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Biochemistry

Bioluminescent Optogenetics 2.0: विट्रो में और विवो में फोटोसेंसरी प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का दोहन

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62850
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2,3
1College of Medicine, Central Michigan University, 2Biochemistry, Cell and Molecular Biology Program, Central Michigan University, 3Neuroscience Program, Central Michigan University

Summary

एक छोटे से अणु सब्सट्रेट को ऑक्सीकरण करने वाले एक लूसिफेरस एंजाइम द्वारा उत्सर्जित बायोल्यूमिनेसेंस-प्रकाश, एक लूसिफेरिन-फोटोसेंसरी प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जिससे प्रकाश उत्तेजना में एक और आयाम जोड़ा जा सकता है और अस्थायी और स्थानिक तराजू में कोशिकाओं में प्रकाश-मध्यस्थता कार्यों की एक भीड़ के हेरफेर को सक्षम किया जा सकता है।

Abstract

बायोल्यूमिनेसेंस - एक छोटे अणु सब्सट्रेट, एक लूसिफेरिन को ऑक्सीकरण करने वाले एक लूसिफेरस एंजाइम द्वारा उत्सर्जित प्रकाश - का उपयोग विट्रो में और विवो में न्यूरॉन्स में प्रकाश-गेटेड आयन चैनलों और पंपों को सक्रिय करने के लिए किया गया है। जबकि यह बायोल्यूमिनेसेंट ऑप्टोजेनेटिक्स (बीएल-ओजी) दृष्टिकोण ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के लिए एक कीमोजेनेटिक घटक प्रदान करता है, यह तंत्रिका विज्ञान में उपयोग करने के लिए सीमित नहीं है। इसके बजाय, बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग किसी भी फोटोसेंसरी प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार कोशिकाओं में प्रकाश-मध्यस्थता कार्यों की एक भीड़ के हेरफेर को सक्षम करता है। विभिन्न प्रकार के लूसिफेरस-लूसिफेरिन जोड़े को प्रकाश और प्रकाश तीव्रता के विभिन्न तरंग दैर्ध्य की आवश्यकता वाले फोटोसेंसरी प्रोटीन के साथ मिलान किया जा सकता है।

विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर, कुशल प्रकाश वितरण को लूसिफेरस-फोटोरिसेप्टर संलयन प्रोटीन का उपयोग करके या सरल सह-अभिकर्मक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। प्रकाश-निर्भर dimerization या संरचनात्मक परिवर्तनों पर आधारित photosensory प्रोटीन प्रोटीन स्थानीयकरण से सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए bioluminescence द्वारा संचालित किया जा सकता है, प्रतिलेखन के लिए इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों के विनियमन। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में कोशिकाओं और जीवों में बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण के प्रयोगात्मक निष्पादन का विवरण दिया गया है और बायोल्यूमिनेसेंस-संचालित पुनर्संयोजन और प्रतिलेखन कारकों का उपयोग करके परिणामों का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को विट्रो और विवो में बायोल्यूमिनेसेंट ऑप्टोजेनेटिक्स करने के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं के साथ प्रदान करता है। वर्णित दृष्टिकोणों को आगे बढ़ाया जा सकता है और विभिन्न प्रयोगात्मक प्रतिमानों की भीड़ के लिए व्यक्तिगत किया जा सकता है।

Introduction

फोटोसेंसरी प्रोटीन को या तो एक भौतिक प्रकाश स्रोत से या इसके सब्सट्रेट, लूसिफेरिन की उपस्थिति में एक लूसिफेरस एंजाइम से प्रकाश द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, ताकि बायोल्यूमिनेसेंस उत्पन्न किया जा सके। उन अनुप्रयोगों के लिए जिन्हें मिली- या यहां तक कि फेम्टोसेकंड टाइमस्केल और / या एकल-सेल स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, भौतिक प्रकाश स्रोत (लेजर और प्रकाश-उत्सर्जक डायोड (एलईडी)) केवल इन तराजू के लिए ट्यूनेबल हैं। उदाहरण मिलीसेकंड टेम्पोरल कंट्रोल 1 के साथ ड्रोसोफिला लार्वा के विकास में विपरीत ध्रुवों को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश के स्थानिक प्रतिबंध हैं1 या माइटोकॉन्ड्रियल ट्यूब्यूल्स 2 जैसे एकल उपकोशिकीय संरचनाओं की सटीक उत्तेजना। हालांकि, ऑप्टिकल स्विच के लिए कई अन्य अनुप्रयोगों की विभिन्न प्राथमिकताएं हैं, जिनमें विस्तारित स्थानिक नियंत्रण और दोहराए गए आवेदन गैर-आक्रामक रूप से और प्रकाश क्षति के बिना दोहराए गए आवेदन शामिल हैं, लेकिन मिनट के टाइमस्केल और ट्यूनेबल तीव्रता में परिभाषित अस्थायी नियंत्रण के साथ। यहां, प्रकाश-संवेदन डोमेन को सक्रिय करने के लिए एक वैकल्पिक प्रकाश स्रोत के रूप में लूसिफेरस का उपयोग करने के कई फायदे हैं। ऑप्टिकल फाइबर प्रकाश सक्रियण के विपरीत, बायोल्यूमिनेसेंस लक्ष्य सेल आबादी में व्यक्त किए गए प्रत्येक प्रकाश-संवेदन डोमेन तक पहुंचता है क्योंकि प्रकाश स्रोत आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड होता है। बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग फाइबर ऑप्टिक्स और विस्तारित भौतिक प्रकाश जोखिम द्वारा ऊतक और सेल क्षति पर चिंताओं को कम करता है। प्रकाश को लूसिफेरस सब्सट्रेट के आवेदन के साथ चालू किया जाता है। शुरुआत प्रशासन के मार्ग के आधार पर इन विट्रो और विवो में तत्काल है और ~ 15-30 मिनट तक रहती है; विस्तारित उपस्थिति या प्रकाश की phasic उत्तेजना विभिन्न लूसिफेरिन के साथ और सब्सट्रेट 3 के अतिरिक्त या दोहराए गए अनुप्रयोगों के साथ प्राप्त की जा सकती है। अंत में, बायोल्यूमिनेसेंस उत्सर्जन को लूसिफेरिन की एकाग्रता को बदलकर ट्यून किया जा सकता है।

आयन-मूविंग फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग, यानी, ऑप्टोजेनेटिक तत्व, जैसे कि चैनलरोडोप्सिन या पंप, को बड़े पैमाने पर 4,5,6,7,8 का प्रदर्शन किया गया है। इस BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) दृष्टिकोण चूहों और चूहों में विवो प्रयोगों में नियोजित किया गया है5,6,7,9,10,11,12. ऑप्सिन के बीएल-ओजी सक्रियण को कम से कम ~ 33 μW / mm2 के बायोल्यूमिनेसेंस की मात्रा की आवश्यकता होती है, जिसमें सक्रियण की दक्षता उच्च प्रकाश उत्सर्जन 6,9 के साथ बढ़ रही है। आयन-चलती संवेदी फोटोरिसेप्टर प्रकृति में पाए जाने वाले संवेदी फोटोरिसेप्टर के बड़े दल का एक उपसमूह है जो गैर-आयन मूविंग 13,14 हैं। गैर-आयन मूविंग फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का विस्तार, जैसे कि पौधों या बैक्टीरिया से फोटोसेंसिंग डोमेन, रिपोर्ट 15,16 द्वारा प्रोत्साहित किया जाता है कि गैर-आयन मूविंग फोटोसेंसर चैनलरोडोप्सिन की तुलना में काफी अधिक प्रकाश-संवेदनशील होते हैं, जो आयन-मूविंग ऑप्टोजेनेटिक तत्वों के साथ पहले से ही प्राप्त होने की तुलना में बायोल्यूमिनेसेंस के साथ प्रकाश सेंसर की बेहतर ड्राइव सुनिश्चित करते हैं। हाल ही में, कई प्रकाशनों ने विभिन्न प्रकार के फोटोरिसेप्टर के सक्रियण के लिए एक प्रकाश स्रोत के रूप में बायोल्यूमिनेसेंस के उपयोग की सूचना दी, जिसमें प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज-सेंसिंग (एलओवी) डोमेन, ब्लू-लाइट-यूजिंग-फ्लेविन (ब्लूएफ) डोमेन, और क्रिप्टोक्रोम (सीआरवाई) 3,17,18,19,20,21,22 (तालिका 1) शामिल हैं। ). ऑप्टिकल स्विच के बायोल्यूमिनेसेंस-संचालित सक्रियण के लिए अनुप्रयोगों ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों से प्रेरित कोशिका मृत्यु, सीएएमपी संश्लेषण, प्रोटीन भर्ती और जीनोमिक पुनर्संयोजन और प्रतिलेखन के प्रेरण के लिए पृथक्करण से लेकर इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं को लक्षित किया।

यह प्रोटोकॉल बायोल्यूमिनेसेंस-संचालित ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के सामान्य डिजाइन को रेखांकित करता है और कोशिकाओं और जीवों में बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण के प्रयोगात्मक निष्पादन के लिए प्रक्रियाओं का विवरण देता है। इसमें एक कमरा, एक ऊतक संस्कृति हुड और इनक्यूबेटर स्थापित करने के तरीके पर विवरण शामिल हैं, और बायोल्यूमिनेसेंस के साथ काम करने के लिए एक माइक्रोस्कोप, साथ ही साथ इसे लागू करने के लिए लूसिफेरिन तैयार करने से लेकर चरणों तक। यह प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को बायोल्यूमिनेसेंट ऑप्टोजेनेटिक्स (बीएल-ओजी) इन विट्रो और इन विवो में करने के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं के साथ प्रदान करता है। वर्णित दृष्टिकोणों को आगे बढ़ाया जा सकता है और विभिन्न प्रयोगात्मक प्रतिमानों के लिए व्यक्तिगत किया जा सकता है। हम ऑप्टोजेनेटिक जैविक अध्ययन में बायोल्यूमिनेसेंस के उपयोग को अपनाने की सुविधा के लिए इस प्रोटोकॉल की उम्मीद करते हैं।

Protocol

वर्तमान अध्ययन में सभी प्रक्रियाओं को सेंट्रल मिशिगन विश्वविद्यालय, एमआई में पशु हैंडलिंग के लिए संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था।

1. विट्रो में photosensory प्रोटीन के Bioluminescence सक्रियण

  1. Constructs
    1. एक लूसिफेरस अनुक्रम या लूसिफेरस-फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन अनुक्रम का चयन करें जिसके परिणामस्वरूप एक प्रकाश उत्सर्जक की अभिव्यक्ति होगी जो एक तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उत्पादन करती है जो फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए मेल खाती है।
      नोट: उदाहरण के लिए, ब्लू लाइट-एमिटिंग लूसिफेरस, जैसे कि गॉसिया लूसिफेरस वेरिएंट या नैनोएल्यूक, को नीले प्रकाश-संवेदन फोटोरिसेप्टर जैसे CRY / Ca2 + - और इंटीग्रिन-बाइंडिंग प्रोटीन (CIB), LOV, या विविड (वीवीडी) के साथ जोड़ा जा सकता है।
    2. यदि अन्य जांचकर्ताओं या प्लास्मिड जमा से पहले से उपलब्ध नहीं है, तो डीएनए को स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लास्मिड में क्लोन करने के लिए मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करें।
      नोट: प्रमोटरों की पसंद प्रकाश उत्सर्जक मॉड्यूल की मजबूत और संवैधानिक अभिव्यक्ति प्रदान करने की आवश्यकता से निर्धारित होती है, जैसे कि सीएजी और सीएमवी प्रमोटरों द्वारा प्रदान की जाती है।
    3. प्रारंभिक अध्ययनों के लिए, प्रकाश उत्सर्जक और प्रकाश सेंसर के सह-अभिकर्मक के लिए अलग-अलग प्लास्मिड का उपयोग करें। आवश्यकतानुसार और बाद के अध्ययनों के लिए दो moieties के संलयन प्रोटीन उत्पन्न करें।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मिनी, मिडी-, या मैक्सिप्रैप किट का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले प्लास्मिड डीएनए प्राप्त करें।
  2. सेल संस्कृति और अभिकर्मक
    नोट:: HeLa कक्षों और HEK293 कक्षइस प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाते हैं।
    1. वांछित अंतिम उपयोग के अनुसार प्रारूपों और संख्याओं में प्लेट कोशिकाएं।
      नोट: विशिष्ट उदाहरण तालिका 2 में दिए गए हैं। चढ़ाना के समय सेल घनत्व यह निर्धारित करेगा कि कोशिकाओं को कितनी जल्दी ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है।
      1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा बायोल्यूमिनेसेंस-सक्रिय प्रतिलेखन का आकलन करने के लिए, पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) पर प्लेट एचईके 293 कोशिकाएं- लेपित 12 मिमी कवरलिप्स 24-अच्छी तरह से व्यंजनों में रखे गए हैं।
      2. एक ल्यूमिनोमीटर में एक ओर्थोगोनल रिपोर्टर लूसिफेरस से प्रकाश उत्सर्जन को मापकर बायोल्यूमिनेसेंस-सक्रिय प्रतिलेखन का आकलन करने के लिए, प्लेट हेला कोशिकाओं को शुरू में अभिकर्मक के लिए 6- या 12-अच्छी तरह से व्यंजनों में, लेकिन अभिकर्मक के बाद उन्हें फिर से प्लेट करें (चरण 4 देखें)।
      3. यदि बार-बार बायोल्यूमिनेसेंस उत्तेजना को लाइव-सेल इमेजिंग कक्षों में किया जाएगा, तो उपयुक्त आकार के कवरलिप्स का चयन करें और उन्हें उचित आकार की बहु-अच्छी तरह से प्लेटों में रखें (12 मिमी कवरलिप्स के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेटें; 15 मिमी और 18 मिमी कवरस्लिप के लिए 12-अच्छी तरह से प्लेटें)। तालिका 2 में निर्दिष्ट कक्ष संख्याओं का उपयोग करके कवरस्लिप के शीर्ष पर स्थित कक्षों को बीज दें. यदि चयनित सेल प्रकार संस्कृति सतह का अच्छी तरह से पालन नहीं करता है, तो पीडीएल-लेपित व्यंजनों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    2. निर्माता की सिफारिश के अनुसार लिपोफेक्शन द्वारा अभिकर्मक निष्पादित करें या चयनित सेल प्रकार के लिए उपयुक्त किसी भी अभिकर्मक विधि का उपयोग करें।
      नोट: तालिका 3 दो अलग-अलग फोटोरिसेप्टर, EL222 और CRY2 / CIB, और उनके संबंधित रिपोर्टर प्लास्मिड के लिए अभिकर्मक प्रयोगों का विवरण देती है, विभिन्न प्रकाश उत्सर्जक प्रोटीन के अलावा। विभिन्न प्लास्मिडों के अनुपात चयनित उदाहरणों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं लेकिन प्रत्येक प्रकाश उत्सर्जक / प्रकाश सेंसर जोड़ी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    3. अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को एक इनक्यूबेटर में रखें जो पूरी तरह से प्रकाश-सील है (चित्रा 1)।
    4. वांछित अंतिम उपयोग के आधार पर, अगले दिन बायोल्यूमिनेसेंस उत्तेजना के लिए कोशिकाओं का उपयोग अपने मूल कुओं / व्यंजनों में करें, या लिपोफेक्शन के बाद उन्हें 3-4 घंटे बाद फिर से प्लेट करें। एक ल्यूमिनोमीटर में एक जुगनू लूसिफेरस रिपोर्टर जीन के प्रतिलेखन को पढ़ने के लिए, सफेद 96-अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं को फिर से प्लेट करें।
      नोट: लाल बत्ती (चित्रा 2) द्वारा प्रकाशित एक लैमिनर प्रवाह हुड में एक हल्के-तंग कमरे में सभी जोड़तोड़ करें।
      1. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) या फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के साथ एक बार transfected कोशिकाओं धोलें।
      2. कुओं (24-अच्छी तरह से: 100 μL; 12-अच्छी तरह से: 150 μL; 6-अच्छी तरह से: 300 μL) में ट्रिप्सिनाइज़िंग अभिकर्मक की न्यूनतम मात्रा जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      3. एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए संस्कृति माध्यम जोड़ें जो अगले चढ़ाना चरण के लिए उपयुक्त सेल घनत्व उत्पन्न करेगा (उदाहरण के लिए, 96-अच्छी तरह से प्लेट के 10 कुओं में चढ़ाना के लिए 1.2 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में 24-अच्छी तरह से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें; 96-अच्छी तरह से प्लेट के 20 कुओं में चढ़ाना के लिए 2.4 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में 12-अच्छी तरह से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें)। अंत में आवश्यक कुओं की संख्या के आधार पर कई कुओं से संक्रमित कोशिकाओं को पूल करें।
      4. अपने अंतिम प्रारूप में transfected कोशिकाओं प्लेट और प्रकाश-संरक्षित इनक्यूबेटर के लिए प्लेटों वापस.
  3. बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण in vitro
    1. लूसिफेरस सब्सट्रेट (लूसिफेरिन) तैयार करें।
      1. अपने विशिष्ट विलायक के 250 μL में 5 मिलीग्राम lyophilized coelenterazine (CTZ) को भंग करके 50 mM स्टॉक तैयार करें। सुनिश्चित करें कि शीशी की दीवारों के साथ सभी सीटीजेड पिपेटिंग या भंवर द्वारा भंग हो गए हैं। शीशी को प्रत्यक्ष प्रकाश से बचाएं।
      2. 0.5 mL काले microcentrifuge ट्यूबों में 50 μL ऐलीकोट तैयार करें और भविष्य के उपयोग के लिए -80 °C पर स्टोर करें।
        नोट: विलायक में भंग CTZ -80 °C पर फ्रीज नहीं करता है। एलीकोट को हटाया जा सकता है और काम करने वाले समाधान बनाने के लिए कई बार फ्रीजर में लौटाया जा सकता है जब तक कि प्रकाश और कमरे के तापमान के संपर्क में कम से कम रखा जाता है।
    2. एकल बायोल्यूमिनेसेंस प्रकाश उत्तेजना
      नोट: सभी जोड़तोड़ एक लैमिनर प्रवाह हुड में एक प्रकाश-तंग कमरे में किए जाते हैं जो लाल बत्ती (चित्रा 2) द्वारा प्रकाशित होता है।
      1. सेल कल्चर माध्यम (DMEM या NeuroBasal) में लूसिफेरिन का एक कामकाजी समाधान तैयार करें। लूसिफेरिन की सांद्रता को इस प्रकार समायोजित करें कि अंतिम सांद्रता 100 μM हो। कोशिकाओं में जोड़ने से कुछ ही समय पहले CTZ के सभी dilutions को माध्यम में तैयार करें, क्योंकि CTZ समय के साथ ऑक्सीकरण करता है।
        नोट:: यदि माध्यम की संपूर्ण मात्रा को प्रतिस्थापित किया जाएगा, तो कार्य समाधान 100 μM होगा। यदि लूसिफेरिन युक्त माध्यम को कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, तो एकाग्रता कमजोर पड़ने वाले कारक से अधिक होगी (उदाहरण के लिए, कुएं में 300 μM लूसिफेरिन युक्त माध्यम के 50 μL को 100 μL माध्यम में जोड़ने से 1: 3 कमजोर पड़ने का परिणाम होगा और इस प्रकार लूसिफेरिन की 100 μM अंतिम एकाग्रता में)।
      2. कोशिकाओं में लूसिफेरिन युक्त माध्यम जोड़ें और प्रकाश उत्तेजना की वांछित अवधि के लिए इनक्यूबेट करें।
        नोट: यह 1 मिनट के रूप में छोटा या 15 मिनट के रूप में लंबे समय तक हो सकता है और इससे भी छोटा या लंबा हो सकता है। कोशिकाओं पर लूसिफेरिन युक्त माध्यम को छोड़ने के लिए समय की लंबाई चयनित लूसिफेरस-लूसिफेरिन संयोजन के आधे जीवन और कैनेटीक्स पर निर्भर करती है।
      3. लाल बत्ती को बंद करने के बाद आंखों द्वारा 100 μM अंतिम लूसिफेरिन एकाग्रता पर प्रकाश उत्सर्जन की निगरानी; कुछ सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि आंखें अंधेरे को पूरा करने के लिए समायोजित न हो जाएं। एक तस्वीर लेने के द्वारा प्रकाश उत्सर्जन दस्तावेज (यहां तक कि एक सेल फोन के साथ भी).
      4. लूसिफेरिन युक्त माध्यम को हटाकर और इसे संस्कृति माध्यम के साथ बदलकर प्रकाश उत्तेजना को समाप्त करें। प्रयोगों की संवेदनशीलता के आधार पर, सभी लूसिफेरिन को खत्म करने के लिए लूसिफेरिन युक्त माध्यम को हटाने के बाद एक या दो बार संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को धोएं। यदि कोशिकाएं संस्कृति की सतह का अच्छी तरह से पालन नहीं करती हैं, तो उन्हें धोने के दौरान कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए पीडीएल-लेपित व्यंजनों पर प्लेट करें।
      5. 16-24 घंटे के लिए प्रकाश-संरक्षित इनक्यूबेटर को कोशिकाओं को वापस करें।
    3. बार-बार बायोल्यूमिनेसेंस प्रकाश उत्तेजना
      नोट: सभी जोड़तोड़ एक कमरे में किए जाते हैं जिसे हल्का-तंग बनाया जा सकता है और लाल बत्ती से रोशन किया जा सकता है।
      1. लाइव-सेल इमेजिंग कक्ष सेट करें. एक बॉक्स और काले प्लास्टिक शीट या काले ड्रेप्स (चित्रा 3) का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप के चारों ओर एक लाइट-टाइट कम्पार्टमेंट बनाएं। प्रकाश-तंग डिब्बे और कमरे के अंदर मौजूद सभी प्रकाश स्रोतों को कवर करें (उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप या उपकरणों पर एलईडी संकेतक)।
      2. सेवन के लिए वांछित समाधान के साथ परफ्यूजन सिस्टम स्थापित करें और एक अपशिष्ट कंटेनर के लिए अग्रणी चैंबर आउटपोर्ट।
        नोट: उदाहरण के लिए, इमेजिंग समाधान Tyrode's Solution (सोडियम क्लोराइड (124 mM), पोटेशियम क्लोराइड (3 mM), HEPES (10 mM), कैल्शियम क्लोराइड dihydrate (2 mM), मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (1 mM), D-glucose (20 mM)) हो सकता है।
      3. इमेजिंग समाधान में लूसिफेरिन का एक कामकाजी समाधान तैयार करें। दोहराने उत्तेजनाओं की संख्या के रूप में कई microcentrifuge ट्यूबों में एलीकोट. लूसिफेरिन की एकाग्रता को समायोजित करें जैसे कि इमेजिंग कक्ष में अंतिम एकाग्रता 100 μM है।
      4. कक्ष में transfected कोशिकाओं के साथ एक coverslip जगह.
      5. पंप को चालू रखते हुए, सेवन बीकर से पंप की इनलेट ट्यूब को हटा दें और जल्दी से इसे लूसिफेरिन समाधान में विसर्जित करें, टयूबिंग में किसी भी हवा के शून्य से बचने के लिए संक्रमण समय को यथासंभव कम रखें।
      6. जैसे ही लूसिफेरिन समाधान लिया गया है, इनलेट ट्यूब को सेवन बीकर में वापस रखें। इस प्रक्रिया को आवश्यकतानुसार कई बार दोहराएं और कई मिनटों से घंटों के अंतराल पर, शारीरिक पैटर्न के आधार पर, जिसके लिए कोशिकाओं को उजागर किया जाना चाहिए।
      7. प्रतिलेखन के लिए 16-24 घंटे के लिए कोशिकाओं को प्रकाश-संरक्षित इनक्यूबेटर में वापस करें, या समय की लंबाई के लिए प्रकाश उत्तेजना के प्रभाव का आकलन किया जाना है।

2. विवो में photosensory प्रोटीन के Bioluminescence सक्रियण

  1. Constructs
    1. एक लूसिफेरस अनुक्रम या लूसिफेरस-फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन अनुक्रम का चयन करें जिसके परिणामस्वरूप एक प्रकाश उत्सर्जक की अभिव्यक्ति होगी जो एक तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उत्पादन करती है जो फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए मेल खाती है।
    2. डीएनए को पीएएवी प्लास्मिड में क्लोन करने के लिए मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करें, यदि पहले से ही अन्य जांचकर्ताओं या प्लास्मिड जमा से उपलब्ध नहीं है।
    3. प्रकाश उत्सर्जक मॉड्यूल की अभिव्यक्ति के लिए मजबूत प्रमोटर चुनें, जैसे कि सीएजी या सीएमवी।
    4. उच्च-टिटर वायरल स्टॉक 6 तैयार करने के लिए मानक दृष्टिकोण का उपयोग करें या व्यावसायिक रूप से तैयार किए गए वायरल वैक्टर हैं।
    5. प्रारंभिक अध्ययनों के लिए, प्रकाश उत्सर्जक के सह-ट्रांसडक्शन के लिए अलग-अलग वायरल वैक्टर का उपयोग करें और यदि आवश्यक हो तो विभिन्न घटकों के अनुपात के समायोजन की अनुमति देने के लिए प्रकाश सेंसर।
  2. AAV ट्रांसडक्शन
    1. प्रकाश उत्सर्जक, प्रकाश संवेदक के वायरल वैक्टर के साथ प्रयोगात्मक जानवर के लक्ष्य अंग को इंजेक्ट करें, और इन विट्रो अभिकर्मकों के लिए उपयोग किए जाने वाले एकाग्रता अनुपात के अनुरूप रिपोर्टर (तालिका 3)।
    2. सभी घटकों की अधिकतम अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए जानवरों को कम से कम 2 सप्ताह के लिए अपने घर के पिंजरों में वापस कर दें।
      नोट: यदि लक्ष्य अंग शरीर के अंदर है और परिवेश प्रकाश से संरक्षित है, तो जानवरों को सामान्य प्रकाश परिस्थितियों में रखा जा सकता है।
  3. विवो में बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण
    1. लूसिफेरस सब्सट्रेट (लूसिफेरिन) तैयार करें।
      1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पानी में घुलनशील सीटीजेड की एक शीशी निकालें और इसे कमरे के तापमान पर गर्म होने दें। इसे प्रकाश से सुरक्षित रखें।
      2. प्रति 500 μg शीशी, बाँझ पानी के 250 μL जोड़ें, या तो एक सिरिंज का उपयोग करके या शीशी खोलने और एक पिपेट के साथ पानी जोड़कर, फिर रबर स्टॉपर को ग्लास शीशी पर वापस डालकर।
      3. पाउडर को पूरी तरह से भंग करने के लिए कुछ मिनटों के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पुनर्गठित कांच की शीशी को इनक्यूबेट करें।
      4. एक काले microcentrifuge ट्यूब में समाधान हस्तांतरण. सभी सीटीजेड को पुनः प्राप्त करने के लिए कांच की शीशी की दीवारों को कुल्ला।
      5. दिन के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा को हटा दें। अगले दिन उपयोग के लिए शेष समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। फ्रीज मत करो!
      6. वाहन की एक शीशी के लिए एक ही कदम (2.3.1.1.-2.3.1.5) को पूरा करें।
    2. बायोल्यूमिनेसेंस प्रकाश उत्तेजना
      1. जानवर के आकार और चुने गए आवेदन मार्ग के लिए आवश्यक लूसिफेरिन / वाहन की मात्रा को हटा दें (तालिका 4)।
      2. लूसिफेरिन या वाहन के साथ जानवरों को इंजेक्ट करें। प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार bioluminescence प्रकाश उत्तेजना को दोहराएं। उदाहरण के लिए, यदि एक विशिष्ट व्यवहार प्रतिमान के दौरान एक पुनर्संयोजन का सक्रियण वांछित है, तो व्यवहार परीक्षण से ठीक पहले जानवरों को इंजेक्ट करें। यदि एक अणु का फैसिक प्रतिलेखन लक्ष्य है, तो जानवरों को दिनों में बार-बार इंजेक्ट करें।
      3. बायोल्यूमिनेसेंस-प्रेरित जानवरों से डेटा एकत्र करें जैसा कि डिज़ाइन किया गया है।

Representative Results

कई इंट्रासेल्युलर घटनाएं हैं जिन्हें प्रकाश का जवाब देने वाले एक्ट्यूएटर्स के साथ हेरफेर किया जा सकता है, और जो भौतिक और जैविक प्रकाश स्रोतों के साथ बिमोडल सक्रियण के लिए उपयुक्त हैं। नीचे एक फोटोसेंसिंग कैल्शियम (Ca2+) इंटीग्रेटर, प्रकाश-प्रेरित प्रोटीन ट्रांसलोकेशन, एक प्रकाश-संवेदन प्रतिलेखन कारक, और एक फोटोसेंसिटिव पुनर्संयोजन को नियोजित करने वाले उदाहरण दिए गए हैं। उदाहरण विभिन्न प्रकार के फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग करने की व्यवहार्यता को दर्शाते हैं। प्रस्तुत किए गए प्रयोगों को विशेष रूप से प्रकाश-उत्सर्जक डायोड (एलईडी) अनुप्रयोग, लुसिफेरस चुने गए, या लुसिफेरिन आवेदन की सांद्रता और समय के संबंध में अनुकूलित नहीं किया गया था।

तेजी से प्रकाश और गतिविधि-विनियमित अभिव्यक्ति (FLARE) एक ऑप्टोजेनेटिक प्रणाली है जो बढ़े हुए इंट्रासेल्युलर Ca2 + और light23 (चित्रा 4A) की सह-घटना के साथ एक रिपोर्टर जीन के प्रतिलेखन की अनुमति देती है। Ca2+ की उपस्थिति प्रोटीज क्लीवेज साइट के निकटता में प्रोटीज को लाने के लिए आवश्यक है जो केवल प्रकाश उत्तेजना के साथ सुलभ है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिलेखन कारक की रिहाई होती है। HEK293 कोशिकाओं को मूल FLARE घटकों, एक दोहरी Firefly (FLuc) -dTomato रिपोर्टर निर्माण, और एक झिल्ली-लंगर वाले गॉसिया लूसिफेरस वेरिएंट sbGLuc6 के साथ सह-संक्रमित किया गया था। 2 μM ionomycin और 5 mM कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) के लिए कोशिकाओं के संपर्क के माध्यम से बढ़े हुए इंट्रासेल्युलर Ca2 + की उपस्थिति में, नीले एलईडी के आवेदन ने अंधेरे में छोड़ी गई कोशिकाओं की तुलना में प्रतिदीप्ति रिपोर्टर की मजबूत अभिव्यक्ति का नेतृत्व किया, साथ ही साथ FLuc सब्सट्रेट को जोड़ने पर ल्यूमिनेसेंस को मापने के द्वारा निर्धारित FLuc की अभिव्यक्ति के लिए, डी-लूसिफेरिन। FLuc अभिव्यक्ति के समान स्तरों को sbGLuc सब्सट्रेट (CTZ) के आवेदन पर sbGLuc द्वारा उत्सर्जित बायोल्यूमिनेसेंस के साथ प्राप्त किया गया था, साथ ही साथ ionomycin और CaCl2 के साथ। ध्यान दें कि प्रकाश सक्रियण (sbGLuc) के लिए उपयोग किए जाने वाले लूसिफेरस और प्रकाश सक्रियण (FLuc के प्रतिलेखन) के प्रभाव की रिपोर्टिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं, केवल अपने संबंधित लूसिफेरिन (CTZ बनाम D-luciferin) के साथ प्रकाश का उत्पादन करते हैं और क्रॉस-रिएक्ट नहीं करते हैं।

विभिन्न घटकों को क्रिप्टोक्रोम 23,24 (चित्रा 4 बी) के हेटरोडिमराइजेशन के आधार पर एक प्रकाश-प्रेरित प्रतिलेखन प्रणाली उत्पन्न करने के लिए संयुक्त किया गया था। CRY2 को एक प्रोटीज से जोड़ा गया था, जबकि झिल्ली-बाउंड CIB को प्रोटीज क्लीवेज साइट और ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर से जोड़ा गया था। प्रकाश-प्रेरित प्रोटीन ट्रांसलोकेशन ने प्रतिलेखन कारक को जारी किया, जिससे FLuc और dTomato की अभिव्यक्ति हुई, जैसा कि चित्र 4A में दिखाया गया है। जबकि अकेले प्रतिलेखन कारक घटक की उपस्थिति के परिणामस्वरूप काफी पृष्ठभूमि संकेत संभवतः सहज प्रोटियोलिसिस के कारण हुआ, दोनों भौतिक प्रकाश (एलईडी) और बायोल्यूमिनेसेंस (सीटीजेड) ने एफएलयूसी की अभिव्यक्ति को मजबूत रूप से बढ़ाया जैसा कि विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) में मापा गया था।

प्रयोगों के एक अन्य सेट में, NanoLuc (luciferin: furimazine या hCTZ) को CRY / CIB के dimerization और photosensitive transcription factor, EL22225,26,27 के dimerization के माध्यम से प्रतिलेखन के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन के लिए नियोजित किया गया था। चित्रा 5ए, बी अंधेरे और प्रकाश राज्यों में विभिन्न घटकों की योजनाबद्धताओं को दर्शाता है और लूसिफेरस सह-संक्रमित या प्रकाश सेंसर से जुड़ा हुआ है। विभिन्न तुलनाओं को चित्र 5C में दिखाया गया है। Bioluminescence, HEK293 कोशिकाओं के लिए hCTZ जोड़ने के द्वारा प्रेरित निर्माणों को व्यक्त करने और इसे 15 मिनट के बाद हटाने, दोनों CRY / CIB और EL222 दोनों के लिए एलईडी प्रकाश जोखिम के 20 मिनट की तुलना में रिपोर्टर प्रतिलेखन ड्राइविंग में अधिक कुशल था। CRY / CIB के लिए, एलईडी एक्सपोजर का एक घंटा बायोल्यूमिनेसेंस के 15 मिनट के तुलनीय प्रतिलेखन के स्तर तक पहुंचने के लिए पर्याप्त था। इसके विपरीत, EL222 के लिए, यहां तक कि 60 मिनट के एलईडी बायोल्यूमिनेसेंस के लिए एक संक्षिप्त जोखिम के रूप में मुश्किल से आधे प्रभावी थे। सह-संक्रमित होने पर दो प्रणालियों के बीच प्रतिलेखन प्रभावकारिता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, हालांकि CRY / CIB के संलयन प्रोटीन EL222 की तुलना में अधिक कुशल थे। दोनों प्रणालियों के लिए, संलयन प्रोटीन ने सह-संक्रमित घटकों की तुलना में काफी अधिक प्रतिलेखन स्तर का नेतृत्व किया। CRY / CIB ने EL222 की तुलना में वाहन अनुप्रयोग के साथ लगातार उच्च पृष्ठभूमि स्तर दिखाया, जिसमें नगण्य पृष्ठभूमि प्रतिलेखन था। अकेले एचसीटीजेड की बढ़ती सांद्रता का रिपोर्टर जीन के प्रतिलेखन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

Photoactivatable recombinases ऑप्टोजेनोमिक जोड़तोड़ के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करते हैं। हम एक photoensitive विभाजन क्रे recombinase ज्वलंत LOV प्रोटीन, iCreV28 के आधार पर bioluminescence सक्रियण का परीक्षण किया. चित्रा 6A विभिन्न घटकों, sbGLuc, iCreV, और एक lox-stop-lox प्रतिदीप्ति रिपोर्टर (tdTomato) से पहले और CTZ के आवेदन के बाद की एक योजनाबद्ध से पता चलता है। नियंत्रण (कोई CTZ या एलईडी) के सापेक्ष CTZ अनुप्रयोग से परिणाम चित्र 6B में दिखाए गए हैं। अंधेरे में भी कुछ पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति है (कोई सीटीजेड नहीं); हालांकि, सीटीजेड की उपस्थिति में, अभिव्यक्ति को पृष्ठभूमि पर मजबूती से बढ़ाया जाता है और एलईडी एप्लिकेशन के साथ प्रेरित करने के समान होता है।

Figure 1
चित्रा 1: लाइट सील इन्क्यूबेटर. कार्डबोर्ड बॉक्स फ्लैप प्रबुद्ध नियंत्रण कक्ष (शीर्ष तीर) से प्रकाश को कवर करता है। इनक्यूबेटर के कांच के दरवाजे पर प्रकाश-अपारगम्य कवर (नीचे तीर) प्रकाश जोखिम से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लाल बत्ती से प्रकाशित लैमिनर प्रवाह हुड। सेटअप एक मानक लैमिनर प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड लाल बत्ती से प्रकाशित किया जा रहा है दिखा रहा है. तीर एक लाल बल्ब के साथ एक मानक डेस्कटॉप लैंप को इंगित करता है। लाल बत्ती के तहत सभी जोड़तोड़ एक अन्यथा अंधेरे प्रकाश-तंग कमरे में किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप के आसपास लाइट-टाइट डिब्बे। लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप सेटअप के दो उदाहरण केवल सामने की ओर प्लास्टिक के ड्रेप्स के साथ एक ठोस बॉक्स का उपयोग दिखाते हैं (बाएं पैनल: ऊपर और नीचे) या इमेजिंग सेटअप (दाएं पैनल: ऊपर और नीचे) के चारों ओर काले ड्रेप्स। दोनों उदाहरणों में सामने के पक्ष खुले रहते हैं और उपयोग में नहीं होने पर लुढ़के होते हैं (शीर्ष पैनल: बाएं और दाएं)। सामने के काले ड्रेप्स को कमरे में किसी भी प्रकाश को रोकने के लिए नीचे लुढ़काया जाता है (उदाहरण के लिए, कंप्यूटर स्क्रीन) लाइव-सेल बायोल्यूमिनेसेंस उत्तेजना और / या इमेजिंग (नीचे पैनल: बाएं और दाएं) करते समय इमेजिंग क्षेत्र में प्रवेश करने से रोकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं को एकीकृत करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस। (ए) एसबीजीएलयूसी के साथ सह-संक्रमित फ्लेयर घटकों की योजनाएं। Ca2+ की उपस्थिति में और प्रोटीज क्लीवेज साइट के लिए प्रोटीज की परिणामी निकटता, या तो बायोल्यूमिनेसेंस या एलईडी एलओवीओ के खुलासे, दरार साइट के संपर्क में आने और प्रतिलेखन कारक की रिहाई का कारण बनेगा। कोशिकाओं को एलईडी (ड्यूटी चक्र 33%, 2 s ऑन / 4 s बंद 40 मिनट के लिए; 3.5 mW प्रकाश शक्ति, 4.72 mW / cm2 विकिरण) या बायोल्यूमिनेसेंस (15 मिनट के लिए 100 μM CTZ अंतिम एकाग्रता) या अंधेरे में छोड़ दिया गया था। HEK293 कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपिक छवियां उपचार के बाद उपरोक्त घटकों को व्यक्त करने के लिए Ca2 + के स्तर को बढ़ाने और एलईडी (बाएं) के संपर्क में आने के लिए। FLuc luminescence एक luminometer में मापा एलईडी, bioluminescence (CTZ), या अंधेरे (दाएं) में छोड़ दिया करने के लिए जोखिम की तुलना में। (बी) एक गैर-Ca2 + - निर्भर प्रतिलेखन प्रणाली की योजनाबद्धता sbGLuc के साथ सह-transfected। 4-अच्छी तरह से प्लेटों में HEK293 कोशिकाओं को घटकों की चार अलग-अलग व्यवस्थाओं के साथ संक्रमित किया गया था जैसा कि योजनाबद्ध में दर्शाया गया है। प्लेटों को या तो एलईडी (ड्यूटी चक्र 33%, 2 s पर / 4 s 40 मिनट के लिए बंद; 3.5 mW प्रकाश शक्ति, 4.72 mW / cm2 विकिरण) या बायोल्यूमिनेसेंस (100 μM CTZ अंतिम एकाग्रता) के संपर्क में लाया गया था, सीटीजेड जोड़कर और इसे 15 मिनट के लिए छोड़कर; नियंत्रण प्लेटों अंधेरे में छोड़ दिया गया था। FLuc रिपोर्टर के प्रतिलेखन को एक IVIS में मापा गया था। प्रतिनिधि व्यंजनों की IVIS छवियों को बाईं ओर दिखाया गया है; अंधेरे नियंत्रण के लिए बेसलाइन किए गए कई प्रतिकृतियों से चमक माप दाईं ओर दिखाए गए हैं। स्केल बार = 100 μm. संक्षेप: FLARE = तेजी से प्रकाश- और गतिविधि-विनियमित अभिव्यक्ति; LOV = प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज-संवेदन; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; CTZ = coelenterazine; FLuc = firefly luciferase; dTom = dTomato; CRY2 = cryptochrome 2; CRY2PHR = CRY2 photolyase होमोलॉजी क्षेत्र; CIB1 = Ca2+- और integrin-बाइंडिंग प्रोटीन 1; CIBN = CIB1 का N-टर्मिनस; IVIS = विवो इमेजिंग सिस्टम में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिलेखन ड्राइविंग के लिए बायोल्यूमिनेसेंस( A) उनके अंधेरे और प्रकाश राज्यों में दो फोटोएक्टिवेबल ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम की योजनाएं। (बी) नैनोलक या तो सह-संक्रमित था या प्रकाश-संवेदन moieties के रूप में चित्रित (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C) के लिए फ्यूज किया गया था; N-NanoLuc-VP16-EL222-C)। (सी) प्रकाश स्रोतों के बारे में दोनों प्रणालियों का उपयोग करके तुलना, डिजाइन का निर्माण करें, और शोर के लिए संकेत। कोशिकाओं को एलईडी (40 मिनट के लिए ड्यूटी चक्र 33%, 2 s on /4 s बंद; 3.5 mW प्रकाश शक्ति, 4.72 mW / cm2 विकिरण) या 15 मिनट (100 μM hCTZ अंतिम एकाग्रता) के लिए बायोल्यूमिनेसेंस के संपर्क में लाया गया था; सिवाय इसके कि जहां विभिन्न सांद्रता नोट की जाती है)। अंधेरे, प्लेटों को प्लास्मिड और एफएलयूक माप के प्रारंभिक परिवर्तन के बीच इनक्यूबेटर में अछूता छोड़ दिया गया था; वीईएच, प्लेटों को एचसीटीजेड प्राप्त करने वालों के समान ही संभाला गया था, लेकिन इसके बजाय वाहन प्राप्त किया गया था। प्रतिलेखन स्तरों में अंतर: hCTZ, सह-transfected CRY बनाम EL222 - महत्वपूर्ण नहीं; hCTZ, लूसिफेरस - फोटोप्रोटीन संलयन CRY बनाम EL222 - पी < 0.005; hCTZ, CRY सह-अभिकर्मक बनाम संलयन - पी < 0.005; hCTZ, EL222 सह-अभिकर्मक बनाम संलयन - पी < 0.01; वाहन, CRY बनाम EL222 - पी < 0.05. संक्षेप: UAS = अपस्ट्रीम सक्रिय अनुक्रम; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; CTZ = coelenterazine; FLuc = firefly luciferase; CRY = cryptochrome; CIB = Ca2+ - और integrin-बाइंडिंग प्रोटीन; VEH = वाहन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ऑप्टोजेनोमिक हेरफेर के लिए बायोल्यूमिनेसेंस( ए) प्रकाश के आवेदन से पहले और बाद में, sbGLuc, विभाजित iCreV घटकों और एक LSL रिपोर्टर कैसेट का उपयोग करके बायोल्यूमिनेसेंस-संचालित ऑप्टोजेनोमिक हेरफेर की योजनाएं। (बी) एचईके 293 कोशिकाओं को प्लास्मिड के साथ लिपोफ़ेक्टेड किया गया था, फिर अंधेरे में रखा गया था। चौबीस घंटे बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए सिर्फ माध्यम (कोई सीटीजेड) या सीटीजेड (100 μM अंतिम एकाग्रता) के साथ या एलईडी (ड्यूटी चक्र 25%, 5 मिनट के लिए 5 एस ऑन / 15 एस ऑफ) के साथ 30 मिनट के लिए इलाज किया गया; 14.81 mW प्रकाश शक्ति, 20 mW / cm2 विकिरण) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में। tdTomato प्रतिदीप्ति की सूक्ष्म छवियों के रूप में संकेत के रूप में शर्तों का उपयोग कर. स्केल बार = 100 μm. संक्षेप: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazine; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; वीवीडी = ज्वलंत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: फोटोरिसेप्टर के बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: विभिन्न स्वरूपों में कोशिकाओं को चढ़ाना और ट्रांसफेक्ट करने के लिए दिशानिर्देश। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: अभिकर्मक के लिए विभिन्न प्लास्मिडों का अनुपात। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: इंजेक्शन मार्गों, मात्रा, और विवो अनुप्रयोगों (25 ग्राम माउस) में के लिए लूसिफेरिन की सांद्रता. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रकाश उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ लूसिफेरस और लूसिफेरिन की एक श्रृंखला है जो नीले से लाल प्रकाश 14,29 तक फोटोसेंसरी प्रोटीन के सक्रियण स्पेक्ट्रा से मेल खाती है। उत्सर्जन और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को संरेखित करने के अलावा, एक प्राथमिकता निर्धारित करने का कोई विश्वसनीय तरीका नहीं है जो युग्मन सबसे अच्छा काम करेगा। इस प्रकार, प्रयोगात्मक रूप से यह निर्धारित करने की आवश्यकता है कि कैसे लूसिफेरिन-लूसिफेरस जोड़े फोटोसेंसरी सिस्टम को चलाने में कोशिकाओं और जीवों में काम करते हैं।

इस प्रस्तुति में उल्लिखित प्रोटोकॉल बताते हैं कि लूसिफेरिन को कैसे तैयार किया जाए और इसे विट्रो और विवो में कैसे लागू किया जाए, साथ ही बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए कमरे, ऊतक संस्कृति हुड, इनक्यूबेटर और माइक्रोस्कोप की स्थापना पर दिशानिर्देशों के साथ। प्रतिनिधि प्रयोगों में, कई फोटोसेंसरी प्रोटीन (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV) के साथ विभिन्न लूसिफेरस (नैनोल्यूक, गॉसिया लूसिफेरस) का उपयोग किया गया था, जो बायोल्यूमिनेसेंस बनाम भौतिक प्रकाश, सह-अभिकर्मक बनाम संलयन प्रोटीन, सिग्नल-टू-शोर तुलना, और विभिन्न रीडआउट एसेस के प्रभावों का प्रदर्शन करता था। फोटोसेंसरी प्रोटीन को सक्रिय करने वाले बायोल्यूमिनेसेंस के अधिक अनुप्रयोगों को कई समूहों के प्रकाशनों में वर्णित किया गया है, जो प्रतिलेखन के अलावा सेल मृत्यु, सीएएमपी संश्लेषण और प्रोटीन आंदोलन के प्रेरण को लक्षित करता है (तालिका 1)।

बस प्रकाश उत्सर्जक और प्रकाश-संवेदन घटकों को सह-ट्रांसफेक्ट करना एक अच्छी शुरुआत है। चर उत्सर्जक और सेंसर के दाढ़ अनुपात हैं; अज्ञात अंधेरे में सेंसर गतिविधि की पृष्ठभूमि के स्तर हैं, प्रकाश तीव्रता और अवधि के संबंध में सेंसर गतिविधि, और शारीरिक और जैविक प्रकाश की तुलना में सेंसर सक्रियण की दक्षता। जबकि संलयन निर्माणों में उत्सर्जक और सेंसर के दाढ़ अनुपात को 1: 1 पर रखने और प्रकाश-संवेदन डोमेन के करीब प्रकाश उत्सर्जक लाने का लाभ होता है, अन्य विचार खेल में आते हैं, जैसे कि टेदर (एन- या सी-टर्मिनस) कहां है और फोटोसेंसरी एक्ट्यूएटर के प्रदर्शन को प्रभावित किए बिना लिंक (लिंकर लंबाई और संरचना) कैसे करें।

इन विट्रो और इन विवो दोनों प्रयोगों के लिए, बायोल्यूमिनेसेंट प्रकाश उत्सर्जन को ट्यून करने के लिए कई विकल्प हैं, या तो लूसिफेरिन की एकाग्रता को बदलकर, और / या संबंधित सेंसर के लिए लुसिफेरिन उपलब्ध कराए जाने के समय को बदलकर। न्यूनतम राशि और समय प्रकाश सक्रियण के साथ अपेक्षित प्रभाव की उपस्थिति या अनुपस्थिति से निर्धारित होते हैं। इसके विपरीत, संबंधित मैक्सिमा मुख्य रूप से लंबे समय तक लूसिफेरिन की उच्च सांद्रता के लिए कोशिकाओं की सहिष्णुता द्वारा निर्धारित की जाती है। उपरोक्त उदाहरणों में चुने गए सीटीजेड की एकाग्रता, 100 μM, HEK293 कोशिकाओं से न्यूरॉन्स तक, विभिन्न सेल प्रकारों के लिए ऊपरी सीमा के करीब है। लक्ष्य के रूप में कम से कम समय के लिए संभव के रूप में कम एकाग्रता के रूप में उपयोग करने के लिए लक्षित photosensing डोमेन के सक्रियण को प्राप्त करने के लिए है। यह उच्च प्रकाश उत्सर्जन और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता के साथ फोटोरिसेप्टर के साथ लूसिफेरस का उपयोग करके अधिक आसानी से प्राप्त किया जाएगा।

फोटोरिसेप्टर चलाने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का उपयोग कृन्तकों (चूहों, चूहों) में जिगर, मांसपेशियों, रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क में व्यक्त फोटोसेंसिंग प्रोटीन के साथ-साथ फोटोरिसेप्टर-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के माध्यम से किया जाता है जो चमड़े के नीचे या इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रत्यारोपित होते हैं। सिद्धांत रूप में, दृष्टिकोण को विभिन्न प्रजातियों पर लागू होने से रोकने की कोई सीमा नहीं है, गैर-मानव प्राइमेट्स से मछली या मक्खियों तक। लूसिफेरिन के लिए जीव की पारगम्यता के आधार पर, आवेदन आसपास के पानी में लूसिफेरिन को लागू करने के रूप में आसान हो सकता है (उदाहरण के लिए, मछली के लार्वा 30 में)। किसी भी नए जीव में बीएल-ओजी का उपयोग करने से पहले, पायलट प्रयोगों को यह सुनिश्चित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए कि लूसिफेरिन चुने गए आवेदन मार्ग के माध्यम से अपने लक्ष्यों तक पहुंचता है।

प्रयोगात्मक डिजाइन के महत्वपूर्ण पहलू विभिन्न नियंत्रण हैं जो परिणामों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक फोटोसेंसरी प्रोटीन पर अभिनय करने वाले लूसिफेरस द्वारा संचालित रिपोर्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना लूसिफेरस की कमी वाली कोशिकाओं या फोटोसेंसरी प्रोटीन की कमी वाली कोशिकाओं से की जानी चाहिए। इसके अलावा, लूसिफेरिन, वाहन के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं के बीच तुलना की जानी चाहिए, या अंधेरे में रखी जानी चाहिए। बायोल्यूमिनेसेंस-संचालित फोटोरिसेप्टर सक्रियण के प्रभावों का आकलन करने के लिए विभिन्न assays की सीमाओं का एहसास करना भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, बायोल्यूमिनेसेंस-सक्रिय प्रतिलेखन की प्रभावकारिता का परीक्षण विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि रिपोर्टर जीन एक ओर्थोगोनल लूसिफेरस (ल्यूमिनोमीटर, आईवीआईएस), या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग, माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण) है या नहीं। जबकि बुनियादी प्रभाव परीक्षण प्लेटफार्मों पर पुन: प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए, प्रभावों के मात्रात्मक पहलू काफी भिन्न हो सकते हैं।

फोटोरिसेप्टर के बायोल्यूमिनेसेंस सक्रियण को क्रमशः इन विट्रो और विवो दोनों में क्रमशः लुसिफेरस और फोटोसेंसरी प्रोटीन की एक सीमित संख्या के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसे कई और जैविक प्रक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए फोटोरिसेप्टर के बड़े वर्ग तक बढ़ाया जा सकता है। दृष्टिकोण के इस तरह के विस्तार को उपन्यास लूसिफेरेस और लूसिफेरस-प्रतिदीप्ति प्रोटीन जोड़े के निरंतर विकास द्वारा बढ़ावा दिया जाता है, जो स्वाभाविक रूप से होने वाले लूसिफेरस की तुलना में बहुत अधिक प्रकाश उत्सर्जन के साथ और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए ट्यूनेबल गतिज विशेषताओं के साथ होता है। इन अग्रिमों को उपन्यास लूसिफेरिन की पीढ़ी द्वारा समानांतर किया जाता है, आगे बढ़ी हुई चमक और रंग पैलेट्स 29 को जोड़ते हैं। यह उपकरण प्लेटफ़ॉर्म जीवित कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों के अंदर इंट्रासेल्युलर गतिशीलता और सेल इंटरैक्शन में हेरफेर और जांच करने के लिए एप्लिकेशन प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम निर्माणों के लिए अपने सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं, विशेष रूप से Ca-FLARE प्रोटीज, प्रतिलेखन कारक और रिपोर्टर (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon के लिए TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 और NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker for CRY-Galseddd (B1013) और CIB-Gal2DD (B1013) के लिए C. Tucker for CRY-Gal214, 92213, 92213, 92202) के लिए, H. Kwon for TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 और NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker for CRY-Galseddd (B1013) और CIB-GalsdD (B1013) के लिए C. Tucker for CRY-Gal2DDD (B1013) इस काम को NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation, और स्वीडिश रिसर्च काउंसिल से A.B. (2016-06760) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb Amazon to be used with any lamp stand
 Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies Fisher Scientific 03-391-166
Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies Fisher Scientific 03-391-161
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) THOR LABS BK-5
C120-Fluc K. Gardner
CaCl2 Sigma C8106; CAS: 10035-04-8
Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter Addgene # 92214, 92213, 92202 A. Ting
CIB-VP64 (B1016) Addgene # 92037 C. Tucker
CRY-GalΔDD (B1013) Addgene # 92035 C. Tucker
CTZ Prolume Inc. (NanoLight) 303 formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases
CTZ (Water soluble native coelenterazine) Prolume Inc. (NanoLight) 3031 formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases
D-(+)-Glucose Sigma G8270; CAS: 50-99-7
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK
DMEM Thermo Fisher 11960044
D-PBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher 14190144
hCTZ Prolume Inc. (NanoLight) 301 formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases
HEK293 ATCC CRL-1573
HeLa ATCC CCL-2
HEPES Sigma H3375; CAS: 7365-45-9
iCreV A. Cetin and H. Zeng
In Vivo Imaging System (IVIS) Perkin-Elmer Lumina LT
KCl Sigma P5405; CAS: 7447-40-7
LED Array Driver Amuza LAD-1
LED Array for Multiwell Plates Amuza LEDA-x
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019 Transfection reagent
Luminometer Molecular Devices SpectraMax L
MgCl2 Hexahydrate Sigma M2670; CAS: 7791-18-6
NaCl Sigma S7653; CAS: 7647-14-5
NanoFuel Solvent Prolume Inc. (NanoLight) 399 for dissolving CTZ preparations for in vitro use
NaOH Sigma 221465; CAS: 1310-73-2
NES-CRY2PHR-TevC Addgene # 89877 H. Kwon
Opti-MEM Thermo Fisher 11058021 transfection medium
PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) Neuvitro Corporation GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL
pGL2-GAL4-UAS-Luc Addgene #33020 M. Walsh
Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics Goldstone Scientific
TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 Addgene # 89878 H. Kwon
TrypLE Express Gibco 12604-013
Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) Prolume Inc. (NanoLight) 3031C control for in vivo applications with CTZ
VP-EL222 K. Gardner

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References

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जैव रसायन अंक 174
Bioluminescent Optogenetics 2.0: <em>विट्रो में</em> और <em>विवो</em> में फोटोसेंसरी प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस का दोहन
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Crespo, E. L., Bjorefeldt, A.,… More

Crespo, E. L., Bjorefeldt, A., Prakash, M., Hochgeschwender, U. Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (174), e62850, doi:10.3791/62850 (2021).

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