Summary
A interação de um remodelador de cromatina dependente de ATP com um ligante de DNA é descrita usando espectroscopia de CD. As alterações conformais induzidas em um promotor genético analisado pelos picos gerados podem ser usadas para entender o mecanismo de regulação transcricional.
Abstract
A espectroscopia do dicromaísmo circular (CD) é um método simples e conveniente para investigar a estrutura secundária e as interações das biomoléculas. Os recentes avanços na espectroscopia de CD permitiram o estudo das interações DNA-proteína e da dinâmica conformacional do DNA em diferentes microambientes em detalhes para uma melhor compreensão da regulação transcricional in vivo. A área ao redor de uma zona de transcrição em potencial precisa ser desenrolada para que a transcrição ocorra. Trata-se de um processo complexo que requer a coordenação de modificações de histona, vinculação do fator de transcrição ao DNA e outras atividades de remodelação da cromatina. Utilizando espectroscopia de CD, é possível estudar mudanças conformais na região promotora causadas por proteínas regulatórias, como remodeladores de cromatina dependentes de ATP, para promover a transcrição. As alterações conformais que ocorrem na proteína também podem ser monitoradas. Além disso, consultas sobre a afinidade da proteína com seu DNA alvo e especificidade de sequência podem ser abordadas incorporando mutações no DNA alvo. Em suma, a compreensão única desse método sensível e barato pode prever mudanças na dinâmica da cromatina, melhorando assim a compreensão da regulação transcricional.
Introduction
O dichroismo circular (CD) é uma técnica espectroscópica que se baseia na quiralidade inerente das macromoléculas biológicas que leva à absorção diferencial da luz circularmente polarizada destro e canhoto. Essa absorção diferencial é conhecida como dicromaísmo circular. A técnica, portanto, pode ser utilizada para delinear a conformação de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA, ambas contendo centros quirais1,2.
As ondas eletromagnéticas contêm componentes elétricos e magnéticos. Tanto os campos elétricos quanto os magnéticos oscilam perpendiculares à direção da propagação de ondas. No caso da luz não polarizada, esses campos oscilam em muitas direções. Quando a luz é polarizada circularmente, dois campos eletromagnéticos são obtidos a 90° diferença de fase um para o outro. As moléculas quirais mostram rotação óptica circular (birefringência) de tal forma que absorverão a luz circularmente polarizada e a luz circularmente polarizada com mão esquerda em diferentes extensões3. O campo elétrico resultante será traçado como uma elipse, uma função do comprimento de onda. O espectro de CD é, portanto, registrado como elíptica (q), e os dados são apresentados como Elipticidade de Resíduo Médio em função do comprimento de onda.
No caso das proteínas, o Cα de aminoácidos (exceto glicina) é quiral, e este é explorado pela espectroscopia de CD para determinar a estrutura secundária desta macromolécula4. Os espectros de CD de moléculas de proteínas são tipicamente registrados na faixa Far UV. α-helical proteínas têm duas bandas negativas a 222 nm e 208 nm e um pico positivo de 193 nm4. Proteínas com estrutura secundária anti-paralela de β folhas mostram um pico negativo de 218 nm e um pico positivo de 195 nm4. Proteínas com estruturas desordenadas apresentam baixa elíptica perto de 210 nm e um pico negativo de 195 nm4. Assim, o pico/bandas bem definidos para diferentes estruturas secundárias fazem do CD uma ferramenta conveniente para elucidar as alterações conformais ocorridas na estrutura secundária das proteínas durante a desnaturação, bem como a ligação de ligantes.
Os ácidos nucleicos têm três fontes de quiralidade: a molécula de açúcar, a helicidade da estrutura secundária e a ordem terciária de longo alcance do DNA no ambiente5,6. Os espectros de CD de ácidos nucleicos são tipicamente registrados na faixa de 190 a 300 nm5,6. Cada conformação do DNA, assim como as proteínas, dá um espectro característico, embora os picos/bandas possam variar em alguns graus devido às condições de solvente e diferenças nas sequências de DNA7. O B-DNA, a forma mais comum, é caracterizado por um pico positivo em torno de 260-280 nm e um pico negativo em torno de 245 nm6. Os picos/bandas de DNA de forma B são geralmente pequenos porque os pares de base são perpendiculares à dupla hélice, conferindo quiralidade fraca à molécula. O DNA A dá um pico positivo dominante de 260 nm e um pico negativo em torno de 210 nm6. Z-DNA, a hélice canhota, dá uma faixa negativa a 290 nm e um pico positivo em torno de 260 nm6. Este DNA também dá um pico extremamente negativo em 205 nm6.
Além dessas conformações, o DNA também pode formar trigêmeos, quadruplos e grampos, todos os quais podem ser distinguidos pela espectroscopia do CD. O G-quadruplex paralelo dá uma faixa positiva dominante a 260 nm, enquanto o G-quadruplex anti-paralelo dá uma banda negativa a 260 nm e um pico positivo de 290 nm, tornando fácil distinguir entre as duas formas de estruturas quádruplas6. Triplexes não dão um espectro característico8. Por exemplo, os espectros de um DNA de 36 nucleotídeos com potencial para formar uma hélice tripla intramolecular contendo pares de base G.G.C e T.A.T na presença de Na+ mostram uma forte faixa negativa a 240 nm e um pico positivo amplo. O amplo pico positivo mostra contribuições em 266, 273 e 286 nm. O mesmo oligonucleotídeo na presença de Na+ e Zn+ mostra quatro bandas negativas (213, 238, 266 e 282 nm) e um pico positivo de 258 nm. Assim, os espectros do DNA triplex podem variar dependendo das condições do sal8.
Além dessas conformações, os espectros de CD permitiram a identificação de outra forma de DNA chamada DNA X. O DNA-X é formado quando a sequência de DNA contém resíduos alternativos de adenina e timina. Os espectros de CD do DNA X contêm dois picos negativos de 250 e 280 nm. Há muito pouca informação disponível sobre O X-DNA, embora tenha sido especulado para funcionar como uma pia para supercoilação positiva6,9. Mudanças nos espectros de CD também podem revelar detalhes sobre interações ligantes-proteínas e, portanto, foram adicionadas ao arsenal de métodos moleculares para detectar interações medicamentosa-proteína10,11,12,13,14. Os espectros de CD também têm sido utilizados para monitorar as mudanças na estrutura secundária de proteínas durante o processo de dobramento15. Da mesma forma, os espectros de CD também podem ser usados para sondar interações ligantes-DNA16,17.
A espectroscopia de CD, portanto, é um método fácil e barato para distinguir entre as diferentes formas de conformação de DNA, desde que haja acesso a equipamentos e softwares não tão baratos. O método é extremamente sensível e rápido. Requer apenas uma pequena quantidade de DNA, dando-lhe uma vantagem sobre a técnica alternativa de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Titulações com ligantes e substratos também são fáceis de executar. A maior restrição é que o DNA deve ser altamente puro. É aconselhável usar eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE)-purificada dna.
As informações obtidas pelos espectros de CD têm sido usadas principalmente para deduzir características estruturais proteicas e identificar conformadores de DNA distintos. Neste estudo, os espectros de CD têm sido utilizados para integrar os resultados obtidos a partir de um experimento in vivo Chromatin Imunoprecipitation (ChIP) para delinear se a proteína de interesse/fator de transcrição predito pode provocar uma mudança conformacional na região promotora de seus genes efeitos. Essa colaboração auxilia no progresso das técnicas espectroscópicas tradicionais do CD, prevendo o mecanismo de regulação da transcrição pelo fator de transcrição previsto sobre e em torno do site de início da transcrição (TSS) de um promotor.
A remodelagem da cromatina é um mecanismo bem definido conhecido para regular os processos metabólicos do DNA, tornando a cromatina bem embalada acessível a vários fatores regulatórios, como fatores de transcrição, componentes da replicação do DNA ou proteínas de reparação de danos. Os remodeladores de cromatina dependentes de ATP, também conhecidos como a família de proteínas SWI/SNF, são proteínas remodeladoras-chave presentes em células eucarióticas18,19. O agrupamento filogenético categorizou a família de proteínas SWI/SNF em 6 subgrupos20: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, e distante. O SMARCAL1, proteína de interesse neste estudo, pertence ao subgrudo distante20. Esta proteína tem sido usada para investigar seu modo de regulação transcricional usando espectroscopia de CD.
A maioria dos membros das proteínas de remodelação de cromatina dependentes da ATP tem sido mostrada para reposicionar ou despejar nucleossomos ou mediar a troca de variantes histone de forma dependente de ATP21,22. No entanto, alguns membros desta família não foram mostrados para remodelar nucleosomos, por exemplo, SMARCAL1. Embora estudos tenham demonstrado que o SMARCAL1 associa-se a cromossomos de politenso, faltam evidências experimentais sobre sua capacidade de remodelar nucleossomos. Portanto, foi postulado que o SMARCAL1 pode regular a transcrição alterando a conformação do DNA24. A espectroscopia de CD forneceu um método fácil e acessível para validar essa hipótese.
SMARCAL1 é uma proteína de remodelação de cromatina dependente de ATP que funciona principalmente como uma helicase de ressaramento25,26,27. Foi postulado para modular a transcrição remodelando a conformação de DNA24. Para testar essa hipótese, foi estudado o papel do SMARCAL1 na regulação da transcrição genética durante o dano de DNA induzido pela doxibicina. Nesses estudos, foi utilizado SMARCAL1 para análise in vivo e ADAAD para ensaios in vitro28,29. Estudos anteriores mostraram que a ADAAD pode reconhecer o DNA de forma dependente da estrutura, mas independente de sequência30,31. A proteína se liga idealmente a moléculas de DNA que possuem dois fios em regiões de transição de fios únicos, semelhantes ao DNA de laço-tronco, e hidrolisa ATP 30,31.
Experimentos in vivo mostraram que o SMARCAL1 regula a expressão de MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER por vinculação às regiões promotoras28,29. A região de interação foi identificada pelos experimentos chip28,29. A técnica ChIP é usada para analisar a interação de uma proteína com seu DNA cognato dentro da célula. Seu objetivo é determinar se proteínas específicas, como fatores de transcrição em promotores ou outros locais de ligação de DNA, estão vinculadas a áreas genômicas específicas. A proteína ligada ao DNA é a primeira ligada cruzada usando formaldeído. Isso é seguido pelo isolamento da cromatina. A cromatina isolada é desarquivada a fragmentos de 500 bps, seja por sônica ou digestão nuclease, e a proteína ligada ao DNA é imunoprecipitada usando anticorpos específicos da proteína. A ligação cruzada é invertida, e o DNA é analisado usando a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou a PCR quantitativa em tempo real.
Os resultados do ChIP levaram à hipótese de que o SMARCAL1 possivelmente media a regulação transcricional, induzindo uma mudança conformacional nas regiões promotoras desses genes. O mapeador QGRS e o software Mfold foram utilizados para identificar o potencial dessas regiões promotoras para formar estruturas secundárias28,29. O mapeador QGRS é usado para prever G-quadruplexes32, enquanto o Mfold33 analisa a capacidade de uma sequência de formar estruturas secundárias, como alças-tronco.
Após análise de estrutura secundária, outros experimentos in vitro foram realizados com ATPase A Domain (ADAAD) dependente de DNA ativo recombinante 6X, o homólogo bovino do SMARCAL1, purificado de Escherichia coli34. Os ensaios atpase foram realizados utilizando-se a ADAAD para estabelecer que as sequências de DNA identificadas poderiam atuar como efeitos28,29. Finalmente, foi realizada a espectroscopia de CD para monitorar as alterações conformais induzidas na molécula de DNA por ADAAD28,29.
Para provar que a atividade ATPase da proteína foi essencial para induzir uma alteração conformacional na molécula de DNA, ou o ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA) foi adicionado ao chelate Mg+2 ou ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), um inibidor específico da proteína SWI/SNF, foi adicionado 35,36 . Esta técnica espectroscópica do CD pode ser utilizada com qualquer proteína purificada que tenha sido demonstrada pelo ChIP ou qualquer outro ensaio relevante para se ligar a uma região genômica prevista de um promotor.
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Protocol
1. Concentração de trabalho dos componentes de reação
- Prepare as concentrações de trabalho dos buffers para CD e outros componentes de reação recentemente (ver Tabela 1) e mantenha-os a 4 °C antes de configurar as reações.
NOTA: Para as reações do CD descritas neste artigo, as concentrações de trabalho dos componentes são as seguintes: Tampão de fosfato de sódio (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Proteína 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Atividade atpase
- Antes da espectroscopia do CD, estabeleça a atividade ATPase da proteína na presença das moléculas de DNA para garantir que a proteína usada na espectroscopia do CD esteja ativa e identificar as moléculas de DNA que são ótimamente eficazes na obtenção da hidrólise ATP.
- Meça a atividade ATPase da proteína na presença de diferentes moléculas de DNA por um ensaio de oxidação acoplado ao NADH que consiste nas duas reações seguintes.
- Misture 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, DNA de 10 nM e 1x tampão REG em uma placa de 96 poços até um volume final de 250 μL.
NOTA: A enzima de quinase piruvato usa o ADP e Pi para converter fosfoenolpyruvato em piruvato, regenerando assim ATP. Isso garante que a ATP esteja sempre em uma concentração saturada na reação. Na segunda reação, o piruvato formado pela ação da quinase piruvato é convertido por lactato desidrogenase em lactato. Nesta reação, uma molécula de NADH é oxidada ao NAD+. O consumo de NADH é medido medindo a absorvência da molécula a 340 nm. - Incubar por 30 min a 37 °C em uma incubadora.
- Meça a quantidade de NAD+ em 340 nm usando um leitor de microplacas.
- Para medir a quantidade de NAD+, use o software fornecido junto com o leitor de microplacões.
- Clique no ensaio NADH para medir a absorvência em 340 nm.
- Coloque a placa de 96 poços no porta-placas do instrumento. Clique no botão Ler placa para registrar a absorvência.
NOTA: A concentração de NAD+ é calculada utilizando-se o coeficiente de extinção molar de NADH como 6,3 mM−1 usando eq (1).
A = εcl (1)
Aqui, A = Absorvência
ε = Coeficiente de extinção molar
c = Concentração molar
l = Comprimento do caminho óptico em cm
- Misture 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, DNA de 10 nM e 1x tampão REG em uma placa de 96 poços até um volume final de 250 μL.
3. Escolha e preparação de cuvetas de CD
- Colete espectros de CD em cuvetas de quartzo de alta transparência. Use cuvetas retangulares ou cilíndricas.
NOTA: Foi utilizado um cuvette de quartzo CD (volume nominal de 0,4 mL, comprimento do caminho de 1 mm) para todas as reações descritas neste artigo. - Use uma solução de limpeza de cuvette para limpar a cuvette. Adicione 1% de solução de limpeza de cuvette na água para fazer 400 μL da solução, despeje-a na cuvette e incuba-a a 37 °C por 1h.
- Lave a cuvette com água várias vezes para limpar a cuvette. Faça uma varredura da água ou do tampão no cuvette para verificar se ela está limpa.
NOTA: A água ou o tampão devem dar uma leitura na faixa de 0 a 1 mdeg.
4. Preparação de proteínas e oligonucleotídeos de DNA
- Mantenha o volume da proteína abaixo de 50 μL na reação para minimizar as quantidades dos componentes tampão que às vezes causam a formação de picos ambíguos. Mantenha a proteína no gelo durante todo o experimento para evitar qualquer degradação.
- Use oligonucleotídeos de DNA purificados por PAGE nas reações.
NOTA: Nas reações aqui descritas, o DNA foi usado tanto em formas nativas quanto refrescaram o calor (fc ) e refrigerados lentamente (SC). O resfriamento rápido promove a ligação intramolecular no DNA, produzindo estruturas mais secundárias. Em contraste, o resfriamento lento promove a ligação intermolecular no DNA, resultando em menos estruturas secundárias. - Para resfriamento rápido, aqueça o DNA a 94 °C por 3 minutos no bloco de aquecimento e esfrie-o imediatamente no gelo. Para resfriamento lento, aqueça o DNA a 94 °C por 3 minutos e deixe esfriar até a temperatura ambiente a uma taxa de 1 °C por minuto.
5. Configuração de experimentos de controle para gravar o espectro da linha de base
- Mantenha o volume de reação em 300 μL em todas as reações. Configure um total de 5 reações de linha de base em tubos de centrífugas de 1,5 mL, um a um, da seguinte forma: i) Tampão + Água; ii) Buffer + MgCl2 + ATP + Água; iii) Tampão + MgCl2 + ATP + Proteína + Água; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampão + Proteína +Água.
6. Configuração dos experimentos para gravar espectros de CD
- Configure um total de 5 reações, uma a uma, em tubos de centrífugas de 1,5 mL da seguinte forma: i) Buffer + DNA + Água; ii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Água; iii) Tampão + DNA + MgCl2 + ATP + Proteína + Água; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampão + DNA + Proteína +Água.
7. Gravação
- Ligue o gás e ligue o espectrômetro do CD.
- Ligue a lâmpada depois de 10-15 min. Ligue o banho de água e coloque a temperatura do suporte em 37 °C.
- Abra o software de espectro de CD .
- A temperatura é de 37 °C.
- Coloque o comprimento de onda em 180 - 300 nm.
- Defina o tempo por ponto para 0,5 s.
- Defina o número da varredura para 5.
- Clique no Pro-Data Viewer, faça um novo arquivo e renomeie-o com detalhes sobre o experimento e a data.
- Mantenha todos os componentes de reação no gelo para evitar qualquer degradação. Faça as linhas de base e as reações, uma a uma, em tubos de centrífugas e misture-as por pipetação. Transfira a mistura de reação para o cuvette cuidadosamente, garantindo que não haja bolhas de ar.
- Se realizar um experimento de curso de tempo, incubar as reações a 37 °C pelo tempo necessário e fazer a varredura. Adicione EDTA ao buffer contendo o DNA, ATP, Mg+2 e proteína para parar a hidrólise ATP.
- Aumente completamente a concentração de EDTA e seu tempo de incubação para inibir completamente a atividade atpase.
- Subtraia as linhas de base das reações correspondentes no software (por exemplo, subtrair a reação 1 da linha de base 1). Suavizar os dados no software de espectro de CD ou no software de plotagem de dados. Plote os dados no software de plotagem de dados.
NOTA: Subtrair as linhas de base das reações correspondentes dará ao espectro de CD líquido apenas DNA.
8. Análise e interpretação de dados
- Utilize a fórmula dada pelo eq (2) para converter os valores obtidos em miligres para significar elíptica de resíduos.
(2)
Aqui, S é o sinal de CD em milígrees, c é a concentração de DNA em mg/mL, mRw é a massa de resíduo médio, e l é o comprimento do caminho em cm. - Plote um gráfico contra o comprimento de onda e a elipticidade média de resíduos usando o software de plotagem de dados e analise os picos.
- Para traçar o gráfico, selecione a elipticidade média do resíduo no eixo Y e comprimento de onda no eixo X e plote um gráfico em linha reta.
NOTA: Este gráfico fornecerá as características de picos de diferentes formas de DNA. As formas de DNA correspondentes aos picos podem ser identificadas utilizando-se a literatura existente6.
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Representative Results
ADAAD estabiliza uma estrutura semelhante a um loop-tronco no promotor MYC
Evidências experimentais anteriores mostraram que o SMARCAL1 é um regulador negativo do MYC29. A análise da região promotora de 159 bp do gene MYC pelo mapeador QGRS mostrou que a vertente dianteira tinha o potencial de formar um G-quadruplex (Tabela 2). Mfold mostrou que ambos os fios do DNA MYC poderiam formar uma estrutura semelhante a um laço de haste (Tabela 2). Uma sequência de DNA de 34 bps contendo o G-quadruplex (GECE) foi sintetizada. As estruturas Mfold da frente e a sequência inversa do oligonucleotídeo GECE são mostradas na Figura 1A,B.
Os ensaios ATPase usando 6X His-ADAAD mostraram que o GECE resfriado rápido era um efeito melhor do que o nativo e as formas de resfriamento lento. Portanto, o GECE de refreso rápido foi usado para gravar o espectro do CD na ausência e presença de ATP e ADAAD. O espectro do CD mostrou que a ADAAD induz dois picos positivos-um a 258 nm com um ombro a 269 nm e um pico maior de 210 nm no DNA (Figura 1C). Também foi observada uma queda em direção ao negativo em torno de 240 nm. Este espectro foi semelhante ao obtido quando um DNA sintético de alça-tronco, o efeito ideal do ADAAD, foi incubado com a proteína e ATP (Figura 2A,B). O DNA triplex pode dar um espectro semelhante37, levando à hipótese de que a proteína poderia estar induzindo tal estrutura neste caso. A ATP forma um complexo de coordenação com Mg+2, e este cáation é essencial para a hidrólise ATP. A adição de EDTA chelates Mg+2, levando à inibição da hidrolise ATP38. Portanto, edta foi adicionado ao mix de reação para entender se a hidrólise ATP pela ADAAD foi importante para a mudança conformacional. A adição de EDTA à reação revoga essa conformação. O espectro de CD agora tem um pico negativo de 210 nm e uma ampla faixa positiva com picos de 230 e 250 nm (Figura 1C).
A importância da atividade atpase também foi confirmada usando um mutante morto por ATPase da ADAAD. A mutação K241A ocorre na caixa de motivoS I conservada da GKT, e este mutante tem sido mostrado anteriormente sem a capacidade de hidrolisar ATP na presença de DNA31. A proteína mutante foi expressa com uma etiqueta GST e purificada usando cromatografia de afinidade de glutationa. A mudança conformacional induzida no DNA MYC por este mutante foi diferente da induzida pelo ADAAD do tipo selvagem. O espectro de CD do DNA MYC na presença da proteína mutante possuía um pico positivo de 210 nm e um pico negativo de 260 nm (Figura 1D).
ADAAD induz forma A de conformação no promotor DROSHA
As regiões promotoras do DROSHA, DGCR8 e DICER também foram analisadas pelo software QGRS mapper e Mfold. Tanto o QGRS quanto o MFold mostraram que as regiões promotoras possuem o potencial de formar estruturas G-quadruplex e semelhantes a troncos (Tabela 2). As estruturas Mfold dos oligonucleotídeos dianteiros e reversos são mostradas na Figura 3A,B. A atividade atpase mostrou que o DNA nativo e refrigerado ao calor se comportava da mesma forma. Portanto, a forma lenta e resfriada dessas sequências de DNA foi usada para estudos de CD. Os espectros de CD mostraram que a ADAAD induz um pico negativo de 210 nm e um pico positivo de 260 nm no promotor DROSHA (Figura 3C). Este espectro é uma característica do A-DNA6.
ADAAD induz transição B-X e formação G-quadruplex no promotor DGCR8
As estruturas Mfold da frente e os fios invertidos dos oligonucleotídeos utilizados são mostrados na Figura 4A,B. Um pico positivo de 210 nm e um amplo pico negativo de 260 nm foram observados para o par DGCR8 1 (Figura 4C). Este espectro é característico da transição B-X6. As estruturas Mfold da frente e os fios invertidos dos oligonucleotídeos utilizados são mostrados na Figura 4D,E. O espectro de CD do par DGCR8 7 mostrou um forte pico positivo em 210 e 270 nm e um pico negativo de 250 nm (Figura 4F). Este espectro é característico de estruturas paralelas de DNA G-quadruplex6.
ADAAD induz transição A-X no promotor DICER
As estruturas Mfold dos oligonucleotídeos dianteiros e invertidos são mostradas na Figura 5A,B. Um pico positivo de 210 nm e dois picos negativos-um a 230 nm e o outro a pico de 260 nm foram observados para o par DICER 1 (Figura 5C). Esses picos são característicos da transição de DNA A-X6,9. Todos os picos de espectro de CD e as formas de DNA com papéis específicos no processo de transcrição foram resumidos na Tabela 3.
Figura 1: ADAAD altera a conformação do DNA GECE. Foram previstas estruturas de mfold para o (A) fio dianteiro e (B) reverso. (C) Espectros de CD somente de GECE (preto), GECE incubado com ATP e ADAAD antes (vermelho) e depois de adicionar EDTA (azul). (D) espectros de CD do GECE incubados com ATP e ADAAD marcados por GST antes (preto) e depois de adicionar EDTA (vermelho), bem como espectros de CD do GECE incubados com ATP e mutante K241A marcado por GST (azul). Este número foi modificado de 29. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; CD = dichroísmo circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ADAAD altera a conformação da estrutura de slDNA. (A) Mfold prevista para o DNA do laço-tronco. (B) Espectro de CD somente do slDNA (preto), slDNA incubado com ATP e ADAAD (vermelho). Este número foi modificado a partir de 29. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; slDNA = DNA de alça-tronco; CD = dichroísmo circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ADAAD altera a conformação do DNA do par DROSHA 5. Estrutura Mfold prevista para o (A) fio dianteiro e (B) fio reverso. (C) Espectros de CD do par DROSHA 5 DNA sozinho (preto), drosha par 5 DNA incubado com ATP e ADAAD (vermelho). Este número foi modificado a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; CD = dichroísmo circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ADAAD altera a conformação do DGCR8 par 1 e 7 DNA. Estruturas mfold previstas para o (A) fio dianteiro e (B) fio reverso do par DGCR8 1 oligonucleotídeo. (C) Espectros de CD do par DGCR8 1 sozinho (preto), par DGCR8 1 incubado com ATP e ADAAD (vermelho). Estruturas mfold previstas para o (D) fio dianteiro e (E) fio reverso do par DGCR8 7 oligonucleotídeo. (F) Espectros de CD do par DGCR8 7 sozinho (preto), par DGCR8 7 incubado com ATP e ADAAD (vermelho). Este número foi modificado a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; CD = dichroísmo circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ADAAD altera a conformação do DNA do par DICER 1. Estrutura de mfold prevista para o (A) fio dianteiro e (B) fio reverso do par DICER 1 oligonucleotídeo. (C) Espectro de CD do par DICER 1 sozinho (preto), par DICER 1 incubado com ATP e ADAAD (vermelho). Este número foi modificado a partir de 28. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; CD = dichroísmo circular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão 5x REG | |
| Componente | Concentração de trabalho |
| Lactato desidrogenase (LDH) | 50 unidades/mL |
| Acetato de magnésio (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Fosphoenolpyruvate (PEP) | 6,8 mg/mL |
| Acetato de pottasium (KOAc) | 300 mM |
| Quinase piruvato (PK) | 50 unidades/mL |
| Tris acetato (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-mercaptoetanol (β-ME) | 25 mM |
Tabela 1: Componentes tampão.
| Oligonucleotídeos | Sequência para a frente | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | Pontuação G (mapeador QGRS) | Sequência inversa | ΔG kcal/mol (previsão de Mfold) | Pontuação G (mapeador QGRS) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| Par DROSHA 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| Par DGCR8 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| Par DGCR8 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGGGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| PAR DICER 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabela 2: Sequências de oligonucleotídeos. Todas as sequências estão na direção de 5'-3'. Abreviaturas: slDNA = DNA de alça-tronco.
| Oligonucleotídeos | CD Spectra Peaks em nm (Depois de incubar com ATP e ADAAD) | Forma de DNA | Papel na Transcrição |
| slDNA | +215, +250, +272 | Triplex | Repressão |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Triplex | Repressão |
| Par DROSHA 5 | -210, +260 | A-DNA | Iniciação/Ativação |
| Par DGCR8 1 | +210,-260 | Transição B-X | Supercoilação/Ativação positiva |
| Par DGCR8 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Ativação |
| PAR DICER 1 | +210, -230, -257 | Transição A-X | Supercoilação/Ativação positiva |
Tabela 3: Pico de espectro de CD correspondente a diferentes formas de DNA com seu papel na transcrição. Abreviaturas: ADAAD = Domínio ATPase A dependente de DNA ativo; CD = dichroísmo circular.
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Discussion
O objetivo deste artigo é introduzir a técnica de espectroscopia de CD como abordagem para estudar as alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas remodeladoras de cromatina dependentes de ATP e vincular essas alterações conformais à expressão genética. A espectroscopia de CD fornece um método rápido e facilmente acessível para estudar as alterações conformais no DNA.
Um ponto crucial a ser considerado para esta técnica é a pureza do DNA e da proteína. É aconselhável garantir que tanto o DNA quanto a proteína sejam >95% puros. Oligonucleotídeos purificados por PAGE devem ser usados no ensaio, e a proteína deve ser preferencialmente purificada de afinidade para > 95% de pureza. O outro parâmetro crítico é que o cuvette deve ser limpo de tal forma que a leitura da linha de base não exceda 1 mdeg. Os buffers devem ser feitos com água autoclavada, e a leitura da linha de base do buffer não deve exceder 1 mdeg. Para estudar a conformação do promotor, é essencial identificar as regiões onde a proteína se liga. Portanto, é aconselhável realizar experimentos de ChIP usando a proteína de interesse, pois esse processo ajuda a identificar sequências de DNA presentes na região promotora do gene efeitor ligado pela proteína. Uma vez identificada a região, a capacidade da sequência de adotar estruturas específicas pode ser analisada utilizando ferramentas de bioinformática disponíveis. Isso é importante, pois os primers ChIP geralmente têm 200 bp de comprimento e podem ter múltiplas conformações. Portanto, o uso de ferramentas bioinformáticas para identificar as estruturas ajudaria a encurtar o comprimento do oligonucleotídeo para uma estrutura.
Finalmente, se a proteína de interesse é uma proteína de remodelação de cromatina dependente de ATP, a capacidade dos oligonucleotídeos de agir como efeito deve ser verificada usando ensaios ATPase. Tanto nos ensaios de espectroscopia de CD quanto em ATPase, deve-se tomar cuidado para garantir que as concentrações saturadas de ligantes sejam usadas na reação. Se possível, a constante de dissociação (Kd) para a interação proteína-ligante deve ser calculada antes de prosseguir com a espectroscopia de CD. Existem inúmeros métodos para calcular o parâmetro de vinculação. Usando ensaios ATPase, a constante michaelis-menten (KM) pode ser calculada titulando concentrações crescentes de DNA. O KM, em muitos casos, pode ser aproximado à constante de ligação. Se a proteína for fluorescente, as constantes de ligação podem ser calculadas usando espectroscopia de fluorescência. Se nenhuma dessas técnicas for viável, o ensaio de mudança de mobilidade eletroforese (EMSA) pode ser usado.
O principal problema com a espectroscopia do CD surge quando as cuvetas não são limpas ou quando os reagentes são impuros. Se a linha de base é muito alta, é aconselhável limpar as cuvetas. Inúmeras soluções de limpeza cuvette estão disponíveis. Colocar as cuvetas em uma solução de ácido diluído por 16-24 h também ajuda a limpar a cuvette. É aconselhável comprar reagentes >95% puros e usar água duplamente destilada e autoclavada. A deriva da linha de base é outro problema em potencial. Se fizer um experimento de longo prazo, é aconselhável verificar periodicamente a linha de base. Os picos de DNA ao estudar interações proteína-DNA podem não corresponder exatamente aos picos/bandas obtidos apenas com DNA. Picos proteicos são geralmente observados na faixa far UV entre 190 e 230 nm. Portanto, picos abaixo de 250 nm podem ter interferência do pico da proteína e podem não fornecer informações confiáveis. O DNA pode adotar uma variedade de conformações não-B dependendo da sequência. Quanto maior a sequência de DNA, maior a chance de múltiplas conformações coexistindo dentro do oligonucleotídeo de DNA. Isso pode dificultar a análise. Assim, é aconselhável utilizar oligonucleotídeos mais curtos correspondentes às estruturas potenciais previstas pelas ferramentas bioinformáticas.
A outra grande desvantagem da espectroscopia do CD é que ela não permite a análise da estrutura de nível atômico, e o espectro obtido é insuficiente para identificar a única estrutura viável. Por exemplo, tanto a cristalografia de raios-X quanto a espectroscopia de NMR proteica fornecem dados de resolução atômica, enquanto a espectroscopia do CD fornece informações estruturais menos detalhadas. No entanto, a espectroscopia de CD é uma abordagem rápida que não requer grandes quantidades de proteínas ou processamento considerável de dados. Como resultado, o CD pode ser usado para investigar uma ampla gama de variáveis de solventes, como temperatura, pH, salinidade, e a presença de vários cofatores. Também pode ser usado para monitorar alterações estruturais (devido à formação complexa, dobra/desdobramento, desnaturação devido à temperatura, desnatantes e alterações na sequência/mutação de aminoácidos) em sistemas dinâmicos. Ao conectá-lo ao aparelho de stop-flow, ele também pode ser usado para estudar a cinética das interações proteína/DNA-ligand.
Conformadores de DNA bem caracterizados incluem DNA A/B/Z, triplex, grampo de cabelo e G-quadruplexes. Todas essas formas de DNA estão associadas a uma conformação de DNA aberto, ou seja, DNA desenrolado que serve como a pia para supercoilação negativa. A transcrição está associada à supervagação negativa, pois a formação de um complexo aberto é um pré-requisito para o movimento da polimerase rna. Portanto, a transcrição da maioria dos genes envolve aumento da supercoilação negativa na região promotora. Estudos têm mostrado que o desdobramento nucleossomo leva à conformação de DNA A, que, no entanto, é instável39. Uma possibilidade é que a proteína de interesse, por exemplo, SMARCAL1, se ligue a tais estruturas e as estabilize, facilitando assim a transcrição, como visto no caso dos promotores do DROSHA . O quadruplox de guanina é baseado em tetrads de guanina ligados por ligações de hidrogênio Hoogsteen. Na análise do silico confirmou que as sequências de formação de G4 são notavelmente enriquecidas proximal para promotores genéticos e em locais de início de transcrição. Essas sequências G4 podem ativar e reprimir a transcrição.
No caso do promotor do MYC40, a formação do G-quadruplex atua como um repressor, enquanto no caso do fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), a estrutura G-quadruplex funciona como um local de acoplamento para fatores de transcrição41, ativando assim a expressão deste gene. No caso do SMARCAL1, a estrutura G-quadruplex foi observada quando a ADAAD interagiu com as sequências de promotores do par DGCR8 7. Como a ocupação de SMARCAL1 e RNAPII aumentou neste par de primer, acredita-se que a formação de G-quadruplex, neste caso, se correlaciona com a ativação da transcrição deste gene. O DNA também pode ser positivamente superfísico, e o progresso da polimerase RNA é conhecido por gerar supercoilações positivas na frente dele. Essa supercoilação gerada por transcrição (+) pode interromper ou eliminar proteínas de bloqueio de estrada, desestabilizando estruturas nucleossômicas para tornar o DNA mais acessível à polimerase de RNA. O X-DNA é uma conformação do DNA que age como pias para supercoilações positivas. A característica marcante de um X-DNA é que ele pode se formar de uma forma específica de sequência sobre o promotor de um gene. No caso do SMARCAL1, a ADAAD induziu transições A-X e B-X de forma dependentes de ATP nos promotores DICER e DGCR8, respectivamente. Combinado com dados in vivo onde o aumento da ocupação do SMARCAL1 e do RNAPII foi encontrado nesses promotores na presença de danos de DNA induzidos por doxorubicina, pode-se supor que a formação de X-DNA facilita a transcrição removendo barreiras/blocos. As helices de DNA triplo não têm um espectro característico. Os espectros de CD das sequências de DNA presentes no promotor do MYC e no DNA sintético de alça-tronco mostraram dois picos positivos-um a 258 nm com um ombro a 269 nm e um pico maior de 210 nm no DNA. Esse tipo de espectro pode ser obtido no caso do triplexes37. Os tríplex são difíceis de desenrolar e, portanto, são conhecidos por bloquear a transcrição42. Assim, acredita-se que a formação dessa estrutura no promotor c-MYC pelo SMARCAL1 leve à repressão da transcrição.
Deve-se notar que a ATP também se liga às proteínas de remodelação de cromatina dependentes da ATP. A arginina conservada presente no motivo VI do domínio helicase dessas proteínas interage através de interações eletrostáticas com o γ-fosfato da proteína43. No caso da ADAAD, o Kd da interação proteína-ATP é (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. A ligação de ATP induz uma mudança conformacional na proteína de tal forma que a afinidade do DNA aumenta. A ligação do DNA também induz uma mudança de conformação na proteína levando a um aumento de 10 vezes a afinidade com o ATP31. Por exemplo, no caso do ADAAD, bandas/picos são observados em -212 nm e -222 nm. ATP também dá bandas em 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm e -270 nm. Estes devem ser subtraídos dos espectros de DNA + ADAAD + ATP para obter a conformação "líquida" do DNA na presença dos ligantes.
Assim, este artigo mostra a conveniência da espectroscopia de CD para o estudo das alterações conformais ocorridas no DNA na presença de proteínas de remodelação de cromatina dependentes de ATP. Correlacionar as alterações na conformação do DNA com os dados do ChIP pode fornecer aos investigadores informações sobre como os conformadores de DNA ativam/reprimem transcrição.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para declarar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pelo espectrômetro do CD. V.J. e A.D. foram apoiados por uma bolsa da CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
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