3抗体で30分間、4時間および12時間染色した(A)抗LC3で標識したL.ブラジリエンシs-LCLまたはL.ブラジリエンシス-DL感染マクロファージの共焦点顕微鏡像、続いてAlexa Fluor 488(緑色)にコンジュゲートした二次抗ウサギIgG抗体。共焦点顕微鏡検査のために、細胞核はDAPI(青色)で標識された。(B) L. braziliensi s-LCL または L. braziliensis-DL 誘導PV に LC3-II を装飾した割合。1群あたり合計30個の細胞を解析した。円は、分析されたランダムに選択された各フィールドに対応する(不対t検定、p>0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.PLC、Rab5またはRab7を発現するTHP-1細胞。 マクロファージに分化した後、THP-1細胞を、目的の各遺伝子をGFP蛍光プローブ(PLC、Rab5およびRab7)に結合させてヌクレオフェクションを行った。その後、これらの細胞を固定し、核をDAPI(青色)で染色し、63x/1.4対物レンズを用いて共焦点顕微鏡下で観察した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
リーシュマニアとマクロファージの相互作用は複雑なプロセスであり、疾患の発症に影響を与える可能性のあるいくつかのステップを伴います5。オプソニン化されていないリーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムをよりよく理解するために、我々は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いてリーシュマニア感染の初期段階から後期段階までの貪食作用を評価するプロトコルを記載した。免疫標識や蛍光標識タンパク質の発現など、細胞生物学のメカニズムを調べるために2つ以上の蛍光色素を含む蛍光技術を使用することで、複数のタンパク質の位置を解析し、同時に細胞形態を評価することができます。これらの方法によって提供される利点は、それらを病原体 - 宿主細胞相互作用を監視するための最良のツールにする34。
異なる粒子を含む貪食プロセスをよりよく理解するためには、この非常に動的なプロセスを分子レベル35で分析することが重要です。焦点蛍光顕微鏡は、この目的のために何十年もの間使用されており、インターナライズされた粒子の数、または宿主-病原体相互作用の初期段階に関与することが知られているタンパク質の種類を決定することによって、貪食作用を定量化するための優れたツールであることが示されている34。本研究は、異なる臨床形態(LCLおよびDL)を有する患者から単離された L.ブラジリエンシス の貪食中に生じる事象を分析するために共焦点顕微鏡の使用を提案した。この技術により、PLC、Akt、Rab 5、およびRab 7を含む特定の蛍光タンパク質を発現する細胞を研究し、その後、 リーシュマニア 分離株の貪食作用におけるこれらのタンパク質の関与を評価して、異なる感染転帰に関連する要素を同定することができます。
本研究では、初代マクロファージとTHP1細胞を用いて、感染の初期段階におけるL.ブラジリエンシス貪食作用を評価した。現在記載されているプロトコールは、樹状細胞、単球、マクロファージ細胞株、およびヒト末梢血由来の好中球を含む他の貪食細胞によるリーシュマニア属菌における貪食作用を研究するためにも使用することができる。寄生虫インターナリゼーションプロセスの間、F−アクチンの動的変化が細胞膜表面11で起こる。次に、蛍光PLCなどの貪食作用36の特異的マーカーを使用して細胞膜に位置するタンパク質を標識し、図4に示すように、リーシュマニアの宿主細胞への結合段階を観察することができました。CMTPXやCSFEなどの蛍光マーカーで寄生虫を染色することも、免疫蛍光による宿主細胞への寄生虫の結合を評価するために重要です。このアッセイには慎重な実行が必要であることは注目に値します:i)室温(25°C)で洗浄溶液を使用してカバースリップを穏やかに洗浄し、そうでなければサンプルが損傷する可能性があります。ii)試薬希釈液を正確に調製する工程;iii)サンプルを光34から保護する。
最適なレーザー励起波長に構成された共焦点顕微鏡は、高品質のサンプル画像を得ることができる。標識細胞は、4°Cの暗所で数週間保存するか、または分析時まで凍結することができる。貪食作用を評価するための共焦点顕微鏡の使用は、長時間の露光および高強度レーザービームによって制限され、サンプルを損傷し、場合によっては画像中の高レベルのバックグラウンド検出につながる可能性がある35,37。
本研究では、 リーシュマニア 属菌の貪食作用を追跡するためにライブイメージングを用いる代わりに、感染の初期に数回(30分、4時間、および12時間)に細胞を固定することによって速度論的研究を行った。ライブイメージングは、貪食作用を含む無数の細胞プロセスの空間的および時間的ダイナミクスを分析する可能性、および静止画像では観察できない詳細をキャプチャする可能性など、いくつかの利点を提供すると考慮しなければならない34。しかし、ライブイメージングでは、顕微鏡チャンバー内の温度、pH、酸素条件の制御など、実験プロセス全体を通して細胞が健康であることが必要です。これは、世界中のいくつかの研究所で確実に実施できないことに注意することが重要です。
記載されたヌクレオフェクションプロトコルは、M. B. Maess、B. WittigおよびS. Lorkowski 23によって以前に報告されたように、THP-1細胞のトランスフェクションにおける有効性を実証した。このプロセスでは、細胞の損傷や細胞生存率の低下を避けるために、細胞を穏やかに剥離することが重要です。私たちの経験に基づいて、トランスフェクションを実行する前に、非酵素細胞解離溶液を使用してプレートから細胞を剥離することをお勧めします。元のプロトコル23 の著者らは、この手順の主な制限は、ヌクレオフェクションプロセス中に細胞が懸濁状態にある必要性、および不適切な剥離がストレスを引き起こす可能性があるという事実であると述べている。これらの制限にもかかわらず、このプロトコルは信頼性の高いトランスフェクションを可能にし、細胞生存率を失うことなく90%のトランスフェクション率を達成します。
PLC、Akt、Rab5、およびRab7を含む一連のエンドサイトーシスマーカーを用いたPVの特性評価は、リーシュマニア貪食作用の理解を深めるために不可欠です。PV生合成に関与する新しいタンパク質を同定し、これらのコンパートメントを包括的に特徴付けることで、リーシュマニア属菌感染時のマクロファージ応答の違いを明らかにすることができる。リーシュマニア感染の結果を取り巻く知識体系への我々の結果の貢献は、間違いなくリーシュマニア感染の病因に関する我々の理解を前進させ、新規化学療法標的の最終的な探索を支持するであろう。この技術は、細菌、酵母、または多くの種類の細胞によるビーズの巻き込みによる感染を含む、他のタイプの研究にも拡張できることは注目に値します38,39。
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Disclosures
資金提供者は、研究デザイン、データ収集または分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も持っていませんでした。著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に実施されたことを宣言する。
Acknowledgments
Gonçalo Moniz Institute、Fiocruz Bahia、ブラジル、顕微鏡検査部門の支援に感謝します。この研究は、INOVA-FIOCRUZ番号79700287000によって支援され、P.S.T.V.はCNPq(305235/2019-2)から研究における生産性のための助成金を保持しています。プラスミドは、カリフォルニア州トロント大学のMauricio Terebiznikによって親切に提供されました。著者らは、英語の改訂と原稿のコピーエディットの支援について、Andris K. Walter 氏に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A.
- World Health Organization.
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D.
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G.
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
