Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Исследование фагоцитоза лейшмании с помощью конфокальной микроскопии

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania , остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами.

Abstract

Фагоцитоз — это организованный процесс, который включает в себя различные этапы: распознавание, связывание и интернализацию. Профессиональные фагоциты поглощают паразитов Лейшмании путем фагоцитоза, состоящего из распознавания лигандов на поверхностях паразитов несколькими рецепторами клеток-хозяев. Связывание лейшмании с мембранами макрофагов происходит через рецептор комплемента типа 1 (CR1) и рецептор комплемента типа 3 (CR3) и рецепторы распознавания образов. Липофосфогликан (LPG) и гликопротеин 63 кДа (gp63) являются основными лигандами, участвующими во взаимодействиях макрофагов и лейшмании . После первоначального распознавания лигандов паразитов рецепторами клеток-хозяев паразиты интернализируются, выживают и размножаются в паразитофорных вакуолях. Процесс созревания вакуолей, индуцированных лейшманией, включает в себя приобретение молекул из внутриклеточных везикул, включая мономерный G-белок Rab 5 и Rab 7, лизосомально-ассоциированный мембранный белок 1 (LAMP-1), лизосомно-ассоциированный мембранный белок 2 (LAMP-2) и микротрубочко-ассоциированный белок 1A/1B-легкая цепь 3 (LC3).

Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами с использованием конфокальной микроскопии, включая (i) связывание,ii) интернализацию и (iii) созревание фагосом. Добавляя к совокупности знаний, окружающих эти детерминанты исхода инфекции, мы надеемся улучшить понимание патогенеза инфекции Leishmania и поддержать возможный поиск новых химиотерапевтических целей.

Introduction

Лейшманиоз является запущенным тропическим заболеванием, вызываемым простейшими паразитами рода Leishmania, приводящим к широкому спектру клинических проявлений у позвоночного хозяина, включая кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз и висцеральный лейшманиоз1. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда человек находятся в группе риска, причем более одного миллиона новых случаев регистрируются в год2.

Leishmania spp. являются облигатными внутриклеточными простейшими, которые выживают внутри клеток-хозяев, включая моноциты, макрофаги и дендритные клетки3. Взаимодействие лейшмании и макрофагов представляет собой сложный процесс, который включает в себя несколько рецепторов клеток-хозяев и лигандов паразитов либо путем прямого взаимодействия, либо путем опсонизации с участием рецепторов комплемента 4,5. Классические поверхностные рецепторы, такие как CR1, CR3, манноза-фукоза, фибронектин, толл-подобные и поглотители рецепторов, опосредуют прикрепление паразитов к макрофагам 6,7,8. Эти рецепторы распознают молекулы на поверхности лейшмании, включая гликопротеин 63 кДа (gp63) и гликолипидный липофосфогликан (LPG)9. Это наиболее распространенные молекулы на поверхности промастиготов и играют важную роль в подрыве иммунного ответа хозяина, способствуя установлению паразитарной инфекции в клетках млекопитающих10. После того, как поверхностные лиганды паразитов связываются с рецепторами макрофагов, F-актин накапливается на клеточных поверхностях млекопитающих, окружающих паразитов по мере их фагоцитоза. Впоследствии это приводит к образованию паразитарно-индуцированного компартмента, называемого паразитофорной вакуолей (PV), который представляет фаголисосомальные признаки11. Попав внутрь этих фаголизосом, паразиты претерпевают несколько изменений, необходимых для выживания и размножения3.

Биогенез PV представляет собой высоко регулируемый процесс мембранного трафика, критически важный для внутриклеточной выживаемости этого патогена12. Образование этого компартмента происходит в результате последовательных слияний между фагосомами и компартментами эндоцитарного пути хозяина. Классические исследования клеточной биологии показали, что созревание PV включает в себя приобретение мономерного G-белка Rab 5 и rab 7 белков, которые в основном связаны с ранним и поздним созреванием эндосом соответственно13. Кроме того, эти компартменты приобретают лизосомно-ассоциированные мембранные белки 1 и 2 (LAMP 1, LAMP 2), основные белковые составляющие лизосомальной мембраны и микротрубочки-ассоциированный белок 1A/1B-световая цепь 3 (LC3), аутофагосомный маркер14. Несмотря на кажущееся сходство, кинетика PV-образования15,16 и морфология этих компартментов варьируются в зависимости от вида Leishmania. Например, инфекция, вызванная L. mexicana или L. amazonensis, вызывает образование крупных компартментов, содержащих большое количество паразитов17. Напротив, другие виды, такие как L. braziliensis и L. infantum, образуют более мелкие вакуоли, которые обычно содержат только одного или двух паразитов в каждой вакуоле18.

Несмотря на эти знания, связанные с взаимодействием клетки-хозяина и лейшмании, первоначальные события, вызванные контактом между рецепторами хозяина и лигандами паразитов, не были полностью выяснены. Эти события, как известно, являются детерминантами исхода заражения паразитами и зависят от видов паразитов, типа рецепторов клеток-хозяев, набираемых для распознавания паразитов, и активации сигнальных путей макрофагов19,20. Поэтому важно идентифицировать молекулы, участвующие в биогенезе Индуцированных Лейшманией ПВ, и определить роль (роли), которую играют эти молекулы в установлении инфекции и исходе. Здесь мы описываем метод мониторинга ранних событий, происходящих во время фагоцитоза лейшмании, включая связывание, интернализацию, образование и созревание фагосом. Эта работа может помочь прояснить участие PLC, Akt, Rab5, Rab7 и LC3 в формировании PV, индуцированных различными видами Leishmania. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования участия других белков, участвующих в pv-созревании. Будущие исследования расширят знания, связанные с механизмами, участвующими во взаимодействии клеток лейшмании и хозяина, и внесут вклад в разработку новых химиотерапевтических стратегий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Клетки были получены от здоровых доноров после утверждения процедур Национальными комитетами по этике исследований (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Клеточные культуры

  1. Макрофаги, полученные из моноцитов человека
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить макрофаги человеческого моноцитарного происхождения для дифференцировки in vitro в макрофаги, соберите кровь у здоровых доноров и очистите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), как описано D. English и B. R. Andersen21.
    1. После сбора периферической крови (50 мл) влейте ее в гепаринизированную пробирку и затем разбавьте кровь 1:1 в фосфатно-буферном растворе (ПБС) при комнатной температуре. Осторожно поместите разбавленную гепаринизированную кровь поверх ранее распределенной среды градиента плотности.
    2. Центрифугируйте пробирки при 252 × г в течение 30 мин при 24 °C, чтобы избежать гемолиза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите обрыв центрифуги, чтобы избежать смешивания градиентных слоев. После центрифугирования снизу вверх образуются прерывистые градиентные слои: эритроциты, среда градиента плотности, кольцо ПБМЦ и плазма.
    3. Перенесите кольцо PBMC, расположенное между средой градиента плотности и слоями плазмы, в новую трубку и заполните PBS для вымывания избыточной среды градиента плотности.
    4. Промыть ячейки однократно и центрифугировать при 190 × г в течение 10 мин при 4 °С.
    5. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте гранулы в 1 мл полной среды RPMI.
    6. Подсчитайте клетки и пластинку 2 × 106 клеток в 500 мл Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI), дополненных 25 мМ N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этановая сульфоновая кислота] (HEPES), 2 г / л бикарбоната натрия, 2 мМ глутамина, 20 г / мл ципрофлоксацина и 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) (полная среда RPMI) в течение 7 дней при 37 °C при 5% CO2 в 24-луночной пластине, чтобы позволить моноцитам дифференцироваться в макрофаги по адгезии.
  2. Культуры ТХП-1
    1. Выращивают клеточную линию THP-1 в концентрации 2 × 105 клеток в 10 мл полной rpmI среды в колбе культуры 75см2 .
    2. Поддерживайте клеточные культуры в инкубаторе при 37 °C при 5% CO2 в течение 7 дней.
    3. Центрифужные ячейки при 720 × г в течение 10 мин при 4 °C и повторное суспендирование гранулы в полной rpmI среде.
    4. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра.
    5. Пластинчатые ячейки на 13 мм стеклянных крышках в концентрации 2 × 105 клеток на лунку в 500 мкл полной rpmI среды, содержащей 100 нМ формбол миристата ацетата (ПМА) при 37 °C при 5% CO2 , чтобы обеспечить дифференцировку клеток THP1 в макрофаги.
    6. Через три дня дважды промыть клетки 0,9% раствором NaCl для удаления среды, содержащей ПМА.
    7. Инкубировать дифференцированные клетки THP-1 в полной среде RPMI без PMA при 37 °C при 5% CO2 в течение дополнительных 2 дней до начала экспериментов.

2. Культуры паразитов и окрашивание CellTracker в красный цвет

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации паразитов с помощью флуоресцентной микроскопии выполните окрашивание с использованием флуоресцентного красителя CellTracker Red (CMTPX). Альтернативно, другие маркеры, включая карбоксифлуоресцеин, могут быть использованы в соответствии с инструкциями производителя или промастиготы, конститутивно экспрессирующие GFP, RFP или другие флуоресцентные репортерные гены. Паразитами, используемыми для заражения клеток, являются паразиты, находящиеся в стационарной фазе роста, полученные из промастиготной аксеневой культуры не более 7 проходов.

  1. Вырастите Leishmania spp. промастиготы при 1 х 105 паразитах на 1000 мкл среды в колбе клеточной культуры, содержащей 5 мл среды Шнайдера, дополненной 50 мкг/мл гентамицина и 10% FBS.
  2. После инкубации аксеновых культур паразитов при биохимической потребности в кислороде (B.O.D.) при 24 °C, выполните ежедневный подсчет в камере Нойбауэра. Проверьте наличие формы паразита (тонкой, удлиненной) и подвижности в течение 5 дней. Паразиты рассматриваются в стационарной фазе роста, когда два последовательных подсчета с интервалом 8 часов показывают одинаковые количества.
  3. По достижении стационарной фазы роста инкубируют паразитов в 4 мл 0,9% раствора NaCl с 1 мкМ CMTPX в течение 15 мин при 37 °C при 5% CO2 , избегая контакта со светом.
  4. Добавьте FBS в пропорции 1:1 и инкубируйте суспензию паразита в течение дополнительного 1 мин.
  5. Промыть паразитов трижды PBS с последующим центрифугированием при 1,781 × г в течение 10 мин.
  6. Ресуспендировать гранулы паразита в 1000 мкл полной среды RPMI.
  7. Подсчитайте паразитов в камере Нойбауэра.

3. Оценка связывания лейшмании с макрофагами

  1. Семя 2 × 105 клеток THP-1 или макрофагов, полученных из моноцитов человека, в 500 мкл полной среды RPMI на лунку на 24-луночной пластине с 13-миллиметровыми стеклянными крышками.
  2. Культивируют клетки при 37 °C при 5% CO2 в течение 24 ч.
  3. Дважды промыть клетки 0,9% раствором NaCl и инкубировать в полной среде RPMI при 4 °C в течение 10 мин.
  4. Добавьте стационарные фазовые промастиготы, как описано А. Л. Петерсеном22 в соотношении 10:1 к плитам скважины, а затем центрифугу при 720 × g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Инкубировать при 4 °C в течение 5 мин.
  6. Дважды промыть клетки 0,9% раствором NaCl, чтобы удалить любые неинтернализованные промастиготы.
  7. Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре.
  8. Инкубировать крышки с 15 мМ NH4Cl в течение 15 мин при комнатной температуре.
  9. Трижды промыть PBS 0,15% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубировать блокирующим раствором (3% BSA в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Трижды промыть PBS, а затем пермеабилизировать 0,15% PBS-сапонином в течение 15 мин при комнатной температуре.
  11. Добавляют фаллоидин (разбавленный 1:1 200) в течение 1 ч при комнатной температуре и защищают от света.
  12. Монтируйте крышки с помощью монтажных носителей.
  13. Получайте изображения с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с помощью объектива 63×/1.4.

4. Оценка фагоцитоза лейшмании макрофагами

  1. Семя 2 × 105 клеток THP-1 или макрофагов, полученных из моноцитов человека, в 500 мкл полной среды RPMI на лунку на 24-луночной пластине с 13-миллиметровыми стеклянными крышками.
  2. Культивируют клетки в течение 24 ч при 37 °C при 5% CO2.
  3. Промыть ячейки дважды в 0,9% растворе NaCl и инкубировать в полной среде RPMI в 24-луночной пластине при 4 °C в течение 10 мин.
  4. Добавьте стационарную фазу Leishmania spp., как описано A. L. Petersen22 в соотношении 10:1 (паразит:клетка-хозяин), а затем центрифугу при 720 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  5. Инкубировать клетки при 4 °C в течение 5 мин.
  6. Дважды промыть клетки 0,9% раствором NaCl, чтобы удалить любые неинтернализованные промастиготы.
  7. Инкубируют клетки в дополненной rpmI среде при 37 °C в течение 1 ч.
  8. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин.
  9. Монтируйте крышки с помощью предпочтительного монтажного носителя.
  10. Подсчитайте не менее 400 клеток в случайных полях под флуоресцентным микроскопом с помощью объектива 100×/1,4.

5. Оценка созревания вакуоли, вызванной лейшманией

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция клеток THP-1 должна выполняться в соответствии с описанием M. B. Maess, B. Wittig и S. Lorkowski 23. Здесь мы резюмируем этот протокол, с минимальными изменениями. Нуклеофекция — это специфический метод трансфекции, который требует нуклеофектора. В качестве альтернативного метода клетки могут быть трансфектированы с использованием липофектамина24 и лентивирусной трансдукции25.

  1. Для исследования биогенеза PV-индуцированных Лейшманией трансфектируют клетки THP1 с PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 или Rab 7 28,29,31 плазмидами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология может быть использована для трансфекции клеток THP-1 с другими генами, чем перечисленные выше.
  2. Семена THP-1 клеток при 1,5 х 107 в 75 см² тканевых культуральных колб, содержащих 10 мл полной rpmI среды, дополненной 100 нг/мл PMA и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола в течение 48 ч.
  3. Промывайте ячейки однократно в 0,9% растворе NaCl.
  4. Отделяйте клетки с помощью неферментативного раствора для диссоциации клеток и центрифуги (250 × г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Повторное суспендирование клеток THP-1 в 1 мл среды RPMI и выполнение подсчетов в камере Нойбауэра.
  6. Центрифуга THP-1 снова при 250 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте супернатант.
  7. Ресуспендировать 2 × 106 клеток в 100 мкл раствора нуклеофектора и инкубировать с 0,5 мкг плазмиды, кодирующей интересующий белок, помеченный флуоресцентным белком.
  8. Перенесите суспензию, содержащую клетки THP-1 и нуклеиновую кислоту, в кювету нуклеофектора.
  9. Трансфектируйте клетки THP1 с помощью программы нуклеофектора Y-001.
  10. Восстановите трансфектированные клетки (2x106) и посейте в 500-мкл RPMI-среде на 24-луночных пластинах со стеклянными крышками 13 мм (4 лунки/трансфекция).
  11. Инкубировать ячейки THP-1 в полной среде RPMI при 37 °C в течение 0,5, 2, 4, 6, 12 и 24 ч.
  12. Повторите шаги 3.13 и 3.13.

6. Оценка набора LC3 в Leishmania spp. PV

ПРИМЕЧАНИЕ: Аутофагический мембранный маркер LC3 может быть использован для исследования того, имеют ли фагосомы аутофагические особенности. Рекрутирование LC3 к Индуцированным Лейшманией ПВ может быть оценено во время инфекции клетками иммуномаркировки антителом против LC3, как описано ранее C. Matte32 и B. R. S. Dias33.

  1. Семена 2 × 105 клеток THP-1 или макрофагов, полученных из моноцитов человека, в полной среде RPMI объемом 500 мкл на 24-луночной пластине со стеклянными крышками диаметром 13 мм.
  2. Культивируют клетки в течение 24 ч при 37 °C при 5% CO2.
  3. Дважды промыть клетки в 0,9% растворе NaCl и инкубировать в полной среде RPMI.
  4. Добавьте стационарную фазу Leishmania spp. promastigotes, как описано A. L. Petersen22 в соотношении 10:1 (паразит: клетки-хозяева) и центрифужные клетки при 720 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин или 4 ч. Затем дважды промыть и зафиксировать клетки, чтобы оценить рекрутирование LC3 в PV-мембраны, индуцированные лейшманией, на ранних стадиях инфекции.
    1. В качестве альтернативы, чтобы оценить рекрутирование LC3 в PV-мембраны на более поздних стадиях инфекции, дважды промывайте другую группу макрофагов через 4 ч инфекции, чтобы удалить любые неинтернализованные промастиготы. Инкубируйте инфицированные клетки в полной среде RPMI в течение дополнительных 12 ч и 24 ч, чтобы, наконец, дважды промыть и зафиксировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ячейки можно хранить в PBS или 0,9% растворе NaCl при 4 °C до маркировки.
  6. Одновременно блокируют и пермеабилизируют фиксированные клетки в 0,1% Тритоне X-100, 1% BSA, 20% нормальной козьей сыворотке, 6% обезжиренном сухом молоке и 50% FBS в течение 20 мин при комнатной температуре.
  7. Инкубируют клетки антителом против LC3 (1:200), разведенным в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля иммуноокрашивания группу клеток следует инкубировать с иммуноглобулином G (IgG) животного первичного происхождения антител в концентрации, эквивалентной той, которая используется для первичного антитела.
  8. Трижды промыть клетки 0,9% раствором NaCl при комнатной температуре.
  9. Инкубируют клетки с AlexaFluor 488-конъюгированным козьим анти-кроликом IgG (1:500) или предпочтительным флуоресцентно-красителем конъюгированными вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Трижды промыть клетки 0,9% раствором NaCl при комнатной температуре.
  11. Монтируйте крышки с помощью предпочтительного монтажного носителя.
  12. Получайте изображения с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с помощью объектива 63x/1.4.

7. Получение конфокальной микроскопии и количественная оценка Фиджи

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение иммунофлуоресцентных изображений должно осуществляться с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Чтобы достичь лучшего разрешения, используйте объектив с масляным погружением 63x.

  1. Оставьте стеклянные крышки диаметром 13 мм при комнатной температуре и защитите их от света не менее чем за 30 минут до приобретения.
  2. Очистите обшивки абсорбирующей тканью.
  3. Добавьте каплю погружного масла к объекту и добавьте слайд.
  4. Перемещайте объектив вверх, пока масло не коснется слайда.
  5. Наблюдайте и регулируйте фокусировку на микроскопе и выбирайте вариант объектива 63x с маслом.
  6. Откройте программу Leica и отрегулируйте лазеры на длинах волн 488, 552 и 405.
  7. Выберите разрешение изображения 1,024 x 1,024.
  8. Нажмите кнопку Live , установите стек Z и нажмите кнопку Начать . Затем сделайте это еще раз и нажмите кнопку End . Мы рекомендуем 20 мкм для толщины среза, чтобы получить конфокальные изображения с хорошим разрешением.
  9. Дождитесь получения изображения, а затем выберите опцию «Максимальная проекция» в инструментах Leica.
  10. Сохраните эксперимент.
  11. Экспортируйте изображения в формате lif или tiff на компьютер и откройте программу FIJI.
  12. Откройте эксперимент и задайте стек представлений с гиперстеком. Затем выберите открывать файлы по отдельности и сшивайте плитки.
  13. Выберите инструмент «Свободные руки» на панели инструментов «Фиджи» и внимательно проследите ячейку вручную.
  14. Нажмите кнопку «Анализ» и измерьте, чтобы визуализировать интенсивность флуоресценции.
  15. Повторите этот процесс для каждой ячейки в группе.
  16. Сохраните измерения и экспортируйте их в редактор электронных таблиц.
  17. Добавьте эти данные в программу статистического анализа и сделайте статистический анализ.

8. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных и графики используйте программу статистического анализа.

  1. Откройте программу.
  2. Вставьте полученные данные и проверьте параметры нормальности.
  3. Для данных с нормальным распределением используйте t-тест Student, а для непараметрических тестов — тест Манна-Уитни.
  4. Рассмотрим данные со статистически значимой разницей, когда p-значение меньше 0,05.
  5. Подготовьте графики, представляющие данные, с центральными показателями тенденций (средними или медианными) и мерами вариаций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот отчет направлен на оценку ранних событий, происходящих во время фагоцитоза L. braziliensis , выделенного у пациентов с L . braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL формой CL. Используя конфокальную микроскопию, мы исследовали основные события, связанные с фагоцитозом паразитов: связывание, интернализацию и созревание фагосом. Сначала мы оценили связывание и фагоцитоз L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL макрофагами человека, полученными из моноцитов. Данные показывают, что и L. braziliensis-LCL, и L. braziliensis-DL одинаково связываются с макрофагами (рисунок 1). Кроме того, не наблюдалось различий в отношении фагоцитоза L. braziliensis-LCL и L. braziliensis-DL клетками-хозяевами (рисунок 2). Наконец, мы сравнили рекрутирование LC3 с PV, индуцированными L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL в инфицированных клетках. Через 30 мин, 4 и 12 ч инфекции мы наблюдали аналогичный процент LC3 декорированных PV у L. braziliensis-LCL и L. braziliensis-DL-инфицированных макрофагов (рисунок 3). Эти репрезентативные результаты показали, что L. braziliensis-LCL и L. braziliensis-DL аналогичным образом взаимодействуют с макрофагами во время связывания, фагоцитоза и биогенеза PV, что касается рекрутирования LC3.

Микроскопические изображения, представляющие клетки THP-1, эффективно трансфектированные плазмидами PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP, показаны на рисунке 4.

Figure 1
Рисунок 1. Оценка связывания L. braziliensis-LCL и L. braziliensis-DL с макрофагами человека. Макрофаги, полученные из моноцитов человека, были инфицированы L. braziliensis-LCL- или L. braziliensis-DL. Через 10 мин при 4 °C связывание оценивали с помощью конфокальной микроскопии. (A) Конфокальные микроскопические изображения L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL (помеченные CMTPX, красный), связывающиеся с макрофагами (помеченными фаллоидином, зеленый). Для конфокальной микроскопии клеточные ядра были помечены DAPI (синим цветом). Стрелки изображают связывание лейшмании-макрофагов. (B) Процент связывания лейшмании с макрофагами. В общей сложности было проанализировано 30 клеток на группу. Данные представляют каждую реплику одного эксперимента, выполненного в квинтупликации (непарный t-тест , p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Оценка фагоцитоза L. braziliensis-LCL и L. braziliensis-DL макрофагами человека. Человеческие моноцитарные макрофаги инкубировали с L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL в течение 10 мин при 4 °C с последующим дополнительным 1 ч при 37 °C. Затем клетки были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии путем подсчета в общей сложности 400 клеток. (A) Конфокальные микроскопические изображения макрофагов человека, инфицированных L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL. Для конфокальной микроскопии клеточные ядра были помечены DAPI (синим цветом). Стрелки изображают ядра паразитов Лейшмании . (B) Процент фагоцитоза лейшмании . Круги представляют данные из каждой реплики одного эксперимента, выполненного в трех экземплярах (непарный t-тест , p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Оценка рекрутирования LC3 в PV, индуцированную L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL в макрофагах. Человеческие моноцитарные макрофаги были инфицированы, а затем окрашены антителом против LC3 в течение 30 мин, 4 и 12 ч. (A) Конфокальные микроскопические изображения L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL-инфицированных макрофагов, меченных анти-LC3, с последующим вторичным анти-кроликом антителом IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (зеленый). Для конфокальной микроскопии клеточные ядра были помечены DAPI (синим); (B) Процент L. braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL-индуцированных PV, украшенных LC3-II. В общей сложности было проанализировано 30 клеток на группу. Круги соответствуют каждому анализируемому случайно выбранному полю (непарный t-тест , p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Клетки THP-1, экспрессирующие PLC, Rab5 или Rab7. После дифференцировки в макрофаги клетки THP-1 подвергались нуклеофекции с каждым интересующим геном, связанным с флуоресцентными зондами GFP: PLC, Rab5 и Rab7. Впоследствии эти клетки были зафиксированы, ядро окрашено DAPI (синий) и наблюдались под конфокальным микроскопом с использованием объектива 63x/1.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Взаимодействие лейшмании и макрофага является сложным процессом и включает в себя несколько этапов, которые могут влиять на развитие заболевания5. Чтобы лучше понять механизмы, участвующие во взаимодействии неопсонизированной лейшмании и клеток-хозяев, мы описали протокол, который использует конфокальную флуоресцентную микроскопию для оценки фагоцитоза от ранних до поздних стадий инфекции лейшмании . Использование методов флуоресценции с участием двух и более флуорофоров для исследования механизмов клеточной биологии, включая иммуномаркировку и экспрессию флуоресцентно меченых белков, позволяет проанализировать расположение нескольких белков, а также одновременно оценить морфологию клеток. Преимущества, предлагаемые этими методами, делают их лучшими инструментами для мониторинга взаимодействия патогена и клетки-хозяина34.

Чтобы лучше понять фагоцитарный процесс с участием различных частиц, крайне важно проанализировать этот высокодинамичный процесс на молекулярном уровне35. Конфокально-флуоресцентная микроскопия использовалась в течение десятилетий с этой целью и, как было показано, является отличным инструментом для количественной оценки фагоцитоза путем определения количества интернализованных частиц или типов белков, которые, как известно, участвуют на ранних стадиях взаимодействия хозяина и патогена34. В настоящем исследовании предлагалось использовать конфокальную микроскопию для анализа событий, происходящих во время фагоцитоза L. braziliensis , выделенного у пациентов с различными клиническими формами (LCL и DL). Этот метод позволяет нам изучать клетки, экспрессирующие специфические флуоресцентные белки, включая PLC, Akt, Rab 5 и Rab 7, и впоследствии оценивать участие этих белков в фагоцитозе изолятов Leishmania для выявления элементов, имеющих отношение к различным исходам инфекции.

В настоящем исследовании использовались первичные макрофаги и клетки THP1 для оценки фагоцитоза L. braziliensis на ранних стадиях инфекции. Описанный в настоящее время протокол также может быть использован для изучения фагоцитоза при Leishmania spp. другими фагоцитами, включая дендритные клетки, моноциты, клеточные линии макрофагов и нейтрофилы, полученные из периферической крови человека. В процессе интернализации паразита происходит динамическое изменение F-актина на поверхностиклеточной мембраны 11. Затем мы пометили белки, расположенные в клеточной мембране, используя специфический маркер фагоцитоза36, такой как флуоресцентный ПЛК, что позволило нам наблюдать стадию связывания лейшмании с клетками-хозяевами , как показано на рисунке 4. Окрашивание паразитов флуоресцентными маркерами, такими как CMTPX или CSFE, также имеет решающее значение для оценки связывания паразитов с клетками-хозяевами иммунофлуоресценцией. Стоит отметить, что данный анализ требует тщательного выполнения: i) аккуратно мыть крышки с использованием моющих растворов при комнатной температуре (25 °C), в противном случае образцы могут быть повреждены; ii) точно подготовить разбавления реагентов; и iii) защищают образцы от света34.

Конфокальный микроскоп, сконфигурированный с оптимальной длиной волны лазерного возбуждения, способен получать высококачественное изображение образца. Меченые клетки могут храниться неделями в темноте при 4 °C или замораживаться до момента анализа. Использование конфокальной микроскопии для оценки фагоцитоза ограничено длительным временем воздействия и лазерными лучами высокой интенсивности, которые могут повредить образцы, а в некоторых случаях привести к высоким уровням фонового обнаружения на изображениях35,37.

В настоящем исследовании, вместо использования живой визуализации для наблюдения за фагоцитозом Leishmania spp., мы провели кинетическое исследование, фиксируя клетки в несколько ранних периодов инфекции (30 мин, 4 ч и 12 ч). Следует учитывать, что живая визуализация предлагает некоторые преимущества, такие как возможность анализа пространственной и временной динамики мириад клеточных процессов, включая фагоцитоз, и захват деталей, которые не наблюдаются на статических изображениях34. Тем не менее, живая визуализация требует, чтобы клетки были здоровыми на протяжении всего процесса экспериментирования, включая контроль температуры, рН и кислородных условий в микроскопической камере. Важно отметить, что это не может быть надежно выполнено в нескольких лабораториях по всему миру.

Описанный протокол нуклеофекции продемонстрировал эффективность в трансфекции клеток THP-1, о чем ранее сообщали M. B. Maess, B. Wittig и S. Lorkowski 23. В этом процессе крайне важно осторожно отсоединить клетки, чтобы избежать повреждения клеток или потери жизнеспособности клеток. Основываясь на нашем опыте, мы рекомендуем использовать неферментативный раствор для диссоциации клеток для отделения клеток от пластин перед выполнением трансфекции. Авторы оригинального протокола23 утверждают, что основными ограничениями этой процедуры являются необходимость того, чтобы клетки находились в суспензии во время процесса нуклеофекции, и тот факт, что неадекватная отслойка может вызвать стресс. Несмотря на эти ограничения, протокол обеспечивает надежную трансфекцию, достигая 90% успешной скорости трансфекции без потери жизнеспособности клеток.

Характеристика PV с использованием набора эндоцитарных маркеров, включая PLC, Akt, Rab5 и Rab7, имеет важное значение для улучшения нашего понимания фагоцитоза лейшмании. Идентификация новых белков, которые участвуют в биогенезе PV, и всесторонняя характеристика этих компартментов может прояснить различия в реакции макрофагов во время инфекции Leishmania spp. Вклад наших результатов в совокупность знаний, связанных с исходом инфекции лейшмании, несомненно, улучшит наше понимание патогенеза инфекции лейшмании и поддержит возможный поиск новых химиотерапевтических целей. Стоит отметить, что эта методика может быть распространена и на другие виды исследований, включая заражение бактериями, дрожжами или поглощение бусин многими типами клеток38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе или анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Институт Гонсалу Мониса, Фиокрус Баия, Бразилия и отдел микроскопии за помощь. Эта работа была поддержана INOVA-FIOCRUZ номером 79700287000, P.S.T.V. владеет грантом на продуктивность в исследованиях от CNPq (305235/2019-2). Плазмиды были любезно предоставлены Маурисио Теребизником, Университет Торонто, Калифорния. Авторы хотели бы поблагодарить Андриса К. Уолтера за редактирование на английском языке и помощь в редактировании рукописей.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 173
Исследование фагоцитоза <em>лейшмании</em> с помощью конфокальной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paixão, A. R., Dias, B. R. S.,… More

Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter