Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersökning av fagocytos av Leishmania med konfokalmikroskopi

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62459
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute, 2National Institute of Science and Technology of Tropical Diseases - National Council for Scientific Research and Development (CNPq)
* These authors contributed equally

Summary

Mekanismen associerad med fagocytos vid Leishmania-infektion är fortfarande dåligt förstådd. Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna.

Abstract

Fagocytos är en orkestrerad process som involverar distinkta steg: erkännande, bindning och internalisering. Professionella fagocyter tar upp Leishmania-parasiter genom fagocytos, bestående av att känna igen ligander på parasitytor av flera värdcellreceptorer. Bindning av Leishmania till makrofagmembran sker genom komplementreceptortyp 1 (CR1) och komplementreceptortyp 3 (CR3) och mönsterigenkänningsreceptorer. Lipophosphoglycan (LPG) och 63 kDa glykoprotein (gp63) är de viktigaste liganderna som är involverade i makrofag-Leishmania-interaktioner . Efter det första erkännandet av parasitligander av värdcellreceptorer blir parasiter internaliserade, överlever och multipliceras inom parasitofora vakuoler. Mognadsprocessen av Leishmania-inducerade vakuoler involverar förvärv av molekyler från intracellulära vesiklar, inklusive monomert G-protein Rab 5 och Rab 7, lysosomalt associerat membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt associerat membranprotein 2 (LAMP-2) och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3).

Här beskriver vi metoder för att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under Leishmania-interaktion med värdcellerna med hjälp av konfokalmikroskopi, inklusive (i) bindning (ii) internalisering och (iii) fagosommognad. Genom att lägga till kunskapen kring dessa determinanter för infektionsresultat hoppas vi kunna förbättra förståelsen för patogenesen av Leishmania-infektion och stödja den eventuella sökningen efter nya kemoterapeutiska mål.

Introduction

Leishmaniasis är en försummad tropisk sjukdom orsakad av protozoa parasiter av släktet Leishmania, vilket resulterar i ett brett spektrum av kliniska manifestationer hos ryggradsdjurens värd, inklusive kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis och visceral leishmaniasis1. Världshälsoorganisationen (WHO) uppskattar att över en miljard människor är i riskzonen, med mer än en miljon nya fall rapporterade per år2.

är obligatoriska intracellulära protozoer som överlever inuti värdceller, inklusive monocyter, makrofager och dendritiska celler3. Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process som involverar flera värdcellreceptorer och parasitligander antingen genom direkt interaktion eller genom opsonisering som involverar komplementreceptorer 4,5. Klassiska ytreceptorer, såsom CR1, CR3, mannos-fukos, fibronektin, tollliknande och scavengerreceptorer, förmedlar parasitbindning till makrofager 6,7,8. Dessa receptorer känner igen molekyler på ytan av Leishmania, inklusive 63 kDa glykoprotein (gp63) och glykolipid lipophosphoglycan (LPG)9. Dessa är de vanligaste molekylerna på ytan av promastigotes och spelar en viktig roll i subversionen av värdimmunsvaret, vilket gynnar upprättandet av parasitinfektion i däggdjursceller10. Efter parasitytans ligander binder till makrofagreceptorer ackumuleras F-aktin på däggdjurscellytor, omgivande parasiter när de fagocytoseras. Därefter leder detta till bildandet av ett parasitinducerat fack som kallas parasitoforisk vakuol (PV), som presenterar fagolysosomala egenskaper11. En gång inuti dessa fagolysosomer genomgår parasiter flera förändringar som är väsentliga för överlevnad och multiplikation3.

Biogenesen av PVs är en starkt reglerad membranhandelsprocess som är kritisk för den intracellulära överlevnaden av denna patogen12. Bildandet av detta fack är resultatet av sekventiella fusionshändelser mellan fagosomer och fack i värdens endocytiska väg. Klassiska cellbiologiska studier har visat att mognad av PVs involverar förvärv av monomera G-protein Rab 5 och Rab 7-proteiner, som huvudsakligen är förknippade med tidig respektive sen endosommognad13. Dessutom förvärvar dessa fack lysosomassocierade membranproteiner 1 och 2 (LAMP 1, LAMP 2), de viktigaste proteinbeståndsdelarna i det lysosomala membranet och mikrotubuliassocierat protein 1A/1B-ljuskedja 3 (LC3), en autofagosommarkör14. Trots uppenbara likheter varierar kinetiken för PV-bildning15,16 och morfologin hos dessa fack beroende på Leishmania-arter. Till exempel inducerar infektion orsakad av L. mexicana eller L. amazonensis bildandet av stora fack som innehåller ett stort antal parasiter17. Däremot bildar andra arter, såsom L. braziliensis och L. infantum, mindre vakuoler som normalt bara innehåller en eller två parasiter i varje vakuol18.

Trots denna kunskap kring interaktionen mellan värdcell och leishmania har de initiala händelserna som utlösts av kontakt mellan värdreceptorer och parasitligander inte helt klarlagts. Dessa händelser är kända för att vara determinanter för resultatet av parasitinfektion och är beroende av parasitarter, typen av värdcellreceptorer som rekryteras för att känna igen parasiter och aktiveringen av makrofagsignalvägar19,20. Därför är det viktigt att identifiera de molekyler som är involverade i biogenesen av Leishmania-inducerade PVs och bestämma vilken eller vilka roller dessa molekyler spelar för infektionsetablering och resultat. Här beskriver vi en metod för att övervaka tidiga händelser som inträffar under fagocytosen av Leishmania, inklusive bindning, internalisering, fagosombildning och mognad. Detta arbete kan hjälpa till att klargöra deltagandet av PLC, Akt, Rab5, Rab7 och LC3 i bildandet av PVs inducerade av olika Leishmania-arter. Viktigt är att detta protokoll kan användas för att undersöka deltagandet av andra proteiner som är involverade i PV-mognad. Framtida studier kommer att utöka kunskapen kring mekanismer som är involverade i leishmania-värdcellsinteraktion och bidra till utformningen av nya kemoterapeutiska strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Celler erhölls från friska givare efter godkännande av förfaranden av de nationella forskningsetiska kommittéerna (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Cellkulturer

  1. Mänskliga monocyt-härledda makrofager
    OBS: För att erhålla humana monocyt-härledda makrofager för in vitro-differentiering till makrofager, samla blod från friska givare och rena mononukleära celler i perifert blod (PBMC) som beskrivs av D. English och B. R. Andersen21.
    1. Efter uppsamling av perifert blod (50 ml), häll det i ett hepariniserat rör och späd sedan blodet 1:1 i en fosfatbuffertlösning (PBS) vid rumstemperatur. Placera försiktigt utspätt hepariniserat blod ovanpå tidigare distribuerat densitetsgradientmedium.
    2. Centrifugera rören vid 252 × g i 30 minuter vid 24 °C för att undvika hemolys.
      OBS: Ställ in centrifugavbrott för att undvika blandning av gradientskikt. Efter centrifugering bildas diskontinuerliga gradientskikt från botten till toppen: erytrocyter, densitetsgradientmedium, PBMC-ring och plasma.
    3. Överför PBMC-ringen, som ligger mellan densitetsgradientmediet och plasmaskikten, till ett nytt rör och fyll med PBS för att tvätta bort överskottsdensitetsgradientmedium.
    4. Tvätta cellerna en gång och centrifugera vid 190 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    5. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml komplett RPMI-medium.
    6. Räkna cellerna och plattan 2 × 106 celler i 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) kompletterat med 25 mM N-[2-hydroxietyl] piperazin-N′-[2-etansulfonsyra] (HEPES), 2 g / L natriumbikarbonat, 2 mM glutamin, 20 g / ml ciprofloxacin och 10% inaktiverat fosterbovint serum (FBS) (komplett RPMI-medium) i 7 dagar vid 37 ° C under 5% CO2 i en 24-brunnsplatta för att tillåta monocyter att differentieras till makrofager genom vidhäftning.
  2. THP-1-kulturer
    1. Odla THP-1-cellinjen i en koncentration av 2 × 105 celler i 10 ml komplett RPMI-medium i 75 cm2 odlingskolv.
    2. Håll cellkulturer i en inkubator vid 37 °C under 5%CO2 i 7 dagar.
    3. Centrifugera cellerna vid 720 × g i 10 minuter vid 4 °C och återsuspendera pelleten i fullständigt RPMI-medium.
    4. Räkna celler i en Neubauer-kammare.
    5. Plattceller på 13 mm glasbeläggningar i en koncentration av 2 × 10 5 celler per brunn i 500 μL komplett RPMI-medium innehållande 100 nM forbolmyristatacetat (PMA) vid 37 °C under5 %CO2 för att möjliggöra differentiering av THP1-celler till makrofager.
    6. Tvätta två gånger cellerna två gånger med 0,9% NaCl-lösning för att avlägsna medium som innehåller PMA.
    7. Inkubera differentierade THP-1-celler i PMA-fritt komplett RPMI-medium vid 37 ° C under 5% CO 2 i ytterligare2 dagar innan experimentet påbörjas.

2. Parasitkulturer och CellTracker Röd färgning

OBS: För att visualisera parasiter genom fluorescensmikroskopi, utför färgning med CellTracker Red fluorescerande färgämne (CMTPX). Alternativt kan andra markörer, inklusive karboxifluorescein, användas i enlighet med tillverkarens instruktioner eller promastigotes som konstitutivt uttrycker GFP, RFP eller andra fluorescerande reportergener. Parasiter som används för att infektera celler är de vid stationär tillväxtfas erhållen från en promastigote axenisk kultur av högst 7 passager.

  1. Odla Leishmania spp. promastigotes vid 1 x 10 5 parasiter per 1 000 μl medium i en cellodlingskolv innehållande5 ml av Schneiders medium kompletterat med 50 μg/ml gentamicin och 10 % FBS.
  2. Efter inkubation av parasitaxeniska kulturer i en biokemisk syreförbrukning (B.O.D.) vid 24 °C, utför daglig räkning i en Neubauer-kammare. Kontrollera om parasitformen (tunn, långsträckt) och rörlighet i 5 dagar. Parasiter anses vara i stationär tillväxtfas när två på varandra följande räkningar med 8 timmars intervall visar liknande mängder.
  3. När du når den stationära tillväxtfasen, inkubera parasiterna i 4 ml 0,9% NaCl-lösning med 1 μM CMTPX i 15 min vid 37 ° C under 5% CO2 och undvik kontakt med ljus.
  4. Tillsätt FBS i proportionen 1:1 och inkubera parasitsuspensionen i ytterligare 1 min.
  5. Tvätta parasiter tre gånger med PBS, följt av centrifugering vid 1 781 × g i 10 min.
  6. Ressuspendera parasitpellet i 1 000 μL RPMI komplett medium.
  7. Räkna parasiter i en Neubauer-kammare.

3. Bedömning av leishmaniens bindning till makrofager

  1. Frö 2 × 105 THP-1-celler eller humana monocyt-härledda makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium per brunn på en 24-brunnsplatta med 13 mm glasbeläggningar.
  2. Odla celler vid 37 °C under 5 %CO2 i 24 timmar.
  3. Tvätta cellerna två gånger med 0,9 % NaCl-lösning och inkubera i fullständigt RPMI-medium vid 4 °C i 10 minuter.
  4. Tillsätt stationära faspromastiroter enligt beskrivningen i A. L. Petersen22 i förhållandet 10:1 till brunnsplattorna och centrifugera sedan vid 720 × g i 5 minuter under 4 °C.
  5. Inkubera vid 4 °C i 5 minuter.
  6. Tvätta cellerna två gånger med 0,9% NaCl-lösning för att ta bort eventuella icke-internaliserade promastigotes.
  7. Fixera cellerna i 4% paraformaldehyd i 15 min vid rumstemperatur.
  8. Inkubera täckglasen med 15 mM NH4Cl i 15 min vid rumstemperatur.
  9. Tvätta tre gånger med PBS 0,15% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera med blockerande lösning (3% BSA i PBS) i 1 h vid rumstemperatur.
  10. Tvätta tre gånger med PBS och permeabilisera sedan med 0,15% PBS-Saponin i 15 min vid rumstemperatur.
  11. Tillsätt falloidin (utspädd 1:1 200) i 1 timme vid rumstemperatur och skydda mot ljus.
  12. Montera täckglas med monteringsmedia.
  13. Skaffa bilder via ett konfokalt fluorescensmikroskop med ett 63×/1.4-mål.

4. Bedömning av Leishmania fagocytos av makrofager

  1. Frö 2 × 105 THP-1-celler eller humana monocyt-härledda makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium per brunn på en 24-brunnsplatta med 13 mm glasbeläggningar.
  2. Odla celler i 24 timmar vid 37 °C under 5 %CO2.
  3. Tvätta cellerna två gånger i 0,9 % NaCl-lösning och inkubera i komplett RPMI-medium i 24-brunnsplatta vid 4 °C i 10 minuter.
  4. Tillsätt Leishmania spp. enligt beskrivningen i A. L. Petersen22 i förhållandet 10:1 (parasit:värdcell) och centrifugera sedan vid 720 × g i 10 minuter under 4 °C.
  5. Inkubera cellerna vid 4 °C i 5 minuter.
  6. Tvätta cellerna två gånger med 0,9% NaCl-lösning för att ta bort eventuella icke-internaliserade promastigotes.
  7. Inkubera cellerna i kompletterat RPMI-medium vid 37 °C i 1 timme.
  8. Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd i 15 min.
  9. Montera täckglas med önskat monteringsmedium.
  10. Räkna inte mindre än 400 celler i slumpmässiga fält under ett fluorescensmikroskop med ett 100×/1,4-mål.

5. Utvärdering av leishmaniainducerad vakuolmognad

OBS: THP-1-celltransfektion bör utföras enligt beskrivningen av M. B. Maess, B. Wittig och S. Lorkowski 23. Här sammanfattar vi detta protokoll, med minimala modifieringar. Nukleofektion är en specifik transfektionsmetod som kräver en nukleofektor. Som en alternativ metod kan celler transfekteras med lipofektamin24 och lentivirustransduktion25.

  1. För att undersöka biogenesen av Leishmania-inducerad PV, transfekta THP1-celler med PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 eller Rab 728,29,31 plasmider.
    OBS: Denna metod kan användas för att transfektera THP-1-celler med andra gener än de som anges ovan.
  2. Frö THP-1-celler vid 1,5 x 107 i 75 cm² vävnadsodlingskolvar innehållande 10 ml komplett RPMI-medium kompletterat med 100 ng / ml PMA och 50 μM 2-merkaptoetanol i 48 timmar.
  3. Tvätta cellerna en gång i 0,9% NaCl-lösning.
  4. Lossa celler med en icke-enzymatisk celldissociationslösning och centrifugera (250 × g) i 5 minuter vid rumstemperatur.
  5. Återsuspendera THP-1-celler i 1 ml RPMI-medium och utför räkningar i en Neubauer-kammare.
  6. Centrifugera THP-1-celler igen vid 250 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
  7. Återsuspendera 2 × 106 celler i 100 μl Nukleofector-lösning och inkubera med 0,5 μg av plasmiden som kodar för proteinet av intresse, märkt med ett fluorescerande protein.
  8. Överför suspensionen innehållande THP-1-celler och nukleinsyra till Nucleofector-kyvetten.
  9. Transfekta THP1-celler med Nucleofector Program Y-001.
  10. Återvinn de transfekterade cellerna (2x106) och frö i 500 μL RPMI-medium på 24-brunnsplattor med 13 mm glastäcken (4 brunnar/transfekt).
  11. Inkubera THP-1-celler i komplett RPMI-medium vid 37 °C i 0,5, 2, 4, 6, 12 och 24 timmar.
  12. Upprepa steg 3.13 och 3.13.

6. Utvärdering av rekryteringen av LC3 till Leishmania spp.

OBS: Den autofagiska membranmarkören LC3 kan användas för att undersöka om fagosomer uppvisar autofagiska egenskaper. LC3-rekrytering till Leishmania-inducerade PVs kan bedömas under infektion med immunmärkningsceller med anti-LC3-antikroppen, som tidigare beskrivits av C. Matte32 och B. R. S. Dias33.

  1. Frö 2 × 105 THP-1-celler eller humana monocyt-härledda makrofager i 500 μL komplett RPMI-medium på en 24-brunnsplatta med 13 mm glasöverdrag.
  2. Odla celler i 24 timmar vid 37 °C under 5 %CO2.
  3. Tvätta cellerna två gånger i 0,9% NaCl-lösning och inkubera i komplett RPMI-medium.
  4. Lägg till stationära Leishmania spp.promastigotes enligt beskrivningen i A. L. Petersen22 vid förhållandet 10:1 (parasit: värdceller) och centrifugera cellerna vid 720 × g i 5 minuter under 4 °C.
  5. Inkubera vid 37 °C i 30 minuter eller 4 timmar. Tvätta sedan två gånger och fixa cellerna för att utvärdera LC3-rekryteringen till Leishmania-inducerade PV-membran i de tidiga stadierna av infektionen.
    1. Alternativt, för att bedöma LC3-rekrytering till PV-membran i senare infektionsstadier, tvätta två gånger en annan makrofaggrupp vid 4 timmars infektion för att ta bort eventuella icke-internaliserade promastigotes. Inkubera infekterade celler i komplett RPMI-medium i ytterligare 12 timmar och 24 timmar, för att slutligen tvätta två gånger och fixa.
      OBS: Fasta celler kan förvaras i PBS eller 0,9% NaCl-lösning vid 4 ° C tills märkning.
  6. Blockera och permeabilisera de fasta cellerna samtidigt i 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalt getserum, 6% fettfri torrmjölk och 50% FBS i 20 min vid rumstemperatur.
  7. Inkubera cellerna med anti-LC3-antikropp (1: 200) utspädd i PBS i 2 timmar vid rumstemperatur.
    OBS: Som en negativ kontroll av immunfärgningen bör en grupp celler inkuberas med immunoglobulin G (IgG) från djuret med primärt antikroppsursprung i en koncentration som motsvarar den som används för den primära antikroppen.
  8. Tvätta cellerna tre gånger med 0,9% NaCl-lösning vid rumstemperatur.
  9. Inkubera cellerna med AlexaFluor 488-konjugerad get anti-kanin IgG (1:500) eller de föredragna fluorescerande färgämnena konjugerade sekundära antikroppar i 1 h vid rumstemperatur.
  10. Tvätta cellerna tre gånger med 0,9% NaCl-lösning vid rumstemperatur.
  11. Montera täckglas med önskat monteringsmedium.
  12. Skaffa bilder via konfokalt fluorescensmikroskop med ett 63x/1,4-mål.

7. Konfokalmikroskopi och Fiji kvantifiering

OBS: Förvärv av immunofluorescensbilder bör utföras med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop. För att nå en bättre upplösning, använd en 63x objektivlins med oljedoppning.

  1. Låt 13 mm glaslocken stå i rumstemperatur och skydda dem från ljuset minst 30 min före anskaffningen.
  2. Rengör täckglasen med en absorberande vävnad.
  3. Tillsätt en droppe nedsänkningsolja till målet och lägg till bilden.
  4. Flytta målet uppåt tills oljan vidrör bilden.
  5. Observera och justera fokus på mikroskopet och välj alternativet 63x mål med olja.
  6. Öppna Leica-programmet och justera lasrarna i våglängderna 488, 552 och 405.
  7. Välj bildupplösningen 1 024 x 1 024.
  8. Klicka på Live-knappen , ställ in Z-stacken och tryck på alternativet Begin . Gör det sedan igen och tryck på Avsluta-knappen . Vi rekommenderar 20 μm för skivtjocklek för att få konfokala bilder med bra upplösningar.
  9. Vänta på bildförvärvet och välj sedan alternativet "Maximal projektion" i Leica-verktygen.
  10. Spara experimentet.
  11. Exportera bilderna i lif- eller tiff-format till en dator och öppna FIJI-programmet.
  12. Öppna experimentet och ange visningsstacken med hyperstacken. Välj sedan öppna filer individuellt och sy paneler.
  13. Välj verktyget för fria händer i Fiji-verktygsfältet och spåra cellen noggrant för hand.
  14. Tryck på knappen Analysera och mät för att visualisera fluorescensintensiteten.
  15. Upprepa den här processen för varje cell per grupp.
  16. Spara måtten och exportera dem till en kalkylarksredigerare.
  17. Lägg till dessa data i ett statistiskt analysprogram och gör den statistiska analysen.

8. Statistisk analys

OBS: För dataanalys och grafik, använd ett statistiskt analysprogram.

  1. Öppna programmet.
  2. Sätt in erhållna data och testa normalitetsparametrarna.
  3. För data med normal fördelning, använd Student t-test och för icke-parametriska tester, Mann-Whitney-test.
  4. Tänk på data med en statistiskt signifikant skillnad när p-värdet är mindre än 0,05.
  5. Förbered grafik som representerar data, med centrala tendensmått (medelvärde eller median) och variationsmått.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna rapport syftar till att utvärdera de tidiga händelser som inträffar under fagocytosen av L. braziliensis isolerad från patienter som presenterar L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL form av CL. Med hjälp av konfokalmikroskopi undersökte vi de viktigaste händelserna i samband med parasiternas fagocytos: bindning, internalisering och fagosommognad. Vi utvärderade först L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL-bindning och fagocytos av humana monocyt-härledda makrofager. Uppgifterna visar att både L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL på liknande sätt binder till makrofager (figur 1). Dessutom observerades inga skillnader angående L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL fagocytos av värdceller (figur 2). Slutligen jämförde vi rekryteringen av LC3 med PVs inducerad av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i infekterade celler. Efter 30 min, 4 och 12 timmars infektion observerade vi liknande procentandelar av LC3-dekorerade PVs i L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL-infekterade makrofager (Figur 3). Dessa representativa resultat visade att L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL på liknande sätt interagerar med makrofager under bindning, fagocytos och biogenes av PVs, angående LC3-rekryteringen.

Mikroskopiska bilder som representerar THP-1-celler som effektivt transfekteras med PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP-plasmider visas i figur 4.

Figure 1
Figur 1. Utvärdering av L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL bindning till mänskliga makrofager. Humana monocyt-härledda makrofager infekterades med L. braziliensis-LCL- eller L. braziliensis-DL. Efter 10 min vid 4 °C bedömdes bindningen med konfokalmikroskopi. (A) Konfokalmikroskopibilder av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL (märkt med CMTPX, röd) bindning till makrofager (märkt med falloidin, grön). För konfokalmikroskopi märktes cellkärnor med DAPI (blå). Pilar visar Leishmania-makrofagbindning. B) Procentandel leishmania som binder till makrofagerna. Totalt analyserades 30 celler per grupp. Data representerar varje replikat av ett experiment som utförts i kvintuplikat (oparat t-test, p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Utvärdering av L. braziliensis-LCL och L. braziliensis-DL fagocytos av humana makrofager. Humana monocyt-härledda makrofager inkuberades med L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL i 10 minuter vid 4 °C följt av ytterligare 1 timme vid 37 °C. Cellerna analyserades sedan med fluorescensmikroskopi genom att räkna totalt 400 celler. A) Konfokalmikroskopibilder av mänskliga makrofager infekterade av L. braziliensis-LCL eller L. braziliensis-DL. För konfokalmikroskopi märktes cellkärnor med DAPI (blå). Pilar visar Leishmania parasiter kärnor. b) Procentandel leishmania-fagocytos. Cirklar representerar data från varje replikat av ett experiment som utförts i tre exemplar (oparat t-test, p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Bedömning av LC3-rekrytering till PVs inducerad av L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL i makrofager. Humana monocyt-härledda makrofager infekterades och färgades sedan med anti-LC3-antikropp i 30 min, 4 och 12 h. (A) Konfokalmikroskopibilder av L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL-infekterade makrofager märkta med anti-LC3 följt av den sekundära anti-kanin IgG-antikroppen konjugerad till Alexa Fluor 488 (grön). För konfokalmikroskopi märktes cellkärnor med DAPI (blå); (B) Procentandel L. braziliensi s-LCL eller L. braziliensis-DL-inducerade PVs dekorerade med LC3-II. Totalt analyserades 30 celler per grupp. Cirklarna motsvarar varje slumpmässigt valt fält som analyseras (oparat t-test, p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. THP-1-celler som uttrycker PLC, Rab5 eller Rab7. Efter differentiering till makrofager utsattes THP-1-celler för nukleofektion med varje gen av intresse kopplad till GFP-fluorescerande sonder: PLC, Rab5 och Rab7. Därefter fixerades dessa celler, hade kärnan färgad med DAPI (blå) och observerades under ett konfokalmikroskop med ett 63x / 1.4-mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Leishmania-makrofaginteraktion är en komplex process och involverar flera steg som kan påverka sjukdomsutveckling5. För att bättre förstå mekanismerna som är involverade i interaktionen mellan oopsoniserad leishmani och värdceller har vi beskrivit ett protokoll som använder konfokal fluorescensmikroskopi för att bedöma fagocytos från tidiga till sena stadier av Leishmania-infektion. Användningen av fluorescenstekniker som involverar två eller flera fluoroforer för att undersöka cellbiologiska mekanismer, inklusive immunmärkning och uttryck av fluorescerande märkta proteiner, gör att vi kan analysera placeringen av flera proteiner, samt att samtidigt utvärdera cellmorfologi. Fördelarna med dessa metoder gör dem till de bästa verktygen för att övervaka interaktionen mellan patogen och värdcell34.

För att bättre förstå den fagocytiska processen som involverar olika partiklar är det avgörande att analysera denna mycket dynamiska process på molekylär nivå35. Konfokal-fluorescensmikroskopi har använts i årtionden för detta ändamål och har visat sig vara ett utmärkt verktyg för att kvantifiera fagocytos genom bestämning av antalet internaliserade partiklar eller de typer av proteiner som är kända för att vara involverade i tidiga stadier av värd-patogeninteraktion34. Den aktuella studien föreslog användning av konfokalmikroskopi för att analysera händelser som inträffar under fagocytos av L. braziliensis isolerad från patienter med olika kliniska former (LCL och DL). Denna teknik gör det möjligt för oss att studera celler som uttrycker specifika fluorescerande proteiner, inklusive PLC, Akt, Rab 5 och Rab 7, och därefter utvärdera deltagandet av dessa proteiner i fagocytosen av Leishmania-isolat för att identifiera element som är relevanta för olika infektionsresultat.

Den aktuella studien använde primära makrofager och THP1-celler för att bedöma L. braziliensis fagocytos i tidiga infektionsstadier. Det för närvarande beskrivna protokollet kan också användas för att studera fagocytos i Leishmania spp. av andra fagocyter, inklusive dendritiska celler, monocyter, makrofagcellinjer och neutrofiler härledda från humant perifert blod. Under parasitinternaliseringsprocessen sker en dynamisk förändring i F-aktin vid cellmembranytan11. Vi märkte sedan proteiner som finns i cellmembranet med hjälp av en specifik markör för fagocytos36, såsom fluorescerande PLC, vilket gjorde det möjligt för oss att observera bindningsstadiet av Leishmania till värdceller, som visas i figur 4. Färgning av parasiter med fluorescerande markörer, såsom CMTPX eller CSFE, är också avgörande för att bedöma parasitbindning till värdceller genom immunofluorescens. Det är värt att notera att denna analys kräver noggrant utförande: i) tvätta täckglas försiktigt med tvättlösningar vid rumstemperatur (25 ° C), annars kan proverna skadas; ii) bereda reagensutspädningar exakt, och iii) skydda proverna från ljus34.

Ett konfokalmikroskop konfigurerat till optimal laserspänningsvåglängd kan få en högkvalitativ provbild. Märkta celler kan förvaras i veckor i mörker vid 4 °C eller frysas fram till analystillfället. Användningen av konfokalmikroskopi för att utvärdera fagocytos begränsas av långvariga exponeringstider och högintensiva laserstrålar, vilket kan skada prover och i vissa fall leda till höga nivåer av bakgrundsdetektering i bilder35,37.

I den aktuella studien, istället för att använda levande avbildning för att följa fagocytosen av Leishmania spp., utförde vi en kinetisk studie genom att fixera celler vid flera tidiga infektionstider (30 min, 4 h och 12 h). Det måste beaktas att levande avbildning erbjuder vissa fördelar, såsom potentialen att analysera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i otaliga cellulära processer, inklusive fagocytos, och fånga detaljer som inte kan observeras i statiska bilder34. Levande avbildning kräver dock att cellerna är friska under hela experimentprocessen, inklusive kontroll av temperatur, pH och syreförhållanden i en mikroskopisk kammare. Det är viktigt att notera att detta inte kan utföras på ett tillförlitligt sätt vid flera laboratorier runt om i världen.

Det beskrivna nukleofektionsprotokollet har visat effekt vid transfektion av THP-1-celler, vilket tidigare rapporterats av M. B. Maess, B. Wittig och S. Lorkowski 23. I denna process är det viktigt att försiktigt lossa celler för att undvika cellskador eller förlust av cellviabilitet. Baserat på vår erfarenhet rekommenderar vi att du använder en icke-enzymatisk celldissociationslösning för att lossa celler från plattor innan transfektion utförs. Författarna till det ursprungliga protokollet23 säger att de viktigaste begränsningarna för denna procedur är behovet av att celler är i suspension under nukleofektionsprocessen och det faktum att otillräcklig frigöring kan orsaka stress. Trots dessa begränsningar tillåter protokollet tillförlitlig transfektion och når en 90% framgångsrik transfektionshastighet utan att förlora cellviabilitet.

Karakteriseringen av PVs med hjälp av en uppsättning endocytiska markörer, inklusive PLC, Akt, Rab5 och Rab7, är avgörande för att förbättra vår förståelse av Leishmania fagocytos. Att identifiera nya proteiner som deltar i PV-biogenes och omfattande karakterisera dessa fack kan klargöra skillnader i makrofagsvar under Leishmania spp.-infektion. Bidraget från våra resultat till kunskapsmassan kring Leishmania-infektionsresultatet kommer utan tvekan att främja vår förståelse av patogenesen av Leishmania-infektion och stödja den eventuella sökningen efter nya kemoterapeutiska mål. Det är värt att notera att denna teknik också kan utvidgas till andra typer av studier, inklusive infektion med bakterier, jäst eller pärlslukning av många typer av celler38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling eller analys, beslutet att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brasilien och avdelningen för mikroskopi för hjälp. Detta arbete stöddes av INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. har ett bidrag för produktivitet i forskning från CNPq (305235/2019-2). Plasmider tillhandahölls vänligen av Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Författarna vill tacka Andris K. Walter för engelskspråkig revision och hjälp med redigering av manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 173
Undersökning av fagocytos av <em>Leishmania</em> med konfokalmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paixão, A. R., Dias, B. R. S.,… More

Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter