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Biology

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/63155
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,4, 5, 1, 1,3, 1,3,4
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Summary

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Abstract

Verschiedene Bakterienarten sezernieren ~20-300 nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykanen und anderen Molekülen bestehen, die von den Elternzellen stammen. EVs fungieren als intra- und interspezielle Kommunikationsvektoren und tragen gleichzeitig zur Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsorganismen im Kontext von Infektion und Besiedlung bei. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die EVs in Gesundheit und Krankheit zugeschrieben werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, EVs für In-vitro- und In-vivo-Studien zu isolieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Trennung von EVs basierend auf physikalischen Eigenschaften, nämlich der Größe, die Isolierung von Vesikeln aus verschiedenen Bakterienkulturen erleichtern würde.

Der Isolationsworkflow besteht aus Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Isolierung von EVs aus Bakterienkulturen. Ein pumpengetriebener Tangential-Flow-Filtrationsschritt (TFF) wurde integriert, um die Skalierbarkeit zu verbessern und die Isolierung von Material aus Litern Ausgangszellkultur zu ermöglichen. Escherichia coli wurde als Modellsystem verwendet, das EV-assoziierte Nanoluciferase und nicht-EV-assoziierte mCherry als Reporterproteine exprimiert. Die Nanoluciferase wurde gezielt auf die EVs gerichtet, indem ihr N-Terminus mit Cytolysin A fusioniert wurde. Frühe Chromatographiefraktionen, die 20-100 nm EVs mit assoziiertem Cytolysin A - nanoLuc enthielten, unterschieden sich von den späteren Fraktionen, die die freien Proteine enthielten. Das Vorhandensein von EV-assoziierter Nanoluciferase wurde durch Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser EV-Isolations-Workflow ist auf andere gramnegative und grampositive Bakterienarten anwendbar, die mit dem menschlichen Darm assoziiert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration/TFF und SEC eine skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten ermöglicht. Die Verwendung eines standardisierten Isolationsworkflows wird vergleichende Studien mikrobieller Elektrofahrzeuge über Spezies hinweg erleichtern.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanometergroße, liposomenähnliche Strukturen, die aus Lipiden, Proteinen, Glykanen und Nukleinsäuren bestehen und sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen abgesondert werden1. Seit den frühen Studien, die die Freisetzung von EVs aus gramnegativen Bakterien visualisierten2, hat die Anzahl der biologischen Funktionen, die bakteriellen EVs (20-300 nm Durchmesser) zugeschrieben werden, in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen. Zu ihren Funktionen gehören die Übertragung von Antibiotikaresistenz3, Biofilmbildung4, Quorum Sensing5 und Toxinabgabe6. Es besteht auch ein wachsendes Interesse an der Verwendung bakterieller EVs als Therapeutika, insbesondere in der Vakzinologie7 und Krebstherapie8.

Trotz des wachsenden Interesses an der EV-Forschung gibt es immer noch technische Herausforderungen in Bezug auf Methoden der Isolierung. Insbesondere besteht ein Bedarf an Isolationsmethoden, die reproduzierbar, skalierbar und kompatibel mit verschiedenen EV-produzierenden Organismen sind. Um einen einheitlichen Satz von Prinzipien für die Planung und Berichterstattung von EV-Isolierung und Forschungsmethoden zu schaffen, veröffentlicht und aktualisiert die International Society for Extracellular Vesicles das MISEV-Positionspapier9. Darüber hinaus bietet das EV-TRACK-Konsortium eine offene Plattform für die Berichterstattung über detaillierte Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in veröffentlichten Manuskripten verwendet werden, um die Transparenz zu erhöhen10.

In diesem Protokoll wurden frühere Methoden zur Isolierung von EVs aus Säugetierzellkulturen angepasst11,12, um die Isolierung von EVs aus bakteriellen Zellkulturen zu ermöglichen. Wir haben versucht, Methoden einzusetzen, die eine EV-Isolierung von einer Vielzahl von Mikroben ermöglichen, die skalierbar sein können, und EV-Reinheit und -Ausbeute ausgleichen (wie im MISEV-Positionspapier9 diskutiert). Nach dem Entfernen von Bakterienzellen und Trümmern durch Zentrifugation und Filtration wird das Kulturmedium entweder durch Zentrifugalgeräte-Ultrafiltration (für ein Volumen von bis zu ~100 ml) oder pumpengetriebene TFF (für größere Volumina) konzentriert. Elektrofahrzeuge werden dann durch SEC mit Säulen isoliert, die für die Reinigung kleiner Elektrofahrzeuge optimiert sind.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über den Workflow für die bakterielle EV-Isolierung. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TFF = tangentiale Strömungsfiltration; SEC = Größenausschlusschromatographie; MWCO = Molekulargewichtsgrenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ein Mauskommensalstamm von Escherichia coli (d.h. E. coli MP113) wurde als Modellorganismus verwendet und modifiziert, um EV-assoziierte Nanoluciferase durch Fusion zu Cytolysin A zu exprimieren, wie bereits berichtet14. Die hier verwendeten Methoden können mindestens bis zu mehreren Litern Bakterienkulturen verarbeiten und EV-assoziierte von nicht-EV-assoziierten Proteinen effektiv trennen. Schließlich kann diese Methode auch für andere grampositive und gramnegative Bakterienarten angewendet werden. Alle relevanten Daten der gemeldeten Experimente wurden an die EV-TRACK Knowledgebase (EV-TRACK ID: EV210211)10 übermittelt.

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Protocol

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Arbeiten mit Bakterien und rekombinanter DNA den besten Praktiken für die biologische Sicherheitseindämmung entsprechen, die der biologischen Sicherheitsrisikostufe jedes Stammes entsprechen. Die Arbeit sollte in Übereinstimmung mit lokalen, nationalen und internationalen Biosicherheitsvorschriften erfolgen.

1. Bakterienstämme und Kulturbedingungen

HINWEIS: In dieser Studie verwendete Bakterienstämme waren Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium dentium.

  1. Verwenden Sie für E. coli eine sterile Schlaufe, um einzelne Kolonien in 250 bis 1.000 ml Luria-Bertani (LB) -Brühe zu impfen und aerob in einem Schüttelinkubator bei 300 U/min und 37 ° C für 48 Stunden zu inkubieren, bevor die Kultur verarbeitet wird. Für rekombinante E. coli MP1-Stämme mit p114-mCherry-Clyluc (Supplemental Method und Supplemental Figure S1) fügen Sie dem LB-Agar und der Brühe Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 17 μg/ml hinzu.
  2. Für A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve und B . dentium streifen Sie auf Brain heart infusion (BHI) Agarplatten und inkubieren anaerob in einer anaeroben Vinylkammer. Impfen Sie einzelne Kolonien in 100 ml vorreduzierte BHI-Brühe und inkubieren Sie für 48 h anaeroben.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen

  1. Klärung von Bakterienkulturmedium durch Zentrifugation und Filtration
    1. Die in Schritt 1 inokulierten Bakterienzellkulturen werden durch Gießen in 250 mL oder 500 mL Polypropylen-Zentrifugenflaschen gereinigt. Zentrifugieren Sie die Flaschen in einem großflächigen Rotor mit festem Winkel bei 4 °C und 5.000 × g für 15 min. Den Überstand durch vorsichtiges Eingießen in saubere Zentrifugenflaschen überführen und bei 10.000 × g erneut für 15 min zentrifugieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Flaschen nach biosicherheitsgerechter Reinigung und Dekontamination wieder.
      1. Wenn nach der zweiten Zentrifugation große Pellets von Bakterienzellen vorhanden sind, wiederholen Sie die Zentrifugation in einer sauberen Flasche, um die Zellen weiter zu entfernen.
    2. Der Überstand wird durch Gießen in eine 0,22 μm Polyethersulfon-Vakuumfiltervorrichtung geeigneter Größe überführt. Filtern Sie, indem Sie das Filtergerät an eine Vakuumwandversorgung anschließen. Wenn die Filtrationsrate deutlich sinkt, bewegen Sie einfach das ungefilterte Material in ein neues Gerät. Lagern Sie das gefilterte Medium über Nacht bei 4 °C und setzen Sie das Protokoll auf Wunsch am nächsten Tag fort.
      HINWEIS: Die oben genannten Zentrifugationen ermöglichen typischerweise die Verarbeitung von ~ 2x des angegebenen Volumens der Zellkultur durch jedes Gerät. Zum Beispiel könnte eine einzelne 500-ml-Filtervorrichtung ~ 1.000 ml vorzentrifugierte Kultur filtern. Diese Geräte werden normalerweise nicht wiederverwendet. Die Verwendung von Spritzenfiltern in diesem Schritt wird nicht ohne Optimierung empfohlen, da bei den getesteten Modellen erhebliche Verluste festgestellt wurden. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
    3. Überprüfen Sie die vollständige Entfernung der lebensfähigen Zellen an dieser Stelle, indem Sie ein Aliquot des gefilterten Überstands auf geeignete Agarplatten verteilen und sicherstellen, dass nach der Inkubation unter optimalen Bedingungen für den Bakterienstamm keine Kolonien vorhanden sind. Wenn Bakterien nachgewiesen werden, optimieren Sie das oben beschriebene Verfahren weiter, indem Sie zusätzliche Zentrifugationen und/oder Filtrationen durchführen.
  2. Konzentration des gefilterten Mediums
    1. Wenn Sie mit Volumina von deutlich >100 ml arbeiten, fahren Sie mit Schritt 2.2.2 fort. Wenn Sie mit Volumina von ~ 100 ml arbeiten, laden Sie 90 mL gefiltertes Kulturmedium auf das Reservoir mit einer entsprechenden Kapazität von 100 kDa Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) zentrifugaler Ultrafiltrationsvorrichtung unter Verwendung serologischer Pipetten. Immer mit einem passenden Ultrafiltrationsgerät balancieren und im schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C und 2.000 × g für 15-30 min Intervalle zentrifugieren, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir auf <0,5 ml konzentriert ist.
      1. Füllen Sie das Reservoir mit dem verbleibenden gefilterten Kulturmedium auf. Wenn Sie "aufladen", entfernen Sie den Durchfluss in der Unterseite des Geräts und balancieren Sie alle Geräte neu aus.
        HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass das maximale Volumen des gefilterten Kulturmediums, das mit diesen Geräten konzentriert werden kann, <2-fache des empfohlenen Volumens beträgt.
      2. Wenn die Viskosität des konzentrierten Mediums im Reservoir sichtbar erhöht ist (dunkles, viskoses Material), mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen und durch Zentrifugieren erneut konzentrieren, um alle Nicht-EV-Proteine zu verdünnen, die kleiner als der MWCO von 100 kDa sind.
        HINWEIS: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
      3. Das konzentrierte Medium wird in ein proteinarmes Röhrchen überführt, über Nacht bei 4 °C gelagert und das Protokoll auf Wunsch am nächsten Tag fortgesetzt.
    2. Wenn Sie mit Volumina von deutlich >100 ml arbeiten, wählen Sie ein TFF-Gerät mit geeigneter Größe (100 kDa MWCO), um das zu verarbeitende Volumen aufzunehmen.
      HINWEIS: Filtrationsgeräte für die Verarbeitung von 100 mL bis >1.000 mL sind kommerziell erhältlich. Die lokale Verfügbarkeit, die Kosten und die Kompatibilität mit der Pumpe und den Schläuchen/Anschlüssen bestimmen, welche Modelle am nützlichsten sind. Bis zu 2 l Kulturmedium wurden mit dem in der Materialtabelle angegebenen Gerät verarbeitet, bevor der Filter gereinigt werden musste (siehe Schritt 2.3 unten für das Reinigungsprotokoll).
      1. Montieren Sie einen Filterkreislauf mit #16 Low-Binding/Low-Lauging-Schläuchen, 1/8-Zoll-Schlauch-Barb-zu-Luer-Adaptern, dem TFF-Gerät und einer Schlauchpumpe, wie in der ergänzenden Abbildung S2 angegeben.
        HINWEIS: Führen Sie TFF in einer Biosicherheitswerkbank durch, um das Risiko einer Kontamination des EV-Präparats mit Umweltbakterien zu minimieren.
      2. Beginnen Sie bei Raumtemperatur mit der Umwälzung des gefilterten, konditionierten Mediums bei etwa 200 ml/min (mindestens 100 ml/min). Bestimmen Sie die geeignete Drehzahl, die der gewünschten Durchflussrate entspricht, indem Sie 200 ml PBS in einen Messbehälter pumpen. Beim Umlauf von gefiltertem, konditioniertem Medium werden die Moleküle <100 kDa, die die Ultrafiltrationsmembran passieren, als Abfall in einem separaten Gefäß gesammelt.
        HINWEIS: Das folgende Beispiel geht von einem Startvolumen von 2 L Kultur aus.
      3. Fahren Sie fort, das konditionierte Medium zu zirkulieren, bis sein Volumen auf ~ 100-200 ml reduziert wurde. Wechseln Sie bei Bedarf zu kleineren Schiffen. Verdünnen Sie das 2-fache mit PBS und zirkulieren Sie weiter mit der Pumpe, wobei Sie sich auf 75-100 ml konzentrieren. 2-fach mit PBS verdünnen und weiter auf ein Endvolumen von 25 ml zirkulieren. 2-fach mit PBS verdünnen und weiter zirkulieren bis <10 ml.
      4. Heben Sie den Zufuhrschlauch aus dem Probenbehälter und pumpen Sie weiter, um den Filter zu reinigen und die maximale Probenmenge zu gewinnen.
        HINWEIS: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
      5. Die konzentrierte Probe wird in ein konisches Röhrchen überführt und auf Wunsch über Nacht bei 4 °C gelagert. Alternativ können Sie mit dem Protokoll fortfahren.
      6. Bewegen Sie die konzentrierte Probe in eine 15 ml Kapazität 100 kDa MWCO zentrifugale Ultrafiltrationsvorrichtung. Zentrifugieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C und 2.000 × g für 15-30 min Intervalle, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir auf <2 ml konzentriert ist.
        HINWEIS: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
      7. Das konzentrierte Medium wird in ein Röhrchen mit niedriger Proteinbindung überführt und über Nacht bei 4 °C gelagert, wobei das Protokoll auf Wunsch am nächsten Tag fortgesetzt wird.
  3. Reinigen des TFF-Geräts (optional)
    HINWEIS: Die Filtrationsrate nimmt ab, wenn das TFF-Gerät während des Prozesses zu "verstopfen" beginnt (Fouling). Bei Bedarf kann die Filtervorrichtung gereinigt werden, um die Filtration weiterer Proben im selben Reinigungslauf zu erleichtern. Obwohl theoretisch möglich, wurde ein gereinigter TFF-Filter nicht für einen anderen Reinigungslauf verwendet, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    1. Entfernen Sie zum Reinigen alle Schläuche und Kappen vom TFF-Gerät und lassen Sie die restliche Flüssigkeit ab.
    2. Verwenden Sie die Schlauchpumpe und den Schlauch, um sowohl die inneren als auch die äußeren Abteilungen des TFF-Geräts (d. h. über die parallelen und senkrechten Anschlüsse im in der Materialtabelle aufgeführten Modell) mit ~ 100 ml destilliertem Wasser zu fluten. Entfernen Sie alle Schläuche/Kappen und entleeren Sie das TFF-Gerät.
    3. Verschließen Sie die äußeren (senkrechten, filtratartigen) Anschlüsse und zirkulieren Sie 250 ml 20% Ethanol in destilliertem Wasser bei >200 ml/min für 10 min durch das innere Fach. Abtropfen lassen, mit destilliertem Wasser überfluten und wieder wie oben abtropfen lassen.
    4. 250 mL 0,5 N frische NaOH-Lösung für 30 min durch das Innenfach zirkulieren lassen und erneut abtropfen lassen.
    5. Schließen Sie alle Schläuche und Kappen wieder an die Einlass-, Auslass- und Filtratanschlüsse an, wie in der ergänzenden Abbildung S2 gezeigt, und zirkulieren Sie 0,5 N NaOH-Lösung erneut, bis ein Volumen NaOH > 1 ml/cm2 Filteroberfläche durch die Filtermembran dringt und als Filtrat/Abfall gesammelt wird.
    6. Spülen Sie das TFF-Gerät wie oben beschrieben mit destilliertem Wasser ab. Verwenden Sie das TFF-Gerät sofort oder fluten Sie das Gerät mit ~100 mL 20% Ethanol und lagern Sie es über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie in Ethanol gelagert werden, achten Sie darauf, 250 ml PBS durch das Gerät zu entleeren, mit Wasser abzuspülen, abzulassen und durch das Gerät zu zirkulieren, bis ein Volumen von >1 ml / cm2 Filteroberfläche durch die Filtermembran dringt und als Filtrat / Abfall gesammelt wird, um Restethanol vor der Probenverarbeitung zu entfernen.
  4. Größenausschlusschromatographie (SEC)
    HINWEIS: SEC wird verwendet, um die Reinheit von EVs zu erhöhen und nicht-vesikuläres Protein zu entfernen.
    1. Verwenden Sie eine kleine SEC-Säule (10 ml Bettvolumen) für die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus <100 ml Ausgangsmaterial und eine größere Säule (47 ml Bettvolumen) für die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus >100 ml Ausgangsmaterial.
      HINWEIS: Im folgenden Beispiel werden Bände für die größere Spalte aufgelistet, mit Volumen für die kleinere Spalte in Klammern.
    2. Bringen Sie die SEC-Säule und PBS über mehrere Stunden auf Raumtemperatur. Stabilisieren Sie die SEC-Säule in vertikaler Position mit einem Standard-Laborständer und -halter. Alternativ können Sie handelsübliche Chromatographie-Säulenständer verwenden.
    3. Vor dem Anschluss an die SEC-Säule hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie 5 ml PBS durch die Fritte und in einen Abfallbehälter fließen lassen. Schrauben Sie die Einlasskappe der SEC-Säule ab, geben Sie 2 ml PBS in das Probenreservoir und verbinden Sie das Reservoir vorsichtig mit der Säule, da das PBS durch die Fritte tropft (gilt nicht für kleine SEC-Säulen).
      HINWEIS: Dieser vorherige Schritt verhindert, dass Luftblasen oben in der SEC-Spalte eingeschlossen werden. Wenn Luft eingeschlossen ist, entfernen Sie den Behälter, tippen Sie auf die Säule, um die Luftblase herauszubekommen, und wiederholen Sie den Verbindungsvorgang. Für die kleinere Säule öffnen Sie einfach die Oberseite der SEC-Säule und bringen Sie den Probentrichter an.
    4. Geben Sie 47 ml (10 ml) PBS in das Probenreservoir und öffnen Sie den Boden der SEC-Spalte. Lassen Sie den gesamten geladenen Probenpuffer zur Äquilibrierung durch die Spalte fließen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    5. Laden Sie maximal 2 ml (0,5 ml) der Probe in das Probenreservoir, verwerfen Sie den Durchfluss und lassen Sie die Probe vollständig in die Säule gelangen.
    6. Geben Sie sofort PBS in das Probenreservoir oder den Trichter mit einem Volumen von 14,25 ml minus dem Probenvolumen (3 ml minus Probenvolumen für die kleine Säule). Lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen und verwerfen Sie diesen Betrag, der dem Spaltenleervolumen entspricht.
      HINWEIS: Für eine typische 2-ml-Probe beträgt die Menge an PBS, die dem Probenbehälter oder Trichter hinzugefügt werden soll, 12,25 ml.
    7. Positionieren Sie ein 2 mL Low-Binding Mikroröhrchen direkt unter der SEC-Säule. Geben Sie sofort 2 ml (0,5 ml) PBS in das Probenreservoir und lassen Sie es in die Säule gelangen. Kennzeichnen Sie diese ersten 2 ml (0,5 ml) Durchfluss als Fraktion 1. Geben Sie weiterhin 2 ml (0,5 ml) gleichzeitig in das Probenreservoir, um jede nachfolgende Fraktion zu sammeln.
      HINWEIS: Die meisten bakteriellen EVs eluieren in den ersten 5 Fraktionen. Bei der Optimierung wurden die ersten 12 Fraktionen gesammelt.
    8. Lagern Sie die Fraktionen bei 4 °C für die Kurzzeitlagerung (Tage) bzw. -80 °C für die Langzeitlagerung.
    9. Reinigung und Lagerung der wiederverwendbaren SEC-Säulen
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll beschriebenen SEC-Spalten können je nach Hersteller bis zu 5 Mal wiederverwendet werden. Wenn die Durchflussrate der SEC-Säulen nach <5 Anwendungen abnimmt, empfiehlt der Hersteller, die konzentrierten Proben bei 10.000 x g für 10 min zu zentrifugieren, um alle Aggregate vor SEC zu entfernen. Laden Sie dann den Überstand dieser Zentrifugation auf die SEC-Säule zur EV-Isolierung.
      1. Um die SEC-Säule nach jedem Gebrauch zu reinigen und zu lagern, fügen Sie 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH hinzu und lassen Sie sie vollständig in die Säule gelangen. Lassen Sie 100 ml (20 ml) 20% Ethanol durch die Säule laufen und lagern Sie es bei 4 °C bis zur nächsten Verwendung. Vor der nächsten Verwendung das Ethanol wie oben auf Raumtemperatur ausgleichen und mit PBS-Puffer austauschen, indem Sie weitere 150 ml (30 ml) PBS durch die Säule laufen lassen.
      2. Um die SEC-Säule nach jedem Gebrauch zu reinigen und sofort wiederzuverwenden, fügen Sie 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH hinzu und lassen Sie sie vollständig in die Säule eindringen. Lassen Sie ungefähr 150 ml (30 ml) PBS-Puffer laufen, um NaOH wegzuspülen. Wenn der pH-Wert von Eluat gleich PBS (~ 7) ist, kann eine neue Probe geladen werden.

3. Qualitätskontrolle der EV-Vorbereitung

  1. Sterilitätsprüfung
    HINWEIS: Da diese EVs aus Bakterienkulturen stammen, ist es wichtig, die Sterilität vor der nachgeschalteten Verwendung sicherzustellen.
    1. Erhalten Sie 100 μL (20 μL) der Fraktionen, die in Assays verwendet werden sollen, und inokulieren Sie 3 ml des Mediums, das zum Züchten der Quellbakterien verwendet wird. Kultur unter den jeweils optimalen Bedingungen für mindestens 3 Tage und auf Trübung beobachten. Alternativ können Sie die Fraktionsproben auf Agarplatten auftragen, die das Medium enthalten, mit dem die produzierenden Bakterien gezüchtet werden, und nach Koloniebildung suchen.
      HINWEIS: Wenn eine bakterielle Kontamination festgestellt wird, wird nicht empfohlen, das EV-Präparat für Experimente zu verwenden. Wiederholen Sie stattdessen die Isolierung und achten Sie darauf, das Risiko einer bakteriellen Kontamination zu minimieren, indem Sie (a) eine ausreichende Zentrifugation / Filtration des konditionierten bakteriellen Zellkulturmediums durchführen, (b) saubere Flaschen, Schläuche, Filter und Chromatographiesäulen verwenden und (c) geeignete aseptische Techniken anwenden.
  2. Protein-Quantifizierung
    HINWEIS: Es wurde ein hochempfindliches, fluoreszenzbasiertes Proteinquantifizierungskit verwendet (siehe Materialtabelle). Das Kit arbeitet mit einem passenden proprietären Fluorimeter bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 485/590 nm.
    1. Bringen Sie alle Reagenzien, Standards und Proben auf Raumtemperatur.
    2. Es wird eine Mastermischung aus Proteinreagenz und Puffer hergestellt, indem 1 μL des Reagenzes zu 199 μL Puffer für jede zu untersuchende Probe und jeden zu untersuchenden Standard hinzugefügt wird. Fügen Sie mit dünnwandigen 0,5-ml-PCR-Röhrchen 10 μL Standard + 190 μL Master-Mix zu jedem Standardröhrchen hinzu.
      ANMERKUNG: Um innerhalb des Bereichs des Assays zu liegen, hängt die Menge jeder Fraktion, die jedem Probenröhrchen zugesetzt werden soll, von der erwarteten Proteinausbeute der Reinigung ab. Typischerweise wurden 5 μL jeder Fraktion + 195 μL Mastermix verwendet. Das Endvolumen der Probe + Mastermischung muss 200 μL betragen.
    3. Wirbeln Sie die Assay-Röhrchen ab und inkubieren Sie sie mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    4. Messen Sie die Standards auf dem entsprechenden proprietären Fluorimeter (siehe Materialtabelle), indem Sie die Option Proteinassay mit den Pfeiltasten auswählen und zur Bestätigung die GO-Taste drücken. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, führen Sie jedes Standardrohr ein und drücken Sie GO.
    5. Setzen Sie das experimentelle Probenröhrchen ein; Drücken Sie GO , um zu lesen; und notieren Sie das angezeigte Ergebnis, d. h. die tatsächliche Proteinkonzentration im Assay-Puffer/Proben-Gemisch. Um die Proteinkonzentration in der Probe zu erhalten, verwenden Sie die Pfeiltasten, um die Option Probenkonzentration berechnen auszuwählen, drücken Sie GO und verwenden Sie die Pfeiltasten, um das Probenvolumen auszuwählen, das dem Assay-Puffer für die angegebene Probe hinzugefügt wurde. Drücken Sie GO und notieren Sie die Proteinkonzentration der Probe. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede zu analysierende Probe.
  3. Partikelzählung und Größenverteilung
    HINWEIS: Mikrofluidik resistive pulse sensing (MRPS) wurde verwendet, um EV-Konzentration und Größenverteilung zu quantifizieren.
    1. Die Proben in PBS, ergänzt mit 1% Tween-20, das durch einen 0,02-μm-Spritzenfilter filtriert wurde, auf eine Proteinkonzentration von etwa 0,1 μg/ml verdünnen.
      HINWEIS: Das Ziel der Verdünnung ist es, eine erwartete Partikelkonzentration im Bereich von 1010 Partikeln / ml in EV-haltigen Fraktionen zu erreichen. Die optimale Verdünnung muss möglicherweise empirisch bestimmt werden. Für spätere Fraktionen (über Fraktion 6 hinaus) werden nur wenige EVs erwartet. Daher wird die Partikelkonzentration trotz Analyse bei niedrigen Verdünnungen wahrscheinlich <1010 Partikel/ml betragen.
    2. Legen Sie 3 μL jeder Probe mit einer Mikropipette in die Einweg-Mikrofluidikkartusche, führen Sie die Patrone in das MRPS-Instrument ein und drücken Sie den Metallknopf mit einem blau beleuchteten Rand.
    3. Klicken Sie in der Erfassungssoftware auf Go! und warten Sie, bis die Probe vom Gerät analysiert wurde. Erfassen Sie 1.000 bis 10.000 Partikelereignisse, um den technisch-statistischen Analysefehler zu minimieren. Klicken Sie an dieser Stelle auf Beenden und Testlauf beenden , um die Beispielerfassung abzuschließen.
      HINWEIS: Zusammen mit den Rohdatendateien gibt das Gerät eine zusammenfassende Tabelle aus, in der die Partikelkonzentration in der Probe aufgeführt ist. Korrigieren Sie diesen Wert entsprechend der durchgeführten Probenverdünnung.
    4. Laden Sie mithilfe von Analysesoftware die Rohdaten und generieren Sie benutzerdefinierte Diagramme der Größenverteilung.

4. EV-Speicher

  1. Einzelne oder gepoolte Fraktionen auf 25-50% der individuellen Fraktionsgröße (abhängig von der Größe der verwendeten Säule) in proteinarmen Bindungsröhrchen aliquotieren und bei -80 °C lagern, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
    HINWEIS: Verschiedene Anwendungen können kleinere oder größere Aliquots erfordern, abhängig von der erwarteten Menge, die in jedem Experiment verwendet wird. Dies muss empirisch ermittelt werden. Die nicht EV-haltigen Fraktionen können verworfen werden, wenn sie nicht für die Forschungsziele geeignet sind.

5. Transmissionselektronenmikroskopie

  1. Negative Färbung
    1. 5 μL der EV-Probe in das kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter mit 400 Maschen geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Probenseite wird mit 5 Tropfen 5 mM Tris-Puffer (pH 7,1) und anschließend mit 5 Tropfen destilliertem Wasser gewaschen.
    2. Probenseite mit 5 Tropfen 2% Uranylacetat färben. Wischen Sie zusätzliche Mengen an Flecken mit Filterpapier ab und lassen Sie das Rost mehrere Stunden oder über Nacht vollständig trocknen. Visualisieren Sie die Proben mit einem Elektronenmikroskop, das mit 80 kV betrieben wird.
  2. Immunogold-Markierung
    1. 10 μL der EV-Suspension auf ein Formvar/Carbon 400 Mesh-Gitter auftragen und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren. Waschen Sie das Gitter dreimal in PBS und tragen Sie dann 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten auf, um die Probe zu fixieren. Waschen Sie die Gitter fünfmal mit PBS.
    2. Blockieren Sie das Gitter mit drei PBS-Wäschen mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Tragen Sie dann 10 μL eines primären Antikörpers für 40 min bei Raumtemperatur auf (hier 1 μg/ml nluc-Antikörper). Dreimal mit PBS waschen, das 0,1% BSA enthält.
    3. Geben Sie 10 μL sekundären goldmarkierten Antikörper in das Gitter und inkubieren Sie für 40 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gitter dreimal mit PBS.
      HINWEIS: Hier wurde ein mit 10 nm Goldnanopartikeln konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper verwendet, nachdem er 1:10 im Blockierpuffer verdünnt wurde. Wenn die Goldmarkierung die EV-Visualisierung verdeckt, können stattdessen sekundäre Antikörper mit kleineren Goldnanopartikeln (z.B. 5 nm) verwendet werden.
    4. Das Gitter mit 10 μL 2,5% Glutaraldehyd für 10 min bei Raumtemperatur nachfixieren. Dreimal in PBS waschen. Führen Sie eine negative Färbung mit 2% Uranylacetat (10 μL) für 15 min durch. Die Proben in 10 μL 0,5% Uranylacetat und 0,13% Methylcelluloselösung für 10 min einbetten.
    5. Lassen Sie die Probengitter über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie sie auf dem Elektronenmikroskop abbilden.
    6. Bestimmen Sie in der Mikroskopaufnahmesoftware die Belichtung empirisch, um die optimale Bildqualität zu erhalten (z. B. 0,80851 s in diesem speziellen Setup), und passen Sie sie an, indem Sie diesen Wert in das Optionsfeld für die Belichtungszeit eingeben. Wählen Sie die Option 80 kV und klicken Sie auf Aufnahme starten , um das Bild aufzunehmen.

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Representative Results

Um zu beurteilen, welche SEC-Chromatographiefraktionen für EVs angereichert waren, wurde die SEC-Säule mit 2 ml E. coli MP1-konditioniertem Kulturmedium beladen, das 1.000-fach durch TFF konzentriert worden war, und sequentielle Fraktionen wurden gesammelt. Unter Verwendung von MRPS wurde festgestellt, dass die Fraktionen 1-6 die meisten EVs enthielten (Abbildung 2A). Nachfolgende Fraktionen enthielten sehr wenige EVs, die anstelle von EV-freien Proteinen bestanden (Abbildung 2B). Elektrofahrzeuge hatten hauptsächlich einen Durchmesser von <100 nm (Abbildung 2C). TEM bestätigte die EV-Anreicherung und -Größe, insbesondere in den Fraktionen 2-6 (Abbildung 2D).

Um weiter sicherzustellen, dass die Methoden EVs von nicht-EV-assoziierten Proteinen trennen konnten, wurde ein rekombinanter Stamm von E. coli MP1 erzeugt, der ein Cytolysin-A-Nanoluciferase-Fusionsprotein und freies (nicht fusioniertes) mCherry exprimiert (schematisiert in Abbildung 3A). Es wurde zuvor gezeigt, dass Cytolysin-A-Fusionsproteine mit E. coli EVsassoziiert sind 14. Zur Überwachung der mCherry-Fluoreszenz wurden 100 μL Aliquots von jeder Chromatographiefraktion in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte übertragen. Ihre Fluoreszenz wurde in einem Mikrotiterplatten-Reader gemessen, wobei 580 nm bzw. 620 nm als Absorptions- bzw. Emissionswellenlängen verwendet wurden.

In ähnlicher Weise wurde für die Lumineszenzmessung ein 20-μL-Aliquot jeder Fraktion mit einem gleichen Volumen der Luciferase-Assay-Lösung in einer 384-Well-Platte gemischt, 15 min inkubiert und die Lumineszenz des sichtbaren Lichts gemessen. Es wurde beobachtet, dass EV-angereicherte Fraktionen (Fraktionen 2-7) eine hohe Nanoluciferase-Aktivität aufwiesen, die mit der späterer Fraktionen vergleichbar war, aber nur ein sehr niedriges Fluoreszenzsignal von nicht-EV-assoziierten mCherry (Abbildung 3B). Das Hintergrundsignal von einer gleichen Menge negativer Kontroll-EVs (isoliert aus einem übereinstimmenden Bakterienstamm ohne Nanoluciferase-Expression) war >1.000-fach niedriger in EV-Fraktionen. Das Signal der Positivkontrolle (ein Nanoluciferase-exprimierendes Bakterienzellpellet) war etwa 1.000-fach höher als das der EV-Fraktionen (nicht gezeigt). Letzteres wurde auf das anfängliche Volumen des Zellkulturmaterials normalisiert, das die analysierten Zellen bzw. EVs ergab. Die EV-Assoziation von Nanoluciferase wurde in den Fraktionen 2-5 durch Immunogold-Markierung bestätigt (Abbildung 3C), wobei die Markierung innerhalb der kleinen ~20 nm EVs beobachtet wurde.

Um schließlich die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf andere Bakterienarten zu beurteilen, wurden EVs aus ~100 ml Kulturen der folgenden verschiedenen anaeroben Bakterien isoliert: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron , B. breve und B. dentium , die in BHI-Kulturmedium hergestellt wurden. Als Kontrolle wurden EVs aus dem frischen BHI-Kulturmedium isoliert. Während die EV-Ausbeute je nach Spezies variierte, wurde erneut beobachtet, dass die frühen Chromatographiefraktionen 1-4 für EVs angereichert waren (Abbildung 4A). Das komplexe BHI-Medium enthielt auch EV-große Partikel, wenn auch bei <25% der gesamten EV-Ausbeute in diesen Präparaten (Abbildung 4A, schwarze Balken). Es wurde auch festgestellt, dass EVs dieser Bakterien hauptsächlich <100 nm groß sind (Abbildung 4B).

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative E. coli MP1 EV-Elution in frühen Chromatographiefraktionen. (A) Partikelzählung durch MRPS in sequentiellen 2-ml-Chromatographiefraktionen. Der SEC-Input betrug 2 L Bakterienkulturüberstand, der auf 2 ml konzentriert war. Durchgezogene Linie stellt den Mittelwert dar; Schattierter Bereich bezeichnet SEM. (B) Proteinkonzentration in jeder Fraktion. (C) Größenverteilung von EV der Fraktion 3, gemessen durch MRPS. Durchgezogene Linie stellt den Mittelwert dar; Der schattierte Bereich repräsentiert 95% CI. Beachten Sie, dass das Gerät Partikel <50 nm nicht quantifizieren kann. (D) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von sequentiellen, gepoolten Chromatographiefraktionen und frischem Kulturmedium (Kontrolle). Alle Bilder wurden im gleichen Maßstab (100 nm) aufgenommen. Weitfeld-TEM-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; MRPS = Microfluidics resistive pulse sensing; SEC = Größenausschlusschromatographie; REM = Standardfehler des Mittelwerts; CI = Konfidenzintervall. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Trennung von E. coli MP1 EVs aus EV-freien Proteinen durch SEC. (A) Schematische Darstellung von E. coli MP1, das rekombinante mCherry (rot) im Zytoplasma exprimiert und Periplasma-transportierendes Cytolysin-A-nanoLuciferase-Fusionsprotein (gelbe Diamanten). (B) NanoLuciferase-Biolumineszenzaktivität und mCherry-Fluoreszenz wurden in sequentiell eluierten Chromatographiefraktionen überwacht. Die vertikale gestrichelte Linie stellt die Grenze der EV-angereicherten Fraktionen basierend auf Analysen in Abbildung 2 dar. (C) EV-Fraktionen (F2-5) wurden nach Färbung mit Anti-NanoLuciferase-Antikörpern mit Immunogold markiert. Cyan-Pfeilspitzen deuten auf goldkonjugierte sekundäre Antikörper hin, die mit kleinen EVs kolokalisieren. Kontroll-EVs von Wildtyp E. coli MP1 hatten eine vernachlässigbare unspezifische Färbung. Beide Bilder wurden im gleichen Maßstab (100 nm) aufgenommen. Weitfeld-TEM-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; SEC = Größenausschlusschromatographie; F = Bruch; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; ClyA-nLuc = Cytolysin A-nanoLuciferase Fusionsprotein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten. Die angegebenen Arten wurden für 48 h in BHI-Medium unter anaeroben Bedingungen kultiviert. EVs wurden durch Ultrafiltration + SEC isoliert. (A) EV-Konzentration in den ersten 4 SEC-Fraktionen, gemessen durch MRPS. Mittelwert ± REM. Schwarze Balken stellen Partikel dar, die in einer Charge frischer BHI-Medien detektiert wurden (Kontrolle). (B) Größenverteilung von Elektrofahrzeugen in Fraktion 2. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; MRPS = Microfluidics resistive pulse sensing; SEC = Größenausschlusschromatographie; BHI = Hirnherzinfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: p114-mCherry-Clyluc-Plasmid. (A) Karte des p114-mCherry-Clyluc-Plasmids. (B) Sequenz der J23114-mCherry-clyA-nluc-Region. Violet, J23114 Promoter; Rosa, mCherry-Gen ; Graues, clyA-Gen ; Grün, Linker-Sequenz; Orange, nLuc-Gen . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Aufbauschema der Tangentialflussfiltration (TFF). Der Schlauch mit Stachelschläuchen wurde, wie gezeigt, mit dem TFF-Gerät verbunden. Der Zufuhrstromschlauch beginnt unter dem Eintauchen in das gefilterte, konditionierte Kulturmediumgefäß, setzt sich durch die Schlauchpumpe fort und wird mit dem TFF-Geräteeinlassanschluss verbunden. Der Rücklauf beginnt am TFF-Geräteauslass und endet oberhalb der Oberfläche des gefilterten, konditionierten Kulturmediums. Optional kann eine Gegendruckklemme (z. B. eine Schraubenmutter + Bolzen oder eine einfache Papierklemme) verwendet werden, um die Filtrationsrate zu erhöhen. Während die Pumpe das konditionierte Medium zirkulieren lässt, führt der entwickelte Druck innerhalb des TFF-Geräts zu einer Ultrafiltration und Entfernung von Komponenten <100 kDa durch den Filtrat-/Abfallstromschlauch, der in einem separaten Behälter zur Entsorgung (Magenta) gesammelt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Weitfeld-Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen. TEM-Bilder von sequentiellen, gepoolten Chromatographiefraktionen und frischem Kulturmedium (Kontrolle) in Abbildung 2D. Die Bilder zeigen, dass die extrazellulären E. coli MP1-Vesikel in frühen Chromatographiefraktionen eluieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Weitfeld-TEM-Bilder für Abbildung 3C. Die EV-Fraktionen (F2-5) wurden nach Färbung mit Anti-Nano-Luciferase-Antikörpern mit Immunogold markiert. Cyan-Pfeilspitzen deuten auf goldkonjugierte sekundäre Antikörper hin, die mit kleinen EVs kolokalisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Methode: Für rekombinanten E. coli MP1-Stamm mit p114-mCherryClyluc. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Im obigen Protokoll wird eine Methode beschrieben, die skalierbar ist und EVs zuverlässig von verschiedenen gramnegativen/positiven und aeroben/anaeroben Bakterien isoliert. Es hat mehrere potenzielle Haltepunkte während des gesamten Verfahrens, obwohl es besser ist, nicht länger als 48 Stunden zu benötigen, um EVs aus konditionierten Bakterienkulturmedien zu isolieren.

Erstens besteht es aus der Kultivierung von Bakterien, um ein konditioniertes Bakterienkulturmedium zu erzeugen. Es wurde festgestellt, dass die Erhöhung der Kulturzeit auf mindestens 48 h und die Verwendung des optimalen Wachstumsmediums dazu beiträgt, die EV-Ausbeute zu maximieren. Es ist wahrscheinlich, dass jede Bakterienart hinsichtlich dieser beiden Parameter optimiert werden muss. Das Volumen der Bakterienkultur ist ebenfalls wichtig, um sicherzustellen, dass genügend EVs für die gewünschte Anwendung isoliert werden. Für In-vitro-Studien werden die EVs typischerweise aus mindestens 100 ml isoliert, während für In-vivo-Studien EVs typischerweise aus >1 L Kulturmedium isoliert werden. Auch hier bestimmen die EV-Produktionseigenschaften jedes Bakterienstamms und die erforderliche EV-Menge für nachgeschaltete Assays das minimale Ausgangskulturvolumen.

Sobald ein konditioniertes Kulturmedium verfügbar ist, müssen Zellen und große Nicht-EV-Trümmer entfernt werden. Es wurde festgestellt, dass die Zentrifugation ein kritischer Schritt in diesem Prozess ist. Wie im obigen Protokoll erwähnt, wurden zwei zunehmende G-Kraft-Zentrifugationen durchgeführt. Gelegentlich werden zusätzliche 10.000 × g Zentrifugation durchgeführt, wenn festgestellt wurde, dass das Pellet des zweiten Spins nicht kompakt ist. Anschließend erfolgt die Sterilfiltration dieses Überstands durch einen 0,22 μm Filter. Eine unzureichende Zentrifugation führt zu Verstopfungen und schlechter Leistung dieses Filtrationsschritts. Es wurde festgestellt, dass die weitere Filterung des Überstands nach einer signifikanten Verlangsamung der Filtrationsrate zu einer Fehlfunktion des Filters und einer Kontamination des EV-Präparats mit den elterlichen Bakterien führen kann. Die Lösung für hartnäckiges Verstopfen des Filters besteht darin, den Überstand erneut zu zentrifugieren und/oder erneut zu filtern, um die Sterilität zu gewährleisten. Die beschriebenen zentrifugierenden und vakuumgetriebenen Filtrationsschritte wurden auf bis zu insgesamt 4 L Bakterienkultur getestet. Eine weitere Skalierung der EV-Isolierung kann Änderungen erfordern. Zum Beispiel könnten beide Schritte möglicherweise durch eine sequentielle pumpengetriebene Filtration mit kompatiblen Filtervorrichtungen mit abnehmender Porengröße von bis zu 0,22 μm ersetzt werden. Dies muss jedoch noch getestet werden.

Im aktuellen Protokoll werden zwei Varianten beschrieben, abhängig vom Startvolumen der Bakterienkultur. Verwenden Sie für Volumina <100 ml zentrifugale Ultrafiltrationsgeräte, um die Kulturmedien zu konzentrieren. Der MWCO ist bei diesen Schritten von entscheidender Bedeutung. Für Elektrofahrzeuge von Säugetieren wurden bisher >300 kDa MWCO11,12 verwendet. Dies führte jedoch zu sehr schlechten EV-Ausbeuten von Bakterien, vermutlich aufgrund der geringeren Größenverteilung. Daher wird empfohlen, 100 kDa MWCO zu verwenden. Ein kleineres MWCO kann ebenfalls verwendet werden, ist aber mit längeren Zentrifugationszeiten und weniger Entfernung von Verunreinigungen mit kleinem Molekulargewicht verbunden, wodurch die Probenviskosität erhöht wird. Es ist auch hilfreich, verschiedene Größen von Ultrafiltrationsgeräten bei 100 kDa MWCO zu haben, um verschiedene Startvolumina der Probe während des gesamten Protokolls zu konzentrieren.

Alternativ können Sie bei Probengrößen von deutlich >100 ml pumpengetriebenes TFF verwenden, um die Probe zu konzentrieren. Auch hier ist die Verwendung eines 100 kDa MWCO von entscheidender Bedeutung. Dieses Verfahren ermöglicht die halbautomatische Verarbeitung großer Mengen an Kulturmedium. Es ist wichtig, ein TFF-Gerät mit geeigneter Größe für das Ausgangskulturvolumen zu erhalten. Das verwendete Gerät ist vom Hersteller für die Verarbeitung von bis zu 200 mL Material ausgelegt. Es war möglich, bis zu ca. 2 L zu verarbeiten. Bei der Verarbeitung größerer Volumina wurde jedoch ein starker Abfall der Filtrationsrate beobachtet, so dass der Prozess gestoppt und das Gerät vor der weiteren Verarbeitung gereinigt werden musste. Daher bestimmen die Eigenschaften jeder Bakterienkultur und die Menge des Ausgangsmaterials die erforderliche Größe des TFF-Geräts. Darüber hinaus ist die erreichbare Pumpendrehzahl ein weiterer wichtiger Parameter für TFF. Bei niedrigen Raten von ~100 ml/min war es notwendig, den Gegendruck in der TFF-Vorrichtung mit einer Klemme zu erhöhen, wie in der ergänzenden Abbildung S2 angegeben, um die Filtration zu erleichtern, die die Foulingrate des Filters erhöht. Der Schlauch wurde nach entsprechender Dekontamination und Autoklavierung bis zu 2 Mal wiederverwendet.

Sobald die Probe konzentriert ist, kann sie auf eine SEC-Säule geladen werden, um die EVs zu isolieren. Es wurden kommerzielle Säulen verwendet, die für die Isolierung kleiner Elektrofahrzeuge optimiert sind. Verwenden Sie für kleine Ausgangsproben Säulen mit 0,5 ml Ladevolumen und für größere Ausgangsproben bis zu 2 l die Säulen mit 2 ml Ladevolumen. Es ist wahrscheinlich, dass die Verarbeitung von Ausgangskulturen >2 L größere Säulen erfordert. Hersteller von EV-optimierten Säulen bieten derzeit SEC-Säulen an, die >100 ml konzentriertes Material aufnehmen können.

Zur Charakterisierung der isolierten Elektrofahrzeuge werden verschiedene Methoden verwendet, von denen die meisten weit verbreitet sind. Die Normalisierung basierte bei den meisten Assays auf der Proteinkonzentration, da diese nicht durch die Unfähigkeit anderer Quantifizierungsmethoden (nämlich Partikelquantifizierung durch Technologien wie MRPS) beeinflusst wird, sehr kleine EVs <50 nm nachzuweisen. MRPS und andere Nanopartikel-Quantifizierungstechnologien sind nach wie vor nützlich für die relative Quantifizierung von Elektrofahrzeugen zwischen den verschiedenen Fraktionen.

Ein kritischer Aspekt der MRPS-Quantifizierung ist der Verdünnungsgrad. Bei entsprechender Verdünnung sollte die Häufigkeit der detektierten Elektrofahrzeuge in den meisten Fällen weiter bis zur Nachweisgrenze ansteigen, da das Gerät Partikel <50 nm nicht quantifizieren kann. Eine unzureichende Verdünnung führt zu einem hohen Instrumentenrauschen, das eine künstliche glockenförmige Kurve mit einem Spitzenwert >65 nm) erzeugt (bei Verwendung der empfohlenen C-300-Mikrofluidikkartusche). Während der Analyse der Größenhäufigkeitsverteilungsdaten wird trotz ausreichender Verdünnung manchmal noch ein artefaktischer Peak zwischen 50 nm (der absoluten Nachweisgrenze des Instruments) und 60 nm beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl sehr kleiner bakterieller EVs zurückzuführen (wie in TEM ( Abbildung 2D dargestellt), die unter der Grenze der genauen Detektion durch MRPS liegen und wiederum zu Instrumentenrauschen führen. In diesem Fall schließen Sie Datenpunkte aus, die kleiner als der beobachtete "Peak" sind, der de facto zur unteren Bestimmungsgrenze der gegebenen Stichprobe wird.

Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Quantifizierung der EV-Häufigkeit, der Gesamtproteinkonzentration und der Häufigkeit von Nicht-EV-Proteinen in den eluierten Chromatographiefraktionen den Anwendern bei der Entscheidung helfen, welche Fraktionen für nachgeschaltete Assays verwendet werden sollen. Zum Beispiel wurden kleine Elektrofahrzeuge in gepoolten Fraktionen 7-8 erkannt (Abbildung 2D); ihre Häufigkeit war jedoch geringer als in den unmittelbar vorhergehenden Fraktionen, während die Gesamtproteinkonzentration (Abbildung 2B) höher war. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Fraktionen 7-8 höhere Mengen an nicht-EV-assoziierten Proteinen enthalten und daher für bestimmte nachgeschaltete Anwendungen möglicherweise nicht wünschenswert sind.

Zusammenfassend wird hier ein vielseitiges EV-Isolationsprotokoll beschrieben, das auf kommerziell erhältlichen Materialien basiert. Die Bedeutung dieser Methodik im Vergleich zu weit verbreiteten Ultrazentrifugationsmethoden besteht darin, dass sie Schritte umfasst, die von verschiedenen Benutzern leicht reproduzierbar und hochgradig skalierbar sind. Dies ist besonders wichtig, um die Erzeugung von ausreichend Material für In-vivo-Studien zu erleichtern. Es wurde verwendet, um EVs aus Kulturen von 100 ml bis 2 l zu isolieren. Angesichts der großen Auswahl an verfügbaren TFF-Geräten ist es möglich, dass dieses Protokoll mit einigen Änderungen an größere Reinigungsvorgänge angepasst werden kann. Das beschriebene Isolationsprotokoll basiert in erster Linie auf den physikalischen Eigenschaften von EVs, nämlich ihrer Größe, und ist wahrscheinlich auf Bakterienarten anwendbar, die über die in dieser Studie beschriebenen hinausgehen.

Eine Einschränkung des beschriebenen Protokolls besteht darin, dass es die Isolierung kleiner Elektrofahrzeuge, insbesondere <100 nm, begünstigt, wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist. Frühere Berichte beschreiben auch das Vorhandensein größerer bakterieller EVs15,16. Die Isolierung größerer bakterieller EVs kann Änderungen des obigen Protokolls erfordern, z. B. durch die Verwendung von SEC-Säulen, die für größere EVs optimiert sind. Solche SEC-Säulen sind auch kommerziell erhältlich. Darüber hinaus können andere Protokolle wahrscheinlich eine höhere EV-Reinheit erreichen (z. B. Dichtegradienten-Ultrazentrifugation oder Immunisolierung). Diesen Methoden fehlt jedoch der Durchsatz und die Skalierbarkeit der in dieser Studie beschriebenen Methoden. Eine Änderung dieses Protokolls mit zusätzlichen Reinigungsschritten in der Zukunft kann die Ausbeute und Reinheit von Präparaten weiter erhöhen, was für experimentelle und therapeutische Anwendungen wichtig sein könnte.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Die oben beschriebene Forschung wurde durch NIH TL1 TR002549-03 Training Grant unterstützt. Wir danken Dr. John C. Tilton und Dr. Zachary Troyer (Case Western Reserve University) für die Erleichterung des Zugangs zum Partikelgrößenanalysegerät; Lew Brown (Spectradyne) für technische Unterstützung bei der Analyse der Partikelgrößenverteilungsdaten; Dr. David Putnam von der Cornell University für die Bereitstellung von pClyA-GFP-Plasmid14; und Dr. Mark Goulian von der University of Pennsylvania für die Bereitstellung des E. coli MP113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes Thermo Scientific 3430 it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron microscopy sciences 15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter Beckman Coulter 392077 Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila ATCC BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO) MilliporeSigma UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge Beckman Coulter No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 ATCC 29148
Bifidobacterium breve NCIMB B8807
Bifidobacterium dentium ATCC 27678
Brain Heart infusion (BHI) broth Himedia M2101 After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge Spectradyne
Chloramphenicol MP Biomedicals ICN19032105
Electron microscope FEI company Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) Takara 636763
Escherichia coli MP1 Dr. Mark Goulian (gift) commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter ThermoFisher 010-0151-05 used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor ThermoFisher F12-6x500-LEX fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper Electron microscopy sciences FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) Electron microscopy sciences 16100
Hematin ChemCruz 207729B Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader Tecan This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus Takara 638909 For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller Difco 244620
L-Cysteine Hydrochloride J.T. Baker 2071-05 It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-08 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-24 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm Masterflex HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor Masterflex EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft Cole Palmer EW-06435-16 low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3) MP 102259 Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK Repligen D04-E100-05-N TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System Promega N1110 This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 R&D Systems MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument Spectradyne
nCS1 Viewer Spectradyne Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer NEB M0482 DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes Eppendorf 30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix NEB M0492 DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm Izon maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack Izon for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm Izon maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer ThermoFisher Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit ThermoFisher Q33211 Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge ThermoFisher 75006580
SpectraMax i3x Microplate reader Molecular Devices This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) MilliporeSigma S2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		 One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate Electron microscopy sciences 22400
Vinyl anaerobic chamber Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES Sartorius VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) MilliporeSigma WHA68093002 to filter MRPS diluent

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References

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Biologie Ausgabe 176
Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus <em>Escherichia coli</em> und anderen Bakterien
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