Summary
Bioluminescens-lys som avgis av et luciferase-enzym som oksiderer et lite molekylsubstrat, kan et luciferin-lys utnyttes for å aktivere fotosensoriske proteiner, og dermed legge til en annen dimensjon til lysstimulering og muliggjør manipulering av en rekke lysmedierte funksjoner i celler på tvers av tidsmessige og romlige skalaer.
Abstract
Bioluminescens - lys som slippes ut av et luciferase-enzym som oksiderer et lite molekylsubstrat, et luciferin - har blitt brukt in vitro og in vivo for å aktivere lysporterte ionkanaler og pumper i nevroner. Mens denne bioluminescent optogenetikk (BL-OG) tilnærmingen gir en kjemogenetisk komponent til optogenetiske verktøy, er det ikke begrenset til bruk i nevrovitenskap. Snarere kan bioluminescens utnyttes for å aktivere noe fotosensorisk protein, og dermed muliggjøre manipulering av en rekke lysmediert funksjoner i celler. En rekke luciferase-luciferin par kan matches med fotosensoriske proteiner som krever forskjellige bølgelengder av lys og lysintensiteter.
Avhengig av den spesifikke applikasjonen, kan effektiv lyslevering oppnås ved å bruke luciferase-photoreceptor fusjonsproteiner eller ved enkel co-transfection. Fotosensoriske proteiner basert på lysavhengig dimerisering eller konformasjonsendringer kan drives av bioluminescens for å påvirke cellulære prosesser fra proteinlokalisering, regulering av intracellulære signalveier til transkripsjon. Protokollen nedenfor beskriver den eksperimentelle utførelsen av bioluminescensaktivering i celler og organismer og beskriver resultatene ved hjelp av bioluminescensdrevne rekombinasjoner og transkripsjonsfaktorer. Protokollen gir undersøkere de grunnleggende prosedyrene for å utføre bioluminescent optogenetikk in vitro og in vivo. De beskrevne tilnærmingene kan utvides ytterligere og individualiseres til en rekke forskjellige eksperimentelle paradigmer.
Introduction
Fotosensoriske proteiner kan aktiveres av lys fra enten en fysisk lyskilde eller fra et luciferase-enzym i nærvær av substratet, luciferin, for å generere bioluminescens. For applikasjoner som krever milli- eller til og med femtosecond-tidsskalaer og/ eller encellet romlig oppløsning, er fysiske lyskilder (lasere og lysdioder (lysdioder)) de eneste som kan justeres til disse skalaene. Eksempler er den romlige begrensningen av lys som brukes til å stimulere motsatte poler i utviklingen av Drosophila larver med millisekunder temporal kontroll1 eller presis stimulering av enkle subcellulære strukturer som mitokondrie tubules2. Imidlertid har mange andre applikasjoner for optiske brytere forskjellige prioriteringer, inkludert utvidet romlig kontroll og gjentatt påføring ikke-invasivt og uten lysskader, men med definert tidskontroll i minutttidsskalaer og justerbare intensiteter. Her har bruk av luciferaser som en alternativ lyskilde for å aktivere lyssensordomener flere fordeler. I motsetning til optisk fiberlysaktivering når bioluminescens hvert lyssensordomene uttrykt i målcellepopulasjonen, da lyskilden er genetisk kodet. Bruk av bioluminescens lindrer bekymringer over vev og celleskader ved fiberoptikk og utvidet fysisk lyseksponering. Lyset slås på ved påføring av luciferase-substratet. Utbruddet er umiddelbar in vitro og in vivo avhengig av administrasjonsveien og varer i ~ 15-30 min; utvidet tilstedeværelse eller fasisk stimulering av lys kan oppnås med forskjellige luciferiner og med ytterligere eller gjentatte anvendelser av substrat3. Til slutt kan bioluminescensutslipp justeres ved å variere konsentrasjonen av luciferin.
Bruken av bioluminescens for å aktivere ionflytende fotoreseptorer, det vil si optogenetiske elementer, som kanalrhodopsiner eller pumper, har blitt omfattende demonstrert4,5,6,7,8. Denne BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG)-tilnærmingen har blitt brukt i in vivo-eksperimenter hos mus og rotter5,6,7,9,10,11,12. BL-OG aktivering av opsiner ble funnet å kreve en mengde bioluminescens på minst ~ 33 μW / mm2, med effektiviteten av aktivering økende med høyere lysutslipp6,9. Ion-bevegelige sensoriske fotoreseptorer er en undergruppe av den store kontingenten av sensoriske fotoreseptorer som finnes i naturen som ikke beveger seg13,14. Utvidelsen av bioluminescens til å aktivere ikke-ion bevegelige fotoreseptorer, for eksempel fotosenerende domener fra planter eller bakterier, oppmuntres av rapporter15,16 at ikke-ion bevegelige fotosensorer er betydelig mer lysfølsomme enn channelrhodopsins, noe som sikrer en enda bedre drivkraft for lyssensorer med bioluminescens enn allerede oppnådd med ionflytende optogenetiske elementer. Nylig rapporterte flere publikasjoner bruk av bioluminescens som lyskilde for aktivering av en rekke fotoreseptorer, inkludert lett-oksygen-spenning-sensing (LOV) domener, blå-lys-bruke-flavin (BLUF) domener, og cryptochromes (CRYs)3,17,18,19,20,21,22 (Tabell 1 ). Søknader om bioluminescensdrevet aktivering av optiske brytere rettet mot intracellulære prosesser som spenner fra reaktiv oksygenartindusert celledød, cAMP-syntese, proteinrekruttering og dissosiasjon til genomisk rekombinasjon og induksjon av transkripsjon.
Denne protokollen skisserer den generelle utformingen av bioluminescensdrevne optogenetiske verktøy og beskriver prosedyrene for eksperimentell utførelse av bioluminescensaktivering i celler og organismer. Det inkluderer beskrivelser av hvordan du setter opp et rom, en vevskultur hette og inkubator, og et mikroskop for arbeid med bioluminescens, samt trinnene fra å forberede luciferin til å bruke den. Denne protokollen gir undersøkere de grunnleggende prosedyrene for å utføre BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) in vitro og in vivo. De beskrevne tilnærmingene kan videre utvides og individualiseres til forskjellige eksperimentelle paradigmer. Vi forventer denne protokollen for å lette bruken av bioluminescens i optogenetiske biologiske studier.
Protocol
Alle prosedyrer i den nåværende studien ble utført ved hjelp av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjente protokoller for dyrehåndtering ved Central Michigan University, MI.
1. Bioluminescens aktivering av fotosensoriske proteiner in vitro
- Konstruerer
- Velg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusjonssekvens som vil resultere i uttrykk for en lysemitter som produserer lys av en bølgelengde som samsvarer med fotoreseptoren som skal aktiveres.
MERK: For eksempel kan blålysdiomitterende luciferaser, som Gaussia luciferase-varianter eller NanoLuc, kombineres med blå lysfølsomme fotoreseptorer som CRY/Ca2+- og integrinbindende protein (CIB), LOV eller Vivid (VVD). - Hvis det ikke allerede er tilgjengelig fra andre etterforskere eller plasmidavsetninger, bruk standard molekylærbiologiske teknikker for å klone DNA til et pattedyruttrykk plasmid.
MERK: Valget av promotører bestemmes av behovet for å gi et sterkt og konstituerende uttrykk for den lysemitterende modulen, slik som det som tilbys av CAG- og CMV-arrangørene. - For innledende studier, bruk separate plasmider for samtidig transfeksjon av lysemitteren og lyssensoren. Generer fusjonsproteiner av de to moieties etter behov og for etterfølgende studier.
- Få tak i plasmid-DNAer av høy kvalitet ved hjelp av mini-, midi- eller maxiprep-sett i henhold til produsentens protokoller.
- Velg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusjonssekvens som vil resultere i uttrykk for en lysemitter som produserer lys av en bølgelengde som samsvarer med fotoreseptoren som skal aktiveres.
- Cellekultur og transfeksjon
MERK: HeLa-celler og HEK293-celler brukes som eksempler i denne protokollen.- Plateceller i formater og tall i henhold til ønsket sluttbruk.
MERK: Spesifikke eksempler er gitt i tabell 2. Celletetthet på tidspunktet for plating vil avgjøre hvor snart celler kan transfekeres.- For vurdering av bioluminescensaktivert transkripsjon ved fluorescensmikroskopi, plate HEK293 celler på poly-D-lysin (PDL)-belagte 12 mm deksler plassert i 24-brønns retter.
- For å vurdere bioluminescensaktivert transkripsjon ved å måle lysutslipp fra en ortogonal reporter luciferase i et luminometer, plate HeLa celler i utgangspunktet i 6- eller 12-brønns retter for transfeksjon, men re-plate dem etter transfeksjon (se trinn 4).
- Hvis gjentatt bioluminescensstimulering vil bli utført i levende celleavbildningskamre, velg deksler av riktig størrelse og legg dem i multibrønnplater av riktig størrelse (24-brønnsplater for 12 mm deksler; 12-brønnsplater for 15 mm og 18 mm deksler). Frø cellene på toppen av dekslene ved hjelp av cellenumrene som er angitt i tabell 2. Hvis den valgte celletypen ikke holder seg godt til kulturoverflaten, kan du plate cellene på PDL-belagte retter.
- Utfør transfeksjon ved lipofeksjon i henhold til produsentens anbefaling eller bruk en transfeksjonsmetode som passer for den valgte celletypen.
MERK: Tabell 3 beskriver transfeksjonseksperimenter for to forskjellige fotoreseptorer, EL222 og CRY2/CIB, og deres respektive reporterplasmider, i tillegg til forskjellige lysdiomitterende proteiner. Forholdet mellom de forskjellige plasmidene fungerer bra for de valgte eksemplene, men må optimaliseres for hvert lysemitter / lyssensorpar. - Etter transfeksjon plasserer du cellene i en inkubator som er helt lysforseglet (figur 1).
- Avhengig av ønsket sluttbruk, bruk cellene til bioluminescensstimulering neste dag i sine opprinnelige brønner / retter, eller re-plate dem 3-4 timer etter lipofeksjon. For å lese transkripsjon av et firefly luciferase reportergen i et luminometer, re-plate cellene i hvite 96-brønns plater.
MERK: Utfør alle manipulasjoner i et lett trangt rom i en laminær strømningshette opplyst av rødt lys (figur 2).- Vask de transfekterte cellene én gang med Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) eller fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett minimumsvolumet av et trypsinizing reagens til brønnene (24-brønn: 100 μL; 12-brønn: 150 μL; 6-brønn: 300 μL) og inkuber cellene i 3 min ved 37 °C.
- Legg til kulturmedium for å oppnå en cellekonsentrasjon som vil gi riktig celletetthet for neste platingtrinn (for eksempel resuspendceller i en 24-brønns brønn i et siste volum på 1,2 ml for plating i 10 brønner av en 96-brønnsplate; resuspendceller i en 12-brønns brønn i et sluttvolum på 2,4 ml for plating i 20 brønner av en 96-brønnsplate). Slå sammen de transfekterte cellene fra flere brønner avhengig av antall brønner som trengs til slutt.
- Plate de transfected cellene i deres endelige format og returnere platene til den lysbeskyttede inkubatoren.
- Plateceller i formater og tall i henhold til ønsket sluttbruk.
- Aktivering av bioluminescens in vitro
- Forbered luciferase substratet (luciferin).
- Forbered 50 mM lagre ved å oppløse 5 mg lyofilisert coelenterazin (CTZ) i 250 μL av sitt spesifikke løsningsmiddel. Påse at all CTZ langs hetteglassets vegger er oppløst ved pipettering eller virveling. Beskytt hetteglasset mot direkte lys.
- Forbered 50 μL aliquots i 0,5 ml svarte mikrosenterrør og oppbevar ved -80 °C for fremtidig bruk.
MERK: CTZ oppløst i løsemiddel fryser ikke ved -80 °C. Aliquots kan fjernes fra og returneres til fryseren flere ganger for å lage arbeidsløsninger så lenge eksponering for lys og romtemperatur holdes på et minimum.
- Enkel bioluminescens lysstimulering
MERK: Alle manipulasjoner utføres i et lett trangt rom i en laminær strømningshette opplyst av rødt lys (figur 2).- Forbered en arbeidsløsning av luciferin i cellekulturmediet (DMEM eller NeuroBasal). Juster konsentrasjonen av luciferin slik at den endelige konsentrasjonen er 100 μM. Forbered alle fortynninger av CTZ i medium kort tid før du legger til cellene, da CTZ oksiderer over tid.
MERK: Hvis hele medievolumet skal skiftes ut, vil arbeidsløsningen være 100 μM. Hvis luciferinholdig medium legges til cellene, vil konsentrasjonen være høyere av fortynningsfaktoren (for eksempel vil tilsetning av 50 μL medium som inneholder 300 μM luciferin til 100 μL medium i brønnen resultere i en 1:3 fortynning og dermed i en 100 μM sluttkonsentrasjon av luciferin). - Tilsett luciferinholdig medium til cellene og inkuber for ønsket varighet av lysstimulering.
MERK: Dette kan være så kort som 1 min eller så lenge som 15 min og kan være enda kortere eller lengre. Hvor lang tid det tar å forlate det luciferinholdige mediet på cellene, avhenger av halveringstiden og kinetikken til den valgte luciferase-luciferin-kombinasjonen. - Overvåk lysutslipp ved 100 μM endelig luciferinkonsentrasjon for øyet etter å ha slått av det røde lyset; vent noen sekunder til øynene har justert seg til fullstendig mørke. Dokumenter lysutslippet ved å ta et bilde (selv med en mobiltelefon).
- Avslutt lysstimuleringen ved å fjerne det luciferinholdige mediet og erstatte det med kulturmedium. Avhengig av følsomheten til forsøkene, vask cellene med kulturmedium en eller to ganger etter at du har fjernet det luciferinholdige mediet for å eliminere alt luciferin. Hvis cellene ikke holder seg godt til kulturoverflaten, kan du plate dem på PDL-belagte retter for å unngå å miste cellene under vask.
- Returner cellene til den lysbeskyttede inkubatoren i 16-24 timer.
- Forbered en arbeidsløsning av luciferin i cellekulturmediet (DMEM eller NeuroBasal). Juster konsentrasjonen av luciferin slik at den endelige konsentrasjonen er 100 μM. Forbered alle fortynninger av CTZ i medium kort tid før du legger til cellene, da CTZ oksiderer over tid.
- Gjentatt bioluminescens lysstimulering
MERK: Alle manipulasjoner utføres i et rom som kan gjøres lett tetthet og belyses av rødt lys.- Sett opp bildekammeret for levende celler. Lag et lettgående rom rundt live-cell bildemikroskopet ved hjelp av en eske og svarte plastplater eller svarte gardiner (figur 3). Dekk til alle lyskildene som finnes inne i det lyse tette rommet og rommet (f.eks. LED-indikatorer på mikroskopet eller instrumentene).
- Sett opp perfusjonssystemet med ønsket løsning for inntak og kammeruthavnen som fører til en avfallsbeholder.
MERK: Bildeløsningen kan for eksempel være Tyrodes løsning (natriumklorid (124 mM), kaliumklorid (3 mM), HEPES (10 mM), kalsiumkloriddihydrat (2 mM), magnesiumklorid heksahydrat (1 mM), D-glukose (20 mM)). - Forbered en arbeidsløsning av luciferin i bildeløsningen. Aliquot inn i så mange mikrocentrifuge rør som antall gjentatte stimuleringer. Juster konsentrasjonen av luciferin slik at den endelige konsentrasjonen i bildekammeret er 100 μM.
- Plasser en deksle med transfekterte celler i kammeret.
- Mens du holder pumpen i gang, fjern pumpens innløpsrør fra inntaksbegeret og senk det raskt ned i luciferinløsningen, og hold overgangstiden så kort som mulig for å unngå lufthull i slangen.
- Så snart luciferinløsningen er tatt opp, plasser innløpsrøret tilbake i inntaksbegeret. Gjenta denne prosessen så mange ganger som nødvendig og i intervaller på flere minutter til timer, avhengig av det fysiologiske mønsteret som cellene skal eksponeres for.
- Returner cellene til den lysbeskyttede inkubatoren i 16-24 timer for transkripsjon, eller for den tiden effekten av lysstimulering skal vurderes.
- Forbered luciferase substratet (luciferin).
2. Bioluminescens aktivering av fotosensoriske proteiner in vivo
- Konstruerer
- Velg en luciferasesekvens eller luciferase-fluorescerende proteinfusjonssekvens som vil resultere i uttrykk for en lysemitter som produserer lys av en bølgelengde som samsvarer med fotoreseptoren som skal aktiveres.
- Bruk standard molekylærbiologiske teknikker for å klone DNA til en pAAV plasmid, hvis ikke allerede tilgjengelig fra andre etterforskere eller plasmidavsetninger.
- Velg sterke promotorer for uttrykket av de lysemitterende modulene, for eksempel CAG eller CMV.
- Bruk standard tilnærminger for å forberede high-titer virale aksjer6 eller ha virale vektorer kommersielt forberedt.
- For innledende studier, bruk separate virale vektorer for co-transduksjon av lysemitteren og lyssensoren for å tillate justering av forholdene til de forskjellige komponentene om nødvendig.
- AAV-transduksjon
- Injiser målorganet til det eksperimentelle dyret med virale vektorer av lysemitteren, lyssensoren og reporteren analogt med konsentrasjonsforholdene som brukes til in vitro-transfeksjonene (tabell 3).
- Returner dyrene til deres hjemmebur i minst 2 uker for å tillate maksimalt uttrykk for alle komponentene.
MERK: Hvis målorganet er inne i kroppen og beskyttet mot omgivelseslys, kan dyrene plasseres under normale lysforhold.
- Bioluminescens aktivering in vivo
- Forbered luciferase substratet (luciferin).
- Ta ut et hetteglass med vannløselig CTZ fra -80 °C fryseren og la det varme til romtemperatur. Hold den beskyttet mot lys.
- Per 500 μg hetteglass, tilsett 250 μL sterilt vann, bruk enten en sprøyte eller ved å åpne hetteglasset og tilsett vann med en pipette, og legg deretter gummiproppen tilbake på hetteglasset i glass.
- Inkuber det rekonstituerte hetteglasset i et 55 °C vannbad i noen minutter for å løse opp pulveret helt.
- Overfør løsningen til et svart mikrosenterrør. Skyll veggene i hetteglasset i glass for å hente all CTZ.
- Fjern mengden løsning som trengs for dagen. Oppbevar den gjenværende oppløsningen ved 4 °C for bruk neste dag. Ikke frys!
- Utfør de samme trinnene (2.3.1.1.-2.3.1.5) for et hetteglass med kjøretøy.
- Bioluminescens lysstimulering
- Fjern volumet av luciferin/kjøretøy som er nødvendig for størrelsen på dyret og søknadsruten som er valgt (tabell 4).
- Injiser dyrene med luciferin eller kjøretøy. Gjenta bioluminescenslysstimuleringen i henhold til eksperimentell design. For eksempel, hvis aktivering av en rekombininase er ønsket under et bestemt atferdsparadigme, injiser dyrene like før atferdstestingen. Hvis fasisk transkripsjon av et molekyl er målet, injiser dyrene gjentatte ganger over dager.
- Samle inn data fra de bioluminescens-stimulerte dyrene som designet.
- Forbered luciferase substratet (luciferin).
Representative Results
Det er mange intracellulære hendelser som kan manipuleres med aktuatorer som reagerer på lys, og som er mottagelige for bimodal aktivering med fysiske og biologiske lyskilder. Nedenfor er eksempler som bruker en fotosenserende kalsium (Ca2+) integrator, lysindusert proteintranslokasjon, en lysfølsom transkripsjonsfaktor og en lysfølsom rekombininase. Eksemplene illustrerer muligheten for å bruke bioluminescens for å aktivere ulike typer fotoreseptorer. Eksperimentene som ble presentert ble ikke spesielt optimalisert med hensyn til lysdiode (LED) applikasjon, den valgte luciferase, eller med hensyn til konsentrasjoner og tidspunkt for luciferin-applikasjonen.
Raskt lys- og aktivitetsregulert uttrykk (FLARE) er et optogenetisk system som tillater transkripsjon av et reportergen med samtidig forekomst av økt intracellulær Ca2+ og light23 (figur 4A). Tilstedeværelsen av Ca2 + er nødvendig for å bringe protease i nærheten av protease spalting området tilgjengelig bare med lys stimulering, noe som resulterer i frigjøring av transkripsjonsfaktoren. HEK293-celler ble co-transfektert med de originale FLARE-komponentene, en dobbel Firefly (FLuc)-dTomato reporterkonstruksjon og en membranforankret Gaussia luciferase variant sbGLuc6. I nærvær av økt intracellulær Ca2 + gjennom eksponering av celler til 2 μM ionomycin og 5 mM kalsiumklorid (CaCl2), førte anvendelsen av blå LED til robust uttrykk for fluorescensreporteren sammenlignet med celler igjen i mørket, samt til uttrykket av FLuc bestemt ved å måle luminescens ved å legge til FLuc-substratet, D-luciferin. Lignende nivåer av FLuc-uttrykk ble oppnådd med bioluminescens som ble avgitt av sbGLuc ved påføring av sbGLuc-substratet (CTZ) sammen med ionomycin og CaCl2. Vær oppmerksom på at luciferasene som brukes til lysaktivering (sbGLuc) og for rapportering av effekten av lysaktivering (transkripsjon av FLuc) bare produserer lys med sine respektive luciferiner (CTZ vs. D-luciferin) og ikke kryssreagerer.
Ulike komponenter ble kombinert for å generere et lysindusert transkripsjonssystem basert på heterodimerisering av kryptokromer23,24 (figur 4B). CRY2 ble smeltet sammen til en protease mens den membranbundne CIB ble smeltet sammen til protease spaltingsstedet og transkripsjonsfaktoren. Lysindusert proteintranslokasjon frigjorde transkripsjonsfaktoren, noe som førte til uttrykket av FLuc og dTomato, som vist i figur 4A. Mens tilstedeværelsen av transkripsjonsfaktorkomponenten alene resulterte i betydelig bakgrunnssignal muligens på grunn av spontan proteolyse, økte både fysisk lys (LED) og bioluminescens (CTZ) robust uttrykket av FLuc målt i et in vivo-bildebehandlingssystem (IVIS).
I et annet sett med eksperimenter ble NanoLuc (luciferin: furimazin eller hCTZ) brukt til optogenetisk regulering av transkripsjon gjennom dimerisering av CRY / CIB og den lysfølsomme transkripsjonsfaktoren, EL22225,26,27. Figur 5A,B viser skjemaene til de ulike komponentene i mørke og lyse tilstander, og luciferase-kotransfekten eller smeltet sammen til lyssensoren. Ulike sammenligninger vises i figur 5C. Bioluminescens, indusert ved å legge hCTZ til HEK293 celler som uttrykker konstruksjonene og fjerner den etter 15 min, var mer effektiv i kjørereportertranskripsjon enn 20 min LED-lyseksponering for både CRY / CIB og EL222. For CRY/CIB var en time med LED-eksponering tilstrekkelig til å nå et transkripsjonsnivå som kan sammenlignes med 15 min bioluminescens. For EL222 var til og med 60 minutter led knapt halvparten så effektiv som en kort eksponering for bioluminescens. Det var ingen signifikante forskjeller i transkripsjonseffekten mellom de to systemene da de ble transfektert, selv om fusjonsproteinene til CRY/CIB var mer effektive enn i EL222. For begge systemene førte fusjonsproteinene til betydelig høyere transkripsjonsnivåer enn de co-transfected komponentene. CRY/CIB viste konsekvent høyere bakgrunnsnivåer med kjøretøyapplikasjon sammenlignet med EL222, som hadde ubetydelig bakgrunnstranskripsjon. Økende konsentrasjoner av hCTZ alene hadde ingen effekt på transkripsjonen av reportergenet.
Photoactivatable rekombininaser gir et allsidig verktøy for optogenomiske manipulasjoner. Vi testet bioluminescensaktivering av en lysfølsom split Cre-rekombininase basert på Vivid LOV-proteinet, iCreV28. Figur 6A viser et skjema av de forskjellige komponentene, sbGLuc, iCreV og en lox-stop-lox fluorescensreporter (tdTomato) før og etter påføring av CTZ. Resultatene fra CTZ-programmet i forhold til kontroller (ingen CTZ eller LED) er vist i figur 6B. Det er noe bakgrunnsuttrykk selv i mørket (ingen CTZ); I nærvær av CTZ økes imidlertid uttrykket robust over bakgrunnen og ligner det som er indusert med LED-applikasjon.
Figur 1: Lett forseglet inkubator. Pappeskeklaff som dekker lyset fra det opplyste kontrollpanelet (topppil). Lett ugjennomtrengelig deksel over glassdøren til inkubatoren (nederste pil) for å beskytte cellene mot lyseksponering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Laminær strømningshette opplyst av rødt lys. Oppsett som viser en standard laminær strømningsvevskulturhette som belyses av rødt lys. Pil angir en standard skrivebordslampe med en rød pære. Alle manipulasjoner under rødt lys utføres i et ellers mørkt lystett rom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lyse tette rom rundt levende celleavbildningsmikroskoper. To eksempler på live-celle bildebehandling mikroskop oppsett som viser bruken av enten en solid boks med plast gardiner bare på forsiden (venstre paneler: topp og bunn) eller svarte gardiner rundt bildeoppsettet (høyre paneler: topp og bunn). Forsidene i begge eksemplene forblir åpne og rullet opp når de ikke er i bruk (topppaneler: venstre og høyre). De fremerste svarte gardinene rulles ned for å forhindre at lys i rommet (f.eks. dataskjermer) kommer inn i bildeområdet når du utfører live-celle bioluminescensstimulering og / eller bildebehandling (bunnpaneler: venstre og høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bioluminescens for integrering av intracellulære signalhendelser. (A) Skjemaer for FLARE-komponentene som er krysset sammen med sbGLuc. I nærvær av Ca2+ og den resulterende nærheten til protease til protease spalting nettstedet, enten bioluminescens eller LED vil føre til utfoldelse av LOV, eksponering av spalting nettstedet, og utgivelsen av transkripsjonsfaktoren. Celler ble eksponert for LED (driftssyklus 33%, 2 s på / 4 s av i 40 min; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW / cm2 bestråling) eller til bioluminescens (100 μM CTZ sluttkonsentrasjon i 15 minutter) eller igjen i mørket. Mikroskopiske bilder av HEK293-celler som uttrykker de ovennevnte komponentene etter behandling for å øke Ca2 + nivåer og eksponering for LED (venstre). FLuc luminescens målt i et luminometer som sammenligner eksponering for LED, bioluminescens (CTZ) eller venstre i mørket (høyre). (B) Skjemaer for et ikke-Ca2+-avhengig transkripsjonssystem som er krysset med sbGLuc. HEK293-celler i 4-brønnsplater ble transfektert med fire forskjellige ordninger av komponenter som avbildet i skjemaet. Plater ble eksponert for enten LED (driftssyklus 33%, 2 s på / 4 s av i 40 min; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW / cm2 bestråling) eller bioluminescens (100 μM CTZ sluttkonsentrasjon) ved å legge til CTZ og la den stå på i 15 minutter; kontrollplater ble etterlatt i mørket. Transkripsjon av FLuc-reporteren ble målt i en IVIS. IVIS-bilder av representative retter vises til venstre; utstrålingsmålinger fra flere replikerer grunnlinjet til de mørke kontrollene vises til høyre. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: FLARE = Raskt lys- og aktivitetsregulert uttrykk; LOV = lys-oksygen-spenning-sensing; LED = lysdiode; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; dTom = dTomato; CRY2 = cryptochrome 2; CRY2PHR = CRY2 fotolyase homologi region; CIB1 = Ca2+- og integrinbindende protein 1; CIBN = N-terminus av CIB1; IVIS = in vivo bildebehandlingssystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bioluminescens for kjøretranskripsjon. (A) Skjemaer av to fotoaktive transkripsjonssystemer i mørke og lyse tilstander. (B) NanoLuc ble enten co-transfektert eller smeltet sammen til de lysfølsomme moieties som avbildet (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Sammenligninger ved hjelp av begge systemene når det gjelder lyskilder, konstruksjonsdesign og signal til støy. Celler ble eksponert for LED (driftssyklus 33%, 2 s på / 4 s av i 40 min; 3,5 mW lyseffekt, 4,72 mW / cm2 bestråling) eller til bioluminescens i 15 min (100 μM hCTZ sluttkonsentrasjon; unntatt der forskjellige konsentrasjoner er notert). Mørk, plater ble igjen uberørt i inkubatoren mellom den første transformasjonen av plasmider og FLuc-måling; VEH, plater ble håndtert på samme måte som de som fikk hCTZ, men fikk i stedet kjøretøy. Forskjeller i transkripsjonsnivåer: hCTZ, co-transfected CRY vs. EL222 - ikke signifikant; hCTZ, luciferase - photoprotein fusion CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CRY co-transfection vs. fusion - p < 0,005; hCTZ, EL222 co-transfection vs. fusion - p < 0,01; kjøretøy, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Forkortelser: UAS = oppstrøms aktiveringssekvens; LED = lysdiode; CTZ = coelenterazin; FLuc = firefly luciferase; CRY = cryptochrome; CIB = Ca2+- og integrinbindende protein; VEH = kjøretøy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bioluminescens for optogenomisk manipulering. (A) Skjemaer av bioluminescensdrevet optogenomisk manipulering ved hjelp av sbGLuc, de delte iCreV-komponentene og en LSL-reporterkassett, før og etter påføring av lys. (B) HEK293-celler ble lipofektert med plasmider, og deretter holdt i mørket. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet i 30 minutter med bare middels (ingen CTZ) eller med CTZ (100 μM sluttkonsentrasjon) eller med LED (driftssyklus 25%, 5 s på / 15 s av i 5 min; 14,81 mW lyseffekt, 20 mW / cm2 bestråling) som en positiv kontroll. Mikroskopiske bilder av tdTomato fluorescens ved hjelp av forhold som angitt. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazin; LED = lysdiode; VVD = Levende. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Bioluminescensaktivering av fotoreseptorer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Retningslinjer for plating og transfekting av celler i forskjellige formater. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Forhold mellom ulike plasmider for transfeksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Injeksjonsruter, volumer og konsentrasjoner av luciferin for in vivo-applikasjoner (25 g mus). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Det er en rekke luciferaser og luciferiner med lysutslippsbølgelengder som samsvarer med aktiveringsspektraet til fotosensoriske proteiner fra blått til rødt lys14,29. Bortsett fra å justere utslipp og eksitasjonsbølgelengder, er det ingen pålitelig måte å bestemme a priori hvilken paring som vil fungere best. Dermed er behovet for å eksperimentelt bestemme hvordan luciferin-luciferase par fungerer i celler og organismer i drivende fotosensoriske systemer.
Protokollene som er skissert i denne presentasjonen beskriver hvordan du klargjør luciferin og hvordan du bruker den in vitro og in vivo, sammen med retningslinjer for oppsett av rom, vevskultur hetter, inkubatorer og mikroskoper for eksperimenter som bruker bioluminescens. I de representative eksperimentene ble forskjellige luciferaser (NanoLuc, Gaussia luciferase) med flere fotosensoriske proteiner (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV) brukt, noe som demonstrerer effekten av bioluminescens versus fysisk lys, co-transfeksjon versus fusjonsproteiner, signal-til-støy-sammenligninger og forskjellige avlesningsanalyser. Flere anvendelser av bioluminescensaktiverende fotosensoriske proteiner er beskrevet i publikasjoner fra flere grupper, rettet mot induksjon av celledød, cAMP-syntese og proteinbevegelse i tillegg til transkripsjon (tabell 1).
Bare samtidig transfekterende lysdiomitterende og lysfølsomme komponenter er en god start. Variabler er molarforholdene til emitter og sensor; ukjente er bakgrunnsnivåer av sensoraktivitet i mørket, sensoraktivitet i forhold til lysintensitet og varighet, og effektiviteten av sensoraktivering som sammenligner fysisk og biologisk lys. Mens fusjonskonstruksjoner har fordelen av å holde molarforholdet mellom emitter og sensor på 1:1 og bringe lysemitteren nær det lysfølsomme domenet, kommer andre hensyn inn i bildet, for eksempel hvor du skal tether (N- eller C-terminus) og hvordan du kobler (linkerlengde og sammensetning) uten å påvirke ytelsen til den fotosensoriske aktuatoren.
For eksperimenter både in vitro og in vivo, er det flere alternativer for tuning bioluminescent lysutslipp, enten ved å variere konsentrasjonen av luciferin, og / eller ved å variere tiden luciferin er gjort tilgjengelig for den respektive sensoren. Minimumsmengden og tiden bestemmes av tilstedeværelsen eller fraværet av effekten som forventes med lysaktivering. I motsetning er den respektive maxima hovedsakelig bestemt av toleransen av celler til høye konsentrasjoner av luciferin over lengre tid. Konsentrasjonen av CTZ valgt i eksemplene ovenfor, 100 μM, er nær den øvre grensen for ulike celletyper, fra HEK293-celler til nevroner. Målet er å bruke så lav konsentrasjon som mulig i kortest mulig tid for å oppnå aktivering av det målrettede fotoseneringsdomenet. Dette vil oppnås lettere ved hjelp av luciferaser med høy lysutslipp og fotoreseptorer med høy lysfølsomhet.
Bioluminescens for kjøring av fotoreseptorer har blitt brukt hos gnagere (mus, rotter) med fotosenerende proteiner uttrykt i leveren, muskelen, ryggmargen og hjernen, samt via fotoreseptor-uttrykkende celler transplantert subkutant eller intraperitonealt. I prinsippet er det ingen grenser som hindrer tilnærmingen i å bli brukt på forskjellige arter, fra ikke-menneskelige primater til fisk eller fluer. Avhengig av organismens permeabilitet for luciferin, kan applikasjonen være like enkel som å bruke luciferin på det omkringliggende vannet (f.eks. i fiskelarver30). Før du bruker BL-OG i en ny organisme, må pilotforsøk utføres for å sikre at luciferin når sine mål via den valgte applikasjonsruten.
Kritiske aspekter ved eksperimentell design er de ulike kontrollene som er viktige for tolkningen av resultatene. Celler som uttrykker en reporter drevet av en luciferase som virker på et fotosensorisk protein, bør sammenlignes med celler som mangler luciferase eller mangler fotosensorisk protein. Videre bør sammenligninger gjøres mellom celler som er utsatt for luciferin, kjøretøy eller holdes i mørket. Det er også viktig å realisere begrensningene i ulike analyser for å vurdere effekten av bioluminescensdrevet fotoreseptoraktivering. For eksempel kan effekten av bioluminescensaktivert transkripsjon testes på forskjellige måter, avhengig av om reportergenet er en ortogonal luciferase (luminometer, IVIS) eller et fluorescerende protein (fluorescensaktivert cellesortering, mikroskopisk bildeanalyse). Selv om de grunnleggende effektene bør reproduseres på tvers av testplattformer, kan de kvantitative aspektene ved effektene variere betydelig.
Bioluminescensaktiveringen av fotoreseptorer har blitt demonstrert så langt for et begrenset antall luciferaser og fotosensoriske proteiner, henholdsvis in vitro og in vivo. Det kan utvides til den store klassen av fotoreseptorer for å aktivere mange flere biologiske prosesser. En slik utvidelse av tilnærmingen fremmes videre av den kontinuerlige utviklingen av nye luciferaser og luciferase-fluorescensproteinpar med mye høyere lysutslipp enn naturlig forekommende luciferaser og med kinetiske egenskaper som kan justeres til forskjellige applikasjoner. Disse fremskrittene er parallelt med genereringen av nye luciferiner, og legger ytterligere til økt lysstyrke og fargepaletter29. Denne verktøyplattformen tilbyr applikasjoner for å manipulere og undersøke intracellulær dynamikk og celleinteraksjoner i levende celler, vev og organismer.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker våre kolleger for konstruksjoner, spesielt A. Ting for Ca-FLARE-protease, transkripsjonsfaktor og reporter (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon for TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 og NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker for CRY-GalΔDD (B1013) og CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh for pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner for VP-EL222 og C120-Fluc, og A. Cetin og H. Zeng for å gjøre iCreV tilgjengelig før publisering. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation og Det svenske forskningsrådet til A.B. (2016-06760).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
| C120-Fluc | K. Gardner | ||
| CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
| Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
| CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
| CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
| CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
| CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
| hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
| iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
| In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
| KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
| LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
| LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
| MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
| NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
| NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
| NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
| PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
| pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
| Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
| TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
| VP-EL222 | K. Gardner |
References
- Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Li, T., et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nature Communications. 12 (1), 615 (2021).
- Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons. PLoS One. 8 (3), 59759 (2013).
- Tung, J. K., Gutekunst, C. -A., Gross, R. E. Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition. Scientific Reports. 5, 14366 (2015).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).
- Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).
- Moore, C. I., Berglund, K.
- Park, S. Y., et al. Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).
- Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).
- Zenchak, J. R., et al. Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model. Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).
- Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity. Neurobiology of Disease. 109, Pt A 1-10 (2018).
- Hegemann, P.
- Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A.
- Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).
- Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).
- Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer. Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions. Elife. 8, 43826 (2019).
- Parag-Sharma, K., et al. Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).
- Kim, E. H., et al. Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins. Science Advances. 6 (37), (2020).
- Kim, C. K., et al. A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion. Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).
- Wang, W., et al. A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).
- Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
- Pathak, G. P., et al. Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2. Nucleic Acids Research. 45 (20), 167 (2017).
- Nishio, H., Walsh, M. J. CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Yao, S., et al. RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations. Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).
- Love, A. C., Prescher, J. A. Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology. Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).
- Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).
